1. Trang chủ
  2. » Khoa Học Tự Nhiên

Thực hành hóa sinh học Nguyễn Văn Mùi (Phần 2)

104 1,1K 8

Đang tải... (xem toàn văn)

Tài liệu hạn chế xem trước, để xem đầy đủ mời bạn chọn Tải xuống

THÔNG TIN TÀI LIỆU

Thông tin cơ bản

Định dạng
Số trang 104
Dung lượng 13,83 MB

Nội dung

Chương 1: Hóa chất và dung dịch Chương 2: Phương pháp lấy mẫu phân tích (lấy mẫu, chuẩn bị mẫu, cố định mẫu)Chương 3: Phương pháp so màuChương 4: Phương pháp quang phổ kếChương 5: Định lượng gluxitChương 6: Định lượng LipitChương 7: Định lượng acid amin và proteinChương 8: Định lượng axit nucleicChương 9: Xác định hoạt độ của một số enzymeChương 10: Định lượng vitaminChương 11: Định lượng một số nguyên tố

Trang 1

Chương 7ĐỊNH LUỢNG AXIT AMIN VÀ PROTEIN

I ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p CHUẨN đ ộ PORMOL (PHƯƠNG PHÁP SỒRENSEN)

1 Nguyên tắc

Axit amm hoà ta n trong nưốc có tính chất muối nội phân tử, các nhóm amin và cacboxyl trung hoà lẫn nhau Nhóm -COO của axit amũi bị cản trỏ bởi các nhóm amin nên không thể chuẩn độ trực tiếp được Trong fomanđehit, nhóm amin của axit amm phản ứng vổi nhóm anđehit cho metylen, kết quả của phản ứng là nhóm amm mất tính chất cơ bản của nó, ngược lại nhóm cacboxyl trong axit amin tồn tại dạng metylen không bị cản trở và có thể chuẩn độ

Sô' nhóm cacboxyl tự do bằng sô' nhóm amm liên kết với íomanđehit, khi chuẩn độ nhóm cacboxyl thì xác định đưđc nhóm amin Vì vậy cho phép định lượng được axit amũi có trong dung dịch nghiên cứu

Trang 2

- Dung dịch HCl 0,1N

- Dung dịch fomanđehit tnm g hoà 30%: Lấy 50ml íomanđehit 30% cho thêmo.lml phenolphtalein trong etanol 1% và chủih bằng NaOH 0,1N đến khi xuất hiện màu vàng nhạt

- Dung dịch tymolphtalein 0,1% trong etanol 90%

- Dung dịch KOH 0,01N trong etanol 90%

- Cồn tuyệt đối

- Dung dịch CuCl2 amoniac 0,0025M

- Dung dịch phenolphtaleũi 1% trong etanol 60%

6 T ính k ế t q u ả

Iml dung dịch NaOH 0,1N tưdng đưdng l,4mg nitơ Sô' mg nitđ amin của dung dịch nghiên cứu được tứih theo công thức:

mgN = (A - B) X 1,4Trong đó: A - Sô' ml NaOH 0,1N dừng để chuẩn độ bình thí nghiệm,

B - Sô' ml NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra

Phương pháp chuẩn độ formol các axit amm trực tiếp và thuận lợi Nó đưỢc sử dụng để định lượng axit amũi trong dung dịch nghiên cứu Đồng thời cũng cần nhổrằng phưđng pháp này không cho kết quả hoàn toàn chửih xác giá trị nitơ amin, vìnếu trong dimg dịch có prolin, nó sẽ liên kết không bền vối fomanđehit nên ỉàm giảm kết quả định lượng Ngược lại nếu dung dịch nghiên cứu có tữozin, nó lại làm tăng kết quả định lượng vì nó có nhóm phenol Phưdng pháp định lượng bằng chuẩn độ íormol

Trang 3

không thể sử dụng vối mẫu có muối amoni, vì formalm sẽ cho hexamm, đồng thời giải phóng ra axỉt.

4NH^C1 + 6HCH0 > N4(CH2)g + 6H2O + 4HC1Nhóm cacboxyl của các axit amin lưõng tính, các peptit lỏn và protein có thể đưỢc xác định bằng kỹ thuật chuẩn độ trong dung dịch nước - etanol không có formalũi Môi trưồng nưốc - etanol gây cản trỏ sự phân ly nhóm atnin, kết quả là nó trơ trong môi trường nước, axit amm trồ thành axit, nhóm cacboxyl của axit amữi có thể được chuẩn

độ lại bằng kiềm Với đặc tính cđ bản này, có thể định lượng axit amin bằng phưdng pháp micro:

Lấy 2ml dung dịch chứa axit amin, cho thêm 2 giọt dung dịch tymolphtalem 0,1% trong etanoỉ 90% và chuẩn độ bằng KOH 0,0 IN trong etanol 90% đến khi xuất hiện màu xanh Sau đó cho thêm 10 thể tích cồn tuyệt đô'i vào 1 thể tích dung dịch cần định ỉượng axit amm Màu dung dịch biến mất, chuẩn độ lại dung dịch cho đến màu xanh Mầu để so sánh vối màu chuẩn độ có thể sử dụng dung dịch amoniac CuClg 0.0025M Phương pháp này đặc biệt dùng cho nghiên cứu quá trình động học enzim, biểu diễn dưối ảnh hưỏng tác động lên các enzim proteolitic protein và peptit

