Kỹ thuật điện di trong sinh học phân tử

Đây là một bước không thể thiếu trong các kỹ thuật như PCR Polymerase Chain Reaction, AFLP Amplified Fragment Length Polymorphism… 1 - Nguyên tắc điện di Kỹ thuật điện di được sử dụng n

CHƯƠNG III – KỸ THUẬT ĐIỆN DI

Phương pháp điện di là phương pháp rất phổ biến trong phân tích sinh hóa, được dùng trong phân tích nucleic acid và protein Kỹ thuật điện di rất có nhiều ứng dụng trong sinh học phân tử Đây là một bước không thể thiếu trong các kỹ thuật như PCR (Polymerase Chain Reaction), AFLP (Amplified Fragment Length Polymorphism)…

1 - Nguyên tắc điện di

Kỹ thuật điện di được sử dụng nhằm tách và so sánh kích thước của các phân tử protein, nucleic acid Sự so sánh này dựa trên tốc độ di chuyển của các phân tử trong môi trường điện di

Trong một điện trường, các phân tử tích điện thuộc pha lỏng sẽ di chuyển về phía các cực Vận tốc di chuyển của các phân tử này sẽ tùy thuộc sự tỷ lệ giữa điện tích và khối lượng của chính các phân tử này Như vậy giữa các phân tử có cùng khối lượng, phân tử nào có điện tích lớn hơn sẽ di chuyển về các cực ngược dấu nhanh hơn

Aùp dụng nguyên lý trên, trong kỹ thuật sinh hóa và sinh học phân tử, người

ta sử dụng kỹ thuật điện di nhằm phân tích protein hay phân tích nucleic acid

Điện di trong môi trường lỏng không có ý nghĩa trong thực tế Điện di thường được tiến hành trên những giá thể bán rắn gọi là các gel Các gel này là môi trường xốp với các lỗ nhỏ cho phép các phân tử protein hay nucleic acid đi qua Kích thước phân tử càng lớn thì sự di chuyển của phân tử qua gel càng chậm

Có hai loại gel được sử dụng chủ yếu trong điện di là gel agarose và gel polyacrylamide Việc chọn loại gel cũng như nồng độ các chất tạo thành gel tuỳ

thuộc kích thước của các phân tử cần tách

2 - Điện di trên gel polyacrylamide (PAGE)

+ Cho hiệu suất phân giải cao cho những nucleic acid và protein có kích thước nhỏ và trung bình (trọng lượng phân tử xấp xỉ đến 1.106 Da)

+ Cho phép phân tách khối lượng mẫu lớn

+ Giảm thiểu sự tương tác giữa phân tử di chuyển với chất nền

+ Tính hợp lý của chất nền

Kích thước lỗ gel thay đổi nhờ nồng độ của gel

Polyacrylamide được chuẩn bị bằng sự polymer hóa giữa acrylamide và N,

N` -methylen-bis-acrylamide Quá trình polymer hóa được kiểm soát bởi một chất xúc tác cảm ứng là –N-N, N`, N` tetramethylethylendiamin (TEMED) Quá trình quang hóa polymer hóa còn có thể được thúc đẩy bởi sự có mặt của tia UV Nồng độ gel tiêu chuẩn cho phân tích protein là 7.5% polyacrylamide Nó còn có thể phân tích phân tử có khối lượng dao động từ 10.000-1.000.000 Da Tuy nhiên hiệu

Hình II.1 – Điện di trên cột Hình II.2 – Điện di đứng

suất phân tích tốt đối với phân tử từ 30.000 -300.000 Da Hiệu suất phân giải và khoảng khối lượng phân tử của cấu tử phụ thuộc vào nồng độ của acrylamide và bis-acrylamide

Nồng độ gel thấp hơn sẽ cho lỗ gel lớn hơn, cho phép phân tích những phân tử sinh học có khối lượng lớn hơn Ngược lại nồng độ cao hơn của acrylamide sẽ cho lỗ gel nhỏ hơn

Điện di trên gel polyacrylamide có thể dùng cho điện di trên cột gel hay điện di trên bản gel