II Đ Ị N H L Ư Ợ N G A X IT A M IN B Ằ N G N IN H IĐ R IN

1 N ^ y ê n tắc

Dưới tác dụng của ninhiđrũi, axit amin bị oxi hoá chuyển thành axit amm rồi đến amoniac và cacbonic Axit amin bị giảm bốt 1 nguyên tử cacbon, nó trỏ thành dạng anđehit Như vậy axit amin có khốỉ ỉượng phân tử nhỏ hơn và amoniac tạo thành sẽ oxi hoá ninhịcừm tạo nên phức hỢp có màụ xanh tím, cưòng độ màu tưdng ứng vói giá

trị nitd amin của axit atnin Phản ứng của axỉt amin vổi nứihiđrin là cđ số để định

lượng các hỢp chất theo phưđng pháp khí kế bằng cách tính sô' lượng CO2 hoặc NH3 bay ra, còn phươi^ pháp so màu lại đo cưòng độ màu, nó phụ thuộc nồng độ phức hợp của ninhiđrin vối NH3

Phản ứng màu ninhiđrin cũng xảy ra vói axit amin mạch bên của peptit vi protein cũng như với muối amoni, glucozamin và amoniac Để định lượng chính xác axit amin, dxmg địch nghiên cứu phải không có hỢp chất trên

Trang 4

2 Lắc đều õhg nghiệm và đật vào nồi ủ nhiệt đ\m sôi 30 phút.

3 Cho thêm etanol 50% vào đến lOml Đo giá trị hấp thụ ỏ 570nm Chỉnh máy vể không với ông kiểm tra có đủ các hoá chất nhiíng thay dimg dịch axit amin bằng nưốc cất cùng thể tích Giá trị hấp thụ nhận được tương ứng vối độ hấp thụ cùa dung dịch chuẩn leuxữi đă biết nồng độ (cưòng độ màu trong phản ứng ninhỉđrin tưđng ứng với cường độ màu của dimg dịch chuẩn leuxữi)

Trang 5

4 Đường chuẩn leuxin: lấy Iml của các dung dịch chuẩn leuxin có từ 1 - 5^g cho vào các ốhg nghiệm Làm phản ứng với các hoá chất trên và đo hấp thụ.

Phương pháp ninliiArm rất nhạy và chính xác, nó đưỢc sử dụng nhiều để định

lượng axit amin tách ra bằng phưđng pháp sắc ký giấy hoặc sắc ký cột Nó cũng được

dùng để định lượng axit amũi của các peptit và proteũi thuỷ phân bằng hoá học hoặc

enzim

*Chú ý: Đinh ỉượng chính xác axit amin bằng phương pháp dùng ninhiđrin phụ

thuộc vào sự loại bỏ chất chứa NH.ị và các hoá chất sử dụng cũng phải không có NH 3

III ĐỊNH LƯỢNG AXIT AMIN NHỜ TẠO THÀNH PHỨC CHAT VỚI ĐồNG

(Phương pháp Pope và Stevens)

1 Nguyên tắc

Để định lượng axit amin của dung dịch nghiên cứu cần cho thêm vào môi trường

bazđ yếu dung dịch đồng photphat dư trong dung dịch đệm borat Muôi đồng của axit

amũi hoà tan tốt trong dvuig dịch Đồng photphat dư được loại bỏ bằng cách lọc, sau đó

cho thêm CH3COOH và KI Xác định lượng đồng bằng cách chuẩn độ vối dung dịch

Na2S2 0 3, iôt được tách ra, phản ứng xảy ra như sau:

2Cu^^ + 41" 2CuI + I2

Ịon r trong môi trường axit khử ion đồng của phức chất liên kết với axit amin và

bị oxi hoá thành Ỉ2- Từ kết quả của phUdng trình trên ta thấy ỉ ion iôt khử 1 ion đồng

tạo nên sự liên kết của phức chất vối 2 gốc axit amỉn 1 ion iôt "nốỉ" nhóm amữi của

axit amm Iml dxuig dịch Na2S20 3 0,01N tưởng ứng vối 0,28mg nitơ amin

2 Nguyên liệu

Dimg dịch chứa axit amm hoặc dung dịch protein thuỷ phân đã trung hoà chứa

0,5 Ỷ l,Omg nitđ amũi trong Iml

Dung dịch C: Dung dịch đệm borat: 57,21g borat (Na2B4P7.10ĩỈ20) hoà tan

trong lõOOml nưổc, cho thêm lOOml HCl IN và dẫn nưốc đến 2000ml

Trang 6

- D u n g d ịc h ty m o lp h ta le m ; 0 ,2 5 g ty m o lp h ta le in hoà ta n tro n g lOOml d u n g dịchetanol 50%.

- D u n g d ịc h N a2S203 0 ,0 1 N (được p h a loãng từ du n g dịch gốc 0 ,1 N đ ã được c h ỉn h bới KIO3)

2 Cho nưóc vào bình đến 25ml và lắc kỹ Kết tủa (đồng photphat dư) được li

tà m hoặc lọc qua giấy lọc.

3 L ấ y 5 -lO m l d ịch li tâ m (hoặc dịch lọc) cho vào cốc, cho th ê m 0 ,5 m l

B - Sô ml Na2S2 0 3 dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,0,28 - Iml Na2S2 0 3 0,01N tương ứng 0,25mg nitđ

*Chú ý: Khi sử dụng phương pháp này phải loại bỏ cẩn thận đồng photphat dư

trong dung dịch nghiên cứu, vì nó sẽ làm tăng kết quả chuẩn độ ưu điểm của phương pháp này là có thể định lượng nitd amin của axit amin khi có 1 lượng nhỏ amoniac và ngay cả 1 lượng lớn ure Vì vậy có thể sử dụng phưđng pháp này để địiứỉ lưdng axit amin trong nước tiểu.

Trang 7

IV ĐỊNH LƯỢNG NITƠ BẢNG PHƯƠNG PHẢP KJELDAHL

ỉ Nguyên tắc

Tất cả các dạng nitđ có trong cơ thể hay trong các mô đưỢc gọi là nitơ tổng sô Nitơ

có trong thành phần axit amũi của proteũi là nitơ proteừi Nitơ không có trong thành phần protein như của các muối vô cờ, axit nitric, các axit amin tự do, các peptit, ure và các dẫn xuất của ure, các ancaloit, các bazơ purin và pyrimiđin là nitơ phi proteứi v.v

Nitd tổng số = Nitd protein + Nitđ phi protein

Tníốc tiên mẫu được vô cđ hoá bằng H2SO4 đặc ở nhiệt độ cao và có chất xúc tác Các phản ứng của quá trình vô cơ hoá xảy ra như sau:

2H2SO4 -> 2H2O + 2S0 2t + O2

Oxi tạo thành trong phản ứng lại oxi hoá các nguyên tô' khác Các phân tử chứa nitđ dưổi tác dụng của H2SO4 tạo thành NH3 Ví dụ các protein bị thuỷ phân thành axit amin, cacbon và hiđro của axit amin tạo thành CO2 và H2O, còn nitđ được giải phóng dưới dạng NH3, kết hỢp vối H2SO4 dư tạo thành (NH4)2S04 tan trong dung dịch

a) Vô cơ hoá ngìuyén liệu

1 Cân Ig mẫu ttaơi hoặc 0 ,1 - 0,3g mẵu khô đã đưdc nghiền nhỏ (dùng một ông giấy cân cuộn tròn) Choi cẵỈn thận vào đáy bmh Kjeldahl dimg tích 50ml

2 Cho thêm 5 - lữnsl H2SO4 đặc (d=l,84) Nếu mẫu là bột khô, trước khi cho thêm axit cần cho vài giọt mưềc cất không có nitớ để thấm ưốt bột Nếu mẫu lỏng như nưóc mắm, xì dầu, dừng pipelt lấy 2 - 5ml, côn nước quả hộp lấy 10 - 20ml Khi cho mẫu vào bình, không đưđc để rmẫu dính bám cổ bình

Trang 8

3 Đậy bằng nút lỏng thụỷ tinh quả hổng hoặc nút thuỷ tinh lọ nhồ giọt LÁc nhẹ bình rồi đặt lên bếp cách cát đtm nhẹ khoảng 30 - 40 phứt, sau đó nhấc bình ra,

đế nguội

4 Cho vài giọt xúc tác axit percloric (hoặc HClOg hoặc H2O2 30%, chỉ cho ồ giai đoạn cuối dung dịch đã có màu vàng sẫm) hoặc hỗn hợp K2SO4 và CuSO^ vối tỉ lệ 3:1, cho một lần ngay từ đầu (lưỢng hỗn hợp chất xúc tác bằng lượng mẫu tươi dùng để vô Ctí hoá), tiếp tục đốt trên bếp khoảng 30 phút nữa Dung dịch sẽ chuyển từ màu đen sang màu cánh dán Nhắc bình ra khỏi bếp, để nguội

5 Cho thêm chất xúc tác lần thứ hai (vài giọt axit percloric), tiếp tục đốt cho đến khi dung dịch trong bình không màu Để nguội

6 Chuyển dung dịch sang bình định mức 50 hoặc lOOml, tráng bừửi Kjeỉdahỉ vài lần bằng nước cất không có nitđ và dẫn đến thể tích định mức bằng nưốc cất không cónitd

• Tiến hành:

1 Rửa bộ chtíng cất Kjeldahl kỹ bằng nước cất không có nitđ Lấy 10 - 20ml (tuỳ theo hàm lượng nitơ có trong mẫu) đă vô cơ boấ cho vào bình phản ứng (c) qua phễu (e)

2 Cho một vài giọt thuôc thử hỗn hđp vào bình phản ứng nếu dừng xúc tác bằng axit HCIO3 hoặc H2O2

Trang 9

3 Cho vào bình hứng 20ml dung dịch H ịBO , 3%, thêm vài giọt chỉ thịTashừo.

4 Ehm sôi nưỏc trong hìnli ctôt (a) đồng thời cho nưốc từ vòi q u a ông là m lạ n h (d;.

5 Cho qua phễu (e) vào bình phản ứng (c) 30ml NaOH 40%

6 Mồ khoá cho kiềni chay vào bình đến khi dung dịch trong bình phản ứng đổi màu thi đóng khoá lại

7 Đun bình đô't NH;j đuọc bay lên cùng với nước qua ông làm lạnh sang bình hứng và tác dụng với H.^BOị tạo thành muôi amon tetraborat [(NH4).2B4 0 7] Quá trình cất được tiến hành 30 - 40 phút, ỉíiểm tra NH;, đả hết chưa bằng cách hạ thấp bình hứng và thử bằng mẩu giây đo pH vào đầu ông làm lạnh Khi NH.^ đã đưỢc cát

hoàn toàn, hạ bình hứng xuông, dùng tia nưốc cất nhỏ tráng sạch axit dính đẩu ông ỉàm lạnh.