Nếu điện di trên cột

Ống thuỷ tinh (10cm6mm) được nạp đầy acrylamide; N, N` -methylen-bis-acrylamide, đệm và xúc tác Quá trình polymer hóa xảy ra từ 30-40 phút Cột gel được đặt vào trong một điện trường Đầu trên là catod và đầu dưới là anod Mẫu đem phân tích được nạp vào trên đầu cột, phía cực catod Mẫu sẽ được phân tách thành từng lớp trên gel, và dòng điện được đặt vào Một mẫu thuốc nhuộm dùng để đánh dấu đường đi của các cấu tử cũng được nạp vào và tốc độ di chuyển của nó song song với mẫu và nhanh hơn mẫu một chút Khi mẫu thuốc nhuộm đã di chuyển ra khỏi mẫu, tắt nguồn điện, gel được lấy ra khỏi cột và tiến hành nhuộâm mẫu

Một kiểu điện di của của gel polyacrylamide là điện di trên bản gel mà phổ biến nhất là bản gel đứng

Gel polyacrylamide được chuẩn bị và cho vào giữa hai miếng kính Khoảng cách giữa hai miếng kính phổ biến từ 0.5-2.0mm Bề mặt lớp gel có diện tích là 2040cm và có thể cùng một lúc phân tích nhiều mẫu Một lượt gel được đặt vào

ra ta sẽ có giếng gel dùng để nạp mẫu Một lượt có thể tạo ra cùng một lúc 20 giếng Nạp dung dịch mẫu vào giếng, cắm nguồn điện và bắt đầu điện di

Trong sinh học phân tử PAGE dùng để phân tích DNA có kích thước nhỏ.Thường từ 1-500 bp Bảng mức nồng độ gel khác nhau và khả năng phân tách:

Nồng độ polyacrylamide(%) Xếp thứ tự dsDNA (bp)

Bảng II.1- Thành phầøn phối hợp với gel polyacrylamide (pha 100ml)

Nồng độ

Tp

Acrylamide (g) 3.24 4.7 7.13 9.6 19.55 19.5

Dung dịch pha

stock (ml)

Amomium

persulphate

10% (ml)

Dung dịch pha stock 10X cho 1lít

Buffer

TBE: 108.0 Tris base; 55.0 g boric acid; 93.0 g EDTA, pH 8.2

TAE: 48.4 g Tris base; 11.4ml glacial acetic acid; 20ml EDTA 0.5, pH 7.6 TPE: 108.8 g Tris base, 15.5 ml phosphoric acid 85%; 40.0ml EDTA 0.5,

pH 8.0

PAGE được dùng rất nhiều trong phân tích

+ Phương pháp chuẩn bị gel polyacrylamide

1 Chuẩn bị số lượng gel cần, tuỳ theo kích thước khay đựng gel

2 Tính tóan số lượng phản ứng cần theo bảng

3 Hoà số lượng Acrylamide và Bis (chú ý mang găng tay vì hóa chất rất độc) vào nước buffer, thêm TEMED

4 Ngay tức khắc cho vào amonium persulphate

5 Đặt lược lên khay gel

6 30 phút sau lấy lượt ra khỏi gel và chuẩn bị cho chạy điện di

+ Phương pháp nạp mẫu

Trộn mẫu vào dung dịch nạp mẫu

Có thể sử dụng Bromophenol blue: 0.25

Glycerol 10% thể tích Tác dụng của Bromophenol blue: có màu xanh để thấy vạch điện di

Glycerol: có tỷ trọng lớn hơn nước, để mẫu chìm xuống giếng gel

3 - Điện di trên gel Sodium Dodecyl Sulfate - Polyacrylamide (SDS - PAGE)

Kỹ thuật điện di trước không có thể đo khối lượng phân tử của đại phân tử sinh học bởi vì nó phụ thuộc vào cả hai yếu tố là điện tích và kích thước phân tử Nếu có một phương pháp nào đó loại bỏ ảnh hưởng bởi điện tích của protein (một đại phân tử sinh học phổ biến) thì trong khi điện di, tốc độ di chuyển của các đại phân tử chỉ phụ thuộc vào kích thước phân tử Người ta thường dùng một chất tẩy mạnh để xử lý protein Trong phương pháp này các protein được phản ứng với chất hoạt động bề mặt mang điện tích âm là SDS (Sodium Dodecyl sulfate) để tạo một phức hợp mang điện tích âm và sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường Thêm vào đó một chất khử là mercaptoethanol hoặc dithireitol (DDT) để phá vỡ cầu nối –S-S- của protein (và các tiểu đơn vị của chúng) Nhờ đó sự di chuyển trong gel của các phân tử protein trong cùng một điều kiện chỉ phụ thuộc vào kích thước, những phân tử có kích thước lớn sẽ di chuyển chậm hơn những phân tử có kích thước nhỏ khi đi qua lỗ gel có kích thước nhất định