8 Định lưỢng amon tetraborat[(NH4)2B,ị0 7] tạo thành bằng dung dịch H2SO4

0,1N cho đến khi xuâ't hiện màu hồng nhạt, phản ứng xảy ra như sau:

+ H.^SO^ + õHỵO (NH,,)^SO^ + 4H3BO;,

• Tính kết quả:

Hàm lưdng nitơ tổng sô' có trong mẫu:

M 0/ _ V X 1,42 X 100Nmg% = - -

wTrong đó: V- sô' ml H26O4 0,1N chuẩn độ,

1,42 - số mg nitơ ứng vối Iml H2SO4 0,1N,

Trang 11

-Thuốc thử Nessler: phát hiện sư có mặt nitđ trong dung dịch Cách pha chẻ:

+ Cách 1: lõg Hgl.,; lOg KI hoà vào 15ml nước cất, thêm 80ml dung dịch NaOH 50% dẫn thể tích đến 500ml bằng nưốc cất (không có nitđ và cacbonic)

+ Cách 2: - 35g KI hoà tan trong lOOml nưốc cất nóng

- 17g HgClj hoà tan trong 300ml nưốc cất

- NaOH hoặc KOH 20%

Đổ dung dịch HgCl2 vào dung dịch KI đến khi kết tủa đỏ của Hgl^ tạo thành không thấy tan nữa thì dừng lại Sau đó dùng dung dịch kiềm 20%

dẫn đến 1 lít Lại thêm 5ml dung dịch HgCl2 đến khi có kết tủa đỏ xuất

hiện Đe dung dịch lắng đến khi hoàn toàn trong Bảo quản trong lọ màu, đậy bằng nút cao su

• Tiến hành:

Quá trình định lượng được tiến hành như trên nhưng ở bình hứng cho một lượng H2SO4 0,1N (sao cho ngập đầu ống làm lạnh) và vài giọt thuốc thử hỗn hdp Theo dõi bình húng, nếu thấy dung dịch biến đổi từ màu vàng sang màu lá mạ thì cho thêm 5ml HgSO^ 0,lN nữa vào bình hứng, cần làm nhanh để tránh mất nitd

Đun sôi khoảng 30 phút, quan sát cột nưổc ở đầu ống làm lạnh không chuyển

từ mầu hồng sang xanh là đưỢc Muôn chắc chắn, lấy nưốc đầu ống làm lạnh thử vói thuốc thử Nessler, lấy bìmh hứng ra và chuẩn độ axit dư bằng kiềm 0,1N

- sôT ml NaOH dùng để chuẩn độ axit dư trong bình hứng,

f - hệ ísố điều chỉnh nồng độ H2SO4 ở bình hứng, f = 1 khi nồng độ

Trang 12

' Thời gian đốt mẫu kéo dài 3 - 4 giờ phụ thuộc vào lượng mẫu, nguồn nhiệt và chất xúc tác Nếu dùng CUSO4 vối lượng lớn (1 - 2g) thì thòi gian vô cơ hoá mẫu khoảng 2 - 3,5 giò Khi dùng H2O2 (4 - 5ml) mất 40 - 50 phút Dùng selen (0,1 g/lg mẫu thực vật) thòi gian khoảng 30 - 40 phút Dừng hỗn hỢp xúc tác K2SO4: CUSO4: Se (100:10:1) vói tỉ lệ 4 g/lg mẫu, thòi gian khoảng 50 - 60 phút.

d) Báo cáo th i nghiệm

1 Viết phản ứng xảy ra ở bình phản ứng và bình hứng

2 Xác định hàm lưỢng nitơ tổng sô' ồ một mẫu thí nghiệm

V ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p L0WRY

1 Nguyên tắc

Có thể tính hàm lượng protein của mẫu nghiên cứu dựa vào đường chuẩn của protem và dựa vào phản ứng màu của protein với thuốc thử Folin Cường độ màu của dung dịch tỉ lệ thuận vói nồng độ proteũi

2 H oáchất

- Dung dịch protem chuẩn có 10 - 100 Jig proteừi trong Iml

- Proteũi được hoà tan trong dung dịch NaCl 0,9% với ỉượng protein trong Iml có

10, 2 0, 30, 40, 80, 1 0 0 protein Dung dịch chuẩn thường dừng tiiứi thể albumm huyết thanh bò (BSA - bovine serum albumin)

- Dung dịch A; Dtmg dịch Na2C0 a 2% trong NaOH 0,1N

- Dung dịch B l va B2:

+ BI - Dung dịch CUSO4 1%

+ B2 - Dung dịch muốỉ Seignett 2% (Kali natri tactarat)

- Diưig dịch C: Hỗn hợp 0,5ml dung dịch Bl, 0,5ml dung dịch B2 và 50ml dvmg dịch A (dung dịch c chuẩn bị trưổc khi dừng 30 phút)

- Dung dịch D; Dun^ dịch Folin có nồng độ IN

Cách pha dung dịch Folin: Cho vào bình cầu đáy tròn nút nhám 700ml

nước cất, lOOg natríwonframat (NaW0 4.2IỈ2 0) và 25g natri molypđat (NaMo0 4.2IỈ2 0) Thêm 50ml axit photphoric (H3PO4) 85% và lOOml HCl đậm đặc Đun sôi hỗn hđp trong bình cầu đáy tròn dimg tích 2 lít có ông làm lạnh hồi lưu trong 10 giò Sau đó cho thêm 150g liti simfat (LÌ2SO4.H2O), õOml nước cất và 5 giọt brom Tiêp tục đvin sôi 15 phút không có ông làm lạnh hồi lưu để đuổi lượng brom thừa Dung dịch phải có màu vàng Nếu dimg dịch có màu xanh thì phải xử lý với brom lần thứ 2 sau khi làm nguội dimg dịch,

Trang 13

thêm nước cất đến 1 lít (bình định mức) Xác định nồng độ thuốc thử Folm bằng cách chuẩn độ với dung dịch NaOH IN có chỉ thị phenolphtalein Dung dịch gốc có nồng độ IN (để chuẩn độ chính xác thường pha loãng dung dịch gốc 1 0 lần và chuẩn vổi dung dịch NaOH IN).