Trong thí nghiệm, protein chưa biết khối lượng và cấu trúc các tiểu đơn vị được xử lý vơi 1% SDS và 0.1M mercaptoethanol trong dung dịch điện di Một hỗn hợp protein chuẩn đã biết trước khối lượng phân tử cũng được cho chạy điện

di với cách xử lý và điều kiện như trên Hai bản chuẩn điện di, một bản ứng với những phân tử protein có khối lượng phân tử thấp (từ 14.000-100.000 Da), một bản ứng với những phân tử protein có khối lượng phân tử cao (45.000-200.000 Da)

SDS-PAGE thì hiệu quả trong xác định khối lượng phân tử của các phân tử protein đơn vị Là phương pháp điện di trên gel được dùng phổ biến nhất trong việc xác định kích cỡ và những thành phần khác nhau của một phân tử protein SDS-PAGE giới hạn xác định khối lượng phân tử từ 10.000-200.000 Da Gel có hàm lượng acrylamide nhỏ hơn 2.5% có thể dùng để điện di protein có khối lượng phân tử lớn hơn 200.000 Da Nếu protein có khối lượng phân tử trung bình người

ta thường dùng hỗn hợp giữa gel agarose và polyacrylamide

Hình II.3 – Phương pháp SDS -PAGE

Thực hành

Hoá chất và dụng cụ

+ Dụng cụ:

Bộ nguồn điện di, hộp điện

di, dụng cụ làm gel (tấm kính, lược, kẹp…) pipet, máy khuấy từ, máy hút chân không

Cấu tạo của một khung gel

Gel được chuẩn bị trong một khoảng hẹp được tạo thành bởi hai miếng kính, phân cách nhau bởi một tấm đệm bằng chất dẻo hoặc nguyên liệu thích hợp Miếng đệm dài hơn tấm kính khoảng1cm chiều rộng và độ dày khoảng 0.5mm Các giếng nơi mẫu cho vào được tạo thành từ một mẫu lượt chạy dài ngang đỉnh gel có cùng chiều dày với miếng đệm Các răng lược dài khoảng 1cm, rộng 2-10mm Khoảng cách giữa các răng 3mm

+ Hoá chất

1 Dung dịch Acrylamide hay dung dịch đơn hợp

Acrylamide (FW 71.08) :30g

Bis-acrylamide (FW 154.2) :0.8g

Cho nước đến 100ml Bảo quản ở nhiệt độ 4oC trong nơi tối Dung dịch này độc có khả năng gây ung thư cho nên phải mang găng tay khi làm thí nghiệm

2 Đệm gel phân tách (stocking separating gel) hay 4X đệm gel lỏng (1.5M Tris HCl , pH 8.8)

Hoà tan 3.36g Tris (FW 121.1) trong 15ml nước

Chỉnh pH 8.8 bằng HCl 4N

3 Đệm stacking gel

Hoà tan 1.5g Tris (FW 121.1) trong 20ml nước

Chỉnh pH 6.8 bằng HCl 4N

Thêm nước cho đủ 25ml Bảo quản nơi tối ở 4oC trong ba tháng

4 Dung dịch SDS 10% (có thể bảo quản trong 6 tháng)

5 Dung dịch amonium persulfate 10% (dùng trong ngày)

6 TEMED

7 Dung môi pha mẫu

Đệm stacking gel 2.5ml

Dẫn nước đến 10ml, bảo quản ở –20oC trong 6 tháng

8 Gel phủ lỏng (0.375M Tris –HCl, 0.1% SDS, pH 8.8)

Đệm stacking gel 25ml

Dẫn nước đến 100ml, bảo quản ở nhiệt độ 4oC ở nơi tối trong 3 tháng

9 Đệm điện di

Tris (FW 121.1) 3.028g

Glycine 14.413g

Dẫn nước đến 1000ml Dung dịch không cần kiểm tra lại pH, bảo quản trên một tháng ở nhiệt độ phòng

10 n-butanol bão hoà nước

11 Dung dịch nhuộm protein

Coomassale blue G-250 0.6g

Thêm nước cho đủ 1000ml Dung dịch chứa trong hai có màu, bảo quản ở nhiệt độ phòng

12 Dung dịch rửa màu

Acetic acid 70ml

13 Dung dịch cố định màu nhanh

Isopropanol 250ml

Acetic acid 100ml

Thêm nước cho đủ 1000ml

Tiến trình thực hiện theo các bước

+ Bước 1: Chuẩn bị mẫu

Mẫu khô hoặc dung dịch được hoà tan trực tiếp trong dung môi pha mẫu sao cho có nồng độ 0.5-1.5mg protein/ml Đun sôi cách thuỷ trong 5 phút Để nguội

+ Bước 2: Chuẩn bị gel để chạy điện di

Trước hết ta cần biết chiều dài, chiều rộng hay chiều dày của khung gel để có thể tính được thể tích gel cần pha chế để tránh lãng phí

Giả sử cần thiết điều chế 30ml dung dịch gel để điện di, phải cần các dung dịch gốc theo tỷ lệ sau

Bảng II.2 - Pha chế hỗn hợp gel điện di

Lắc nhẹ cho tan hết

+ Bước 3: cho gel điện di vào khuôn đúc gel

Cho gel đặc vào khuôn đúc gel, cho đến khi cách răng lược khoảng 3-5mm Đổ trên mặt của gel đặc 300 l n-butanol bão hòa để tránh hiện tượng oxy hóa làm ngăn cản sự polymer hóa của gel

Sau 1-2 giờ, sau khi gel đã polymer hóa xong và đông đặc lại, nghiêng đổ n-butanol ra ngoài, tráng ngay lại bằng dung dịch phủ gel lỏng (khoảng 0.3ml)

Thêm vào 0.5ml dung dịch phủ lỏng để cố định gel

+ Bước 4: Chuẩn bị gel stacking

Để có 10ml dung dịch gel stacking, tiến hành như sau:

Dung dịch acrylamide 1.32ml

Khuấy từ và hút chân không để loại bọt khí

Amonium persulfate 50.1ml

Lắc nhẹ và cho tan hết

+ Bước 5: Điện di

Cho dung dịch phủ trên gel điện di và cho 0.5ml gel stacking vừa điều chế xong để tráng bề mặt của gel Đổ bỏ

Cho đầy gel stacking vào và đặt lược vào để tạo thành các giếng Chú ý không để tạo các bọt khí Để gel cố định ít nhất trong 60 phút

Cho vào một erlen có nhánh nối với một máy hút chân không Vừa

hút vừa khuấy bằng máy khuấy từ cho đến khi hết bọt khí

Nhẹ nhàng lấy lược ra khỏi gel, tránh làm hỏng các vách ngăn cách Tráng lại giếng bằng dung dịch điện di Bơm 5-10l có nồng độ khoảng 1g/l mẫu đã được xử lý bằng dung dịch pha mẫu vào giếng Đóng điện và tiến hành điện di

+ Bước 6: Nhuộm và đọc kết quả

Đặt gel trong dung dịch cố định màu nhanh trong 30 phút, thỉnh thoảng lắc nhẹ

Chuyển gel qua dung dịch nhuộm protein trong vài giờ, thỉnh thoảng lắc nhẹ đến khi nào vạch màu hiện lên

Cuối cùng cho gel vào dung dịch tẩy màu, dung dịch này được thay hai lần trong một ngày đến khi này gel trong

Gel hoàn tất có thể được bảo quản trong acetic acid 7% hoặc trong nước

4 - Điện di trên gel agarose

Những kỹ thuật điện di được nghiên cứu ở trên đây chủ yếu dùng để phân tích protein và những nucleic acid nhỏ, có khối lượng phân tử tới 350.000 Da (500bp) Tuy nhiên, những lỗ nhỏ trong gel thì không có thể phân tích được những cấu phần nucleic acid có khối lượng phân tử cao hơn Phương pháp chuẩn dùng để phân tích RNA và DNA có số nucleic từ 200-50.000 bp là điên di với gel agarose với nồng độ trung bình

Hình II.4: Cấu trúc agarose (theo Nông Văn Hải 2002)