Bảo quản dimg dịcli Folm trong lọ thuỷ tinh màu, cất giữ ò nơi lạnh Sau 2 - 3

tháng dimg dịch chuvển màu xanh lại thêm vài giọt brom và đun sôi 15 phút, dung dịch lại có màu vàng trở lại Trưổc khi dùng phải pha loãng thuốc thử bằng nưóc cất đến nổng độ 0,5N

5 Báo cáo thí nghiệm

1- L4p đồ th ị chuẩn protein

2- Định ỉượng một mẫu protein dựa vào đồ thị chuẩn protein

VI ĐỊNH LƯỢNG PBOTEIN TổNG s ố , ALBUMIN VÀ GLOBULIN TRONG

Trang 14

- Dung dịch biure: Cân l,5g CuS0 4-5H^ 0 và 6g muối Seignet cho vào binh định mức 1 lít, cho thêm 300ml dung dịch NaOH 30%, 2g KI và dẫn nước đến vạch ngấn Dung dịch giữ trong lọ sẫm màu, đậy bằng nút cao su.

hệ sô

5 Dựng dường chuẩn

5ml huyết thanh được định lượng protein bằng phương pháp Kjeldahỉ dẫn đến 50ml trong bình định mức bằng dung dịch NaCl 0,9%- Cho vào các ốhg nghiệm lần lượt dung dịch huyết thanh đã pha loãng: 0,4; 0,6; 0,8; 1,0 và l,5ml Dẫn thể tích trong các ống nghiệm đến 2ml bằng dung dịch NaCl 0,9% Cho thêm vào mỗi ốhg 8ml dung dịch biure và xác định độ hấp thụ sau 30 phút phản ứng so vổi ông kiểm tra Đường chuẩn phụ thuộc vào độ hấp thụ từ hàm lượng phồn trăm proteữi nhận được

t rong ốhg thí nghiệm chứa l,Oml dung dịch huyết thanh pha loãng (0 ,1 ml không pha loăng) tương ứng với nồng độ protein biểu thị bằng % của phương pháp xác định bằng Kjeldahl Phương pháp biure không tính đưỢc theo định luật Lambert-Beer (đến nồng

độ protein 1 0%) mà có thể thay bằng cách tính hệ sô' tương quan, hệ sổ này nằm trong

giá trị % proteũi được chia ra bỏi phưdng pháp xác định bằng Kjeldahl qua giá trị hấp thụ (A) cho dung dịch chuẩn của thí nghiệm này

Ví dụ: Nồng độ protein trong huyết thanh được xác (£nh bằng phưdng pháp

Kjeldahl là 7%, giá trị A cho ốhg thí nghiệm Iml dung dịch huyết thaiứi pha loãng (7%

protein) = 0,223 Vậy A cho ốhg thí nghiệm có 0,6ml huyết thanh pha loãng (4,2%

Trang 15

VII Đ píH LƯỢNG PROTEIN BẢNG COOMASIE BRILLIANT BLUE G-250

1 Nguyên tắ c

Phương pháp này dựa vào sự thay đổi màu xảy ra khi Coomassie Brilliant Blue G-250 liên kết vối proteũi trong dimg dịch axit, dạng proton hoá của thuốc nhuộm Coomassie Blue có màu da cam đỏ Thuốc nhuộm liên kết chặt chẽ vối các protein, tưdng tác vối cả nhóm kỵ nước và các nhóm mang điện tích dương trên phân tử protein Trong môi tníòng của các gốc mang điện tích dưdng, sự proton hoá không xảy

ra và có màu xanh xuất hiện

Dạng không proton hoá của Coomasie Blue G-250 (C47H4gN3 0 7S2Na, khối lượng

Nồng độ thuốc nhuộm trong dung dịch gốc mới pha được điều chỉnh vối etanol

nhất giữa các ỉần pha thuốc nhuộm

2 Axit photphoric 17% (axit photphoric 85% được pha ỉoăng 1 : 5) Axit percloric 0,3M có thể thay th ế axit photphoric 17% lứiiíng tránh dùng ỏ phương pháp này vì những đặc tính oxi hoá của nó

Dimg dịch (1) và (2) đưỢc pha trộn theo tỷ lệ 1:1 tạo thành thuốc thử màu

dùng trong ngày (dving dịch thuốc nhuộm có sẵn của hãng hoá chất Biorad và Pierce Chemicals) Dung dịch (1) và (2) bền vững trong vài tháng ỏ nhiệt độ phòng

Trang 16

h) Tiến h à n h

Phưđng pháp này chỉ có thể dùng cho protein tan trong nưốc

Chuẩn bị 0,2ml mẫu (2-20jig protein) trong nưổc (hoặc đệm) Thêm 2,3ml thuốc thứ màu (dung dịch thuốc nhuộm axit) Trộn đều và đọc ngay ỏ OD595 Màu bền vững

trong khoảng 30 phút, sau đó kết tủa của phức hđp proteữi vối thuốc nhuộm có thể xảy ra 5fig protem có OD595 » 0,1-

Các cuvet hoặc các ổng nghiệm phản ứng thưòng có màu xám do phức chất thuốc nhuộm - protein dính vào thành, vì vậy cần phải ĩika màu thuốc nhuộm sau khi thí nghiệm bằng HCl đặc hoặc metanol (CH3OH).

Phưđng pháp phân tích này nhạy hơn 2-3 lần so với phương pháp Lowry, nhanh và đơn giản hđn nhiều, đồng thời làm giảm ảnh hưỏng của đệm, muôii, các chất khử Tuy nhiên những chất kiềm mạnh có thể gây sai lệch do làm tăng mật

độ quang.

c) Phương p h á p cải tiến

Đốì vớỉ prótein không tan, vói sự có mặt các chất tẩy rửa anion (sodium dodecyl sunphat - SDS,C24H3904Na), phưdng pháp này không thực hiện được Tuy nhiên, mẫu

có thể được hoà tan trong Triton X - 100 (0,2%), chất này không gây ảnh hưỏng

Đốỉ với các dimg dịch protein rất loãng, thể tích mẫu trong thí nghiệm phân tích này có thể tăng lên đến 50% hoặc nhiều hđn nữa so vối dung dịch thuốc nhuộm gốc

Trong trường hỢp này, dung dịch thuốc nhuộm gôS: phải tăng nồng độ sao cho nồng độ

cuối cùng trong phân tích là 0,01% thuốc nhuộm, 0,8M (5% v/v) etanol, 1,6M (9% v/v axit photphoric).