Agarose là một hợp chất được chiết xuất từ tảo biển, là một loại polymer mạch thẳng của galactose pyranose Gel được chuẩn bị bằng cách hòa tan agarose trong dung dịch điên di có nhiệt độ ấm Sau đó làm ấm hỗn hợp gel đến 50oC, hỗn hợp gel được đổ giữa hai tấm kính, tương tự như trong cách đổ gel polyacrylamide

Hình II.5 Các bước tạo gel điện di agarose 1,2 Tạo khuôn-3 Đổ gel vào khuôn-4 lắp lược, tra mẫu-5 chạy điện di

Mẫu được đặt vào giếng gel (tạo ra bởi lược gel) và điện áp được đặt vào hai đầu

Gel agarose được đỗ lên một giá thể nằm ngang Điện di được thực hiện theo phương ngang

Các nucleic acid trong gel agarose sẽ được hiện hình dưới tia tử ngoại nhờ một hóa chất có tên là ethidium bromide Chất này có chức năng gắn xen vào giữa các base của nucleic acid và dưới tác dụng của tia tử ngoại sẽ phát huỳnh quang Trong thao tác, ethidium bromide được cho vào gel trước khi đổ Sau điện

di gel được chiếu bằng tia tử ngoại (bước sóng 300nm) Nuleic acid sẽ hiện hình dưới các vệt màu đỏ cam

Mặt khác, để ước lượng kích thước các trình tự nucleic acid trong gel agarose Người ta sử dụng một “yếu tố đánh dấu trọng lượng phân tử” Đó là một tập hợp nhiều trình tự DNA có kích thước đã biết (thang DNA), thông thường người ta sử dụng thang DNA là thực khuẩn thể  được thuỷ giải bởi enzyme cắt giới hạn Hind III

Một hệ thống điện di mới Instacry, được giới thiệu bởi Eastman Kodak, gần như có thể được thay thế cho agarose gel Instacryl H Copolymer, là một loại polymer có sự hiện diện của dithioreitol Nồng độ gel từ 3-6% có thể được dùng để phân tách DNA mạch đôi từ 10-3500bp

5 - Điện di trong điện trường xung

Trong lý thuyết, điện di trên gel agarose được dùng để phân tích nucleic acid có trình tự nhỏ hơn 50.000bp Trong thực tế, chúng chỉ có thể phân tích tốt trong giới hạn 20.000-30.000bp Và những DNA có kích thước lớn hơn 50kb thì quá lớn để có thể chui qua lỗ gel Từ lúc DNA ribosome của đa số các sinh vật có kích thước lên đến hàng ngàn đến hàng triệu bp DNA muốn điện di được phải cắt ngắn bằng enzyme cắt giới hạn và sau đó được phân tách bằng điện di thông thường Trong những năm đầu những năm 1980, Schawarts và Cantor tại đại học Columbia (Mỹ), đã phát hiện rằng những DNA có kích thước phân tử lớn (như nhân nấm men- kích thước từ 200-3000kb) có thể phân tách bằng điện di trong điện trường xung (PFGE) Phương pháp này về cơ bản giống như trong điện di thông thường Trong điện di trong điện trường xung, hướng của điện trường không phải cố định như phương pháp thông thường và được thay đổi theo chu kỳ, cả lực điện trường cũng được thay đổi Mỗi lần hướng của điện trường thay đổi thì phân tử DNA phải tự định hướng lại Thời gian cho việc tự định hướng này phụ thuộc kích thước của phân tử Phân tử càng dài thì thời gian tự định hướng càng lớn khiến nó di chuyển chậm hơn một phân tử có kích thước nhỏ

Mặc dù theo lý thuyết, PFGE được sử dụng ít, nhưng trong thực tế nó được áp dụng rất nhiều PFGE đã thay đổi rất lớn kỹ thuật nghiên cưú DNA Những DNA có trọng lượng phân tử trung bình, được cô lập khỏi tế bào dưới sự hiện diện của lysozyme, chất tẩy và EDTA có kích thước phân tử khoảng 400-500kb được phân tách tốt bởi kỹ thuật điện di trong điện trường xung

Có nhiều thiết bị được phát triển để thay đổi thiết kế thí nghiệm của PFGE Một vài yếu tố có thể bị thay đổi trong mỗi thí nghiệm như hiệu điện thế, số lượng điện cực, chu kỳ thay đổi hướng điện trường, thiết kế hộp gel, nhiệt độ, nồng độ agarose, pH của dung dịch điện di, thời gian điện di