* Chú ý: Mẫu không được pha đệm đậm đặc hoặc phải hạn chế quá trinh proton

hoá Màu xanh sẽ xuất hiện khi không có protem

d) Đ ịnh lượng proteỉn qua đường chuẩn

- Q u y tr in h v i p h â n tíc h {l-20ụg p ro te in ):

Chuẩn bị một sôT dung dịch protem chuẩn có nồng độ từ l-20jig/mL Tiến hành vẽ đưòng chuẩn như sau: cho 0,8ml dung dịch protem chuẩn có nồng độ khác nhau được pha loảng tưđng ứng vào các ông nghiệm khô và sạch, ống nghiệm đối chứng thay bằng 0,8ml dung dịch đệm Cho thêm 0,2ml thuốc nhuộm vào các ống nghiệm Trộn

đều (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngưỢc vài lần Sau khoảng 5 phút đến 1 giò, đọc OD595 so

vối ống đốỉ chứng Vẽ đưồng chuẩn với OD595 của các nồng độ proteừi chuẩn khác nhau Tính hàm lượng protem của mẫu qua đưòng chuẩn Hiệu chỉnh OD595 vối mẫu trắng

Trang 17

Protein (ng)

(Sử dụng proteùi chuẩn của hãng Bio-Rad)

- Quy trình phân tích chuẩn (20~140ịtg protein):

Chuẩn bị một số^ dimg dịch proteũi chuẩn có nồng độ từ 20 - 140ng Đường chuẩn cho mỗi lần nghiên cứu được tiến hành như sau;

Cho 0,1 ml dung dịch proteũi đã được pha ỉoãng tưđng ứng vào các ốhg nghiệm sạch, khô Cho o.lnal dtmg dịch đệm vào ông I^hiệm đốì chứng Cho thêm 5ml thuốc nhuộm pha loãng Trộn đểu (tránh tạo bọt) hoặc lộn ngược ốhg nghiệm vài lần Sau 5 phút hoặc 1 giờ đo OD595 so với đối chứng Vẽ đường chuẩn ỏ ODsgg của các nồng độ khác nhau của chất chuẩn Đọc thôi^ số protein nghiên cứu từ đường chuẩn Hiệu chỉnh OD595 với mẫu trắng

3 Phương pháp Sedmak và Gronberg - quỵ trình chuẩn

í.o,

Protein (|Ag)

Hình 7.3 - Đudng chuẩn protein (20-140^g)

(Sử dụng protein chuẩn của hãng Bio-Rad)

Trang 18

- Dung dịch thuốc thử (1) Coomassie BriUiant Blue G-250 (CBBG - 250) 0,06%, cân 60mg CBBG - 250 pha trong lOOml axit percloric 3% (w/v; 0,3M) hay axit clohiđric 2,2% (w/v; 0,6N) Lọc qua giấy lọc Whatman N®1 Dung dịch được bảo quản lâu dài ở nhiệt độ phòng.

- Dung dịch mẫu (2): protein đệm được pha loãng trong nưôc không có nitd

Thí nghiệm mẫu: lấy 0,5ml dung dịch thuốc thử (1), thêm 0,5ml dung dịch mẫu (2) Trộn đều và đọc sau 2 phút ỏ bưổc sóng 620nm

Thí nghiệm đối chứng: dùng dung dịch NaCl 0,15M thay cho dung dịch mẫu

4 Phương p h áp B radford

Thuốc nhuộm: dung dịch Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB G-250) 0,01%: lOOmg CBB G-250, 50ml etanol 95% (4,7%; w/v), lOOml H3PO4 85% (8,5%), dẫn nước đến 1 lít.

- Q u y tr ìn h p h â n tích:

1 Dung dịch protein chuẩn: 10 - lOOng proteũi/ml dung dịch NaC10,15M

2 Ống thí nghiệm: 0,lm l dung dịch protein, thêm, 5ml duụg dịch thụôc ạhụộm protein, trộn đểu

3 Ống đối chứng: o.lml dung dịch NaCl 0,15M, thêm 5ml dung dịch thuôc nhuộm protein, trộn đểu

4 Đọc quang phổ ồ bước sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giò (cuvet 3cm)

- Quy trình vi phân tích:

1 Dung dịch protem chuẩn: 1,0 - 10,0^g/ml dung dịch NaCl 0,15M

2 Ống thí nghiệm: 0 ,1 mỉ dung dịch protein, thêm Iml dung dịch thuốc nhuộm protein trộn đều

3 Ống đối chứng: o.lml dung dịch NaCl 0,15M, thêm Iml dung dịch thuôc nhuộm protein, trộn đểu

4 Đọc quang phổ ỏ bưốc sóng 595nm sau 2 phút đến 1 giờ (cuvet Icm)

Rửa chất màu: ốhg nghiệm và cuvet đưỢc loại bỏ chất màu bằng axeton, sau

đó rửa hoặc ngâm trong dung dịch HCl 0,1M

VIII ĐỊNH LƯỢNG PROTEIN BẰNG p h ư ơ n g p h á p q u a n g PHỔ

1 Nguyên tắc

- Phát hiện và đo protein: phưdng pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protem trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó Nếu protem từửi sạch thì nồng độ tuyệt đôi của nó được tính theo giá trị đo được Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ

Trang 19

sắc ỉ^) thì nồng độ của protein tổ ĩ^ số được tùih tưởng đốỉ từ độ hấp thụ Phương

pháp này không dừng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp (dưối 0,05

-0,lmg/ml) hoặc khi c6 mặt nhiều chất khác mà hấp thụ cùng một vùng cực tím (ví dụ, đệm, axit nucỉeic và một sô' chất béo), hoặc khi protein ỏ trong dịch huyền phù chứ không phải trong diuig dịch (ví dụ trong màng hoặc các phức hdp có khối lượng phân

tử lốn) So với phương pháp so màu thì phưđng pháp này đđn giản hđn, nhạy hơn, mẫu dừng lại thường ổn địiủi họá phẩn lổn proteũi

- S ự hấp thụ tm cực tím: Các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ỏ bước sóng 280nm do các axit amin tryptophan, tyrozin và một phần là phenylalanin Đồng thời chúng cũng hấp thụ ỏ bước sóng thấp hđn (215-230nm) bâí chuỗi polipeptit Độ hấp thụ ỏ 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ sô' tắ t đo được (nghĩa ỉà độ hấp thụ cùa dung dịch protein 1% vối đường sóng truyền qua Icm) cho mỗi protein (bảng 7.1)

cho phép từứạ nồng độ của protein tinh sạch Độ hấp thụ ở bước sóng thấp hdn có quan

hệ trực tiếp với khốỉ ỉượng của poỉỉpeptit và thường được coi là nhạy hơn ỏ 280nm Tuy

nhiên, rất nhiễu loại đệm và phân tử khác cũng hấp thụ ở những bưóc sóng thấp hdn

(đệm photphat và tris có thể dừng được, nhxừỉg chất bảo qiiản natri azit (NaN ị) hấp thụ rất mạnh) £)ộ hấp thụ ỏ 215 hoặc 230nm phừ hỢp cho việc peptit không có

tr3T?tophan hoặc tjnrpzin

Báng 7.1 - HẬ sấ tắt của các loại proteln liốn quan hoá miễn dỊch.

của các loại protoin khác nhau

2 Nguyên liệu và thiết bị

• Dung dịch protem để đo

• Đệm hoà tan protein

- Máy quang phổ u v có cuvet thạch anh đường sáng truyền qua Icm

Trang 20

3 Đọc độ hấp thụ của mẫu hoặc trong cừng một cuvet hoặc cuvet khác cùng cặp Nếu giá trị thu được > 2,0 thì pha ỉoãng mẫu (1/5 hoặc 1/10) hoặc đường sáng

tr u y ề n ngắn hơn (2mm) cho đến khi sôT đọc nằm trong khoảng 0,1 - 1,5

4 Lặp lại bước 2 và 3 ở 360nm

5 Tính tỷ sôT độ hấp thụ 260: 280nm số này nên nhỏ hơn 0,6 Nếu tỷ sô" cao

h ơ n cho biết protein không sạch, có lẫn các chất khác đặc biệt với axit nucleic

Trang 21

C hương 8

Đ ỊN H L Ư Ợ N G A X IT N U C L E IC

Phưđng pháp hoá học định lượng axit nucleic dựa vào sự định lượng thành phần cấu tạo của axit nucleic như axit photphoric riboza, đeoxyriboza và các bazơ nitơ.Nhiều tác giả đã đưa ra phương pháp dựa vào sự phân tích hỢp chất photpho của axit nucleic Phương pháp thông dụng để phân tích hợp chất photpho cùa các mô và tê bào động vật là của Schimidt và Thannhauser (1945), Schimidt (1945) cả hai phương pháp này hiện nay vẫn thông dụng Còn để định lượng axit nucleic trong nguyên liệu thực vật dựa vào phương pháp Ogur và Rosen (1970)

Các phương pháp này dựa vào khả năng tách chiết các hỢp chát axit hoà tan và không hoà tan Các hợp chất hoà tan chứa axit photphoric được tính theo các phân tứ nhỏ mà nó liên kết, ví dụ; nucleotit, este của hexoza và triozophotphat, axetyl photphat Các hợp chất không hoà tan chứa axit photphoric như photpholipit, axit nucleic, photphoprotein

I PHƯƠNG PHÁP SCHIMIDT VÀ THANNHAUSER

li Nguyên tắc

Tiến hành tách ARN khỏi ADN và phần lốn protem cua mô sau khi thuy phán mẫu trong NaOH IN Trong điều kiện này ARN phàn giải thành các nucleotit, ADN còn lại không bị thuỷ phân Cả hai loại axit nucleic (ARN và ADN) được xác định bằng hàm lượng photpho

2 Hoá chất

- Dung dịch CCI3COOH 5-10%

- Dung dịch NaOH IN hoặc KOH IN

- Etanoỉ 80%

- Hỗn hỢp etanol - cloroform (3:1)

- Hỗn hđp etanol - ete (1:1)

- Dung dịch HCl 6N

Trang 22

3 Tiến h à n h

Quá trình xác đmh ADN theo các bước được giới thiệu ở bảng 9.1 Theo phương pháp Schimidt và Thannhauser, ARN tách khỏi ADN và phần lốn protein mô được thuỷ phân bằng NaOH IN ỏ 37°c trong một đêm Trong điều kiện này ARN thuỷ phân thành các nucleotit, ngược lại ADN tồn tại ỏ dạng không hoà tan Axit hoá dung dịch thuỷ phân kiềm (III) bằng HCl 6N và CCI3COOH cho phép tách kết tủa ADN và protein (VI) ARN tồn tại ỏ dạng các nucleotit hoà tan (IV) Xác định các loại axit nucleic theo hàm lưỢng photpho ở phần IV và VI theo phưdng pháp xác định photpho của Horecker và cộng sự (1940) có sửa đổi từ phương pháp Fiski và Subbarow (1925).Nếu giá trị của photpho vô cơ rất nhỏ, giá trị nguồn photpho từ photphoprotein ỏ phần IV có thể được dừng để tính cho hàm lượng ARN Để xác định giá trị chúih xác của ARN có thể xác đỊnh đồng thời photpho vô cơ được tách ra ỏ phần IV Hàm lưỢng photpho của ARN được tửứi từ hiệu giá trị photpho ở phần IV và V Điều quan trọng

là ở các mô giàu photpho, axit không hoà tan có nguồn gôic không phải axit nucleic, ví

dụ mô gan, mô não (cả chất trắng cũng như chất xám) Một phần hđp chất photpho vô

cd được tách khỏi khi sử dụng phưđng pháp Delory (1938)

Phương pháp Schmidt và Thannhauser đã được cải tiến để có độ chùih xác cao hơn, ví dụ khí phấn tích ẤDN c6 cho thêm 1% dung dịch albumm để làm kết tủa dễ

dàng Phương pháp quang phổ kế xác định axit nucỉeic cũng thường đưỢc sử dụng phưđng pháp Thannhauser và Tsanev (1960) Phương pháp Schmidt và Thaimhauser

có thể xác định được số lượng nucleotit khi đưỢc tách bằng sắc ký điện di Phương

pháp xác định axit nucleic theo Schmidt và Thannhauser giới thiệu ỏ bảng 9.1

Bổng 9.1- Các buớc tiến hành để xác định ADN bằng

phU0ng pháp Schmldt và Thannhauser

Các giai

Các họTp c h ấ t photpho có tro n g th à n h p h ẩn của các

Các hỢp chất axit hoà tan

II Chiết mô còn lại ở phần I bằng etanol

80%, hỗn hđp etanol - cloroform nóng (3:1) hoặc hỗn hợp etanol - ete (1:1)

Photpholipit

III Thủy phân mô còn lại ỏ phần II bằng

NaOH IN hoặc KOH IN ỏ 37“c qua đêm (Iml NaOH / lOOmg mô tươi)

Các nucleotit được tạo thành từ ARN, AND cùng photpho

photphoprotein)

Trang 23

Các giai

Các hỢp chẫt photpho có trong th àn h phần của các

giai đoạn

IV Lấy dịch li tâm sau khi cho thêm HCl

6N vào phần II (để trung hoà NaOH hoặc KOH) và tiếp tục cho thêm CCI3COOH đến nồng độ cuối cùng là 5-10% Kết tủa ADN được tách bằng li tâm ở 0“c Rửa tiếp hai lần bằng CCI3COOH 5%

Nucleotit của ARN và photpho

vô cơ có nguồn gổc không phải của nucleotit (chủ yếu là từ photphoproteũi)

V Tách các hợp chất photpho vô cơ từ

phần rv và xác định chúng bằng phướng pháp Delory

Photpho không phải của nucleotit, chủ yếu photpho được giải phóng khi thuỷ phân

photphoprotein

VI Kết q\iả nhận đưỢc từ phần III cho

thêm một ít HCl 6N để trung hoà và cho thêm CCI3COOH đến nồng độ 5-

1 0%

ADN và protein

VII Chế phẩm nhận được khi xử lý phần

VI với CCI3COOH 5% ỏ 90°c trong 15 phút

Trang 24

Bảng 9.2 -Các giai đoạn tách chiết các hợp chất photpho theo phU0ng pháp Schneider

Các giai

Các hd]p chất photpho có trong các giai đoạn

III Phần mô còn lại sau chiết rút của phần I

và II

ARN, ADN, photphoprotein

IV Chế phẩm nhận đưỢc ỏ giai đoạn III xử

lý VỚI CCI3COOH 5% hoặc HCIO4 6% ỏ

90“c trong 15 phút Kết tủa còn lại rửa hai lần bằng axỉt

ARN, ADN và một phần photphoprotem

Xác định ARN và ADN theo phương pháp Schneider thuận lợi hđn phưđng pháp Schmidt và Thannhauser đối vối nhiều mô động vật khác nhau (ruột, lá lách, tuyến

ức, bạch cầu và hồng cầu lưổi) Ngược lại, trong trường hỢp phân tích mô não và thận ỉại nhận được kết quả kbác Iihau, vì có thể xác định cả lượng photphoproteũi cũng như những phức châ^t protem từ mosũi photphat Trong những trường hỢp như thế, để có kết quả chính xác hđn cần sử dụng cả hai phương pháp và xác định bổ simg sự hấp thụ tia tử ngoại

III PHƯƠNG PHÁP OGUR VÀ ROSEN

1 Nguyên tắc

Các phưdng pháp trên không thực hiện được cho nguyên liệu thực vật vì có những hdp chất đưỢc tách ra như pentosan, poliuronit đã cản trở việc xác định axit nucleic Trong bảng 9.3 giới thiệu cách tách chiết rút theo phưdng pháp Ogxir và Rosen Phương pháp này cho phép xác định ARN và ADN (số’ lưđng ljig) trong đầu rễ cây và trong phấn hoa Sự tách chiết các mô bằng etanol và hỗn hợp etanoỉ - ete (phần I và II)

đã tách các chất hoà tan khỏi sự liên kết của chúng và cho màu đỏ thẫm vổi điphenylamũi Một phần axit không hoà tan (IV) được tách chiết bằng HCIO4 0,1N ỏ 4”c, ARN được tách khỏi hỗn hđp và được định lượng bằng cách đo độ hấp thụ trong quang phổ kế Tiếp theo sử dụng dung dịch HCIO4 nóng tách ADN và photpho của protein trong phần mô còn lại và định lượng giá trị ADN ỏ bước sóng 270nm hoặc xác định giá trị của đeoxyriboza hoặc photpho

Dùng phưdng pháp này sẽ cho kết quả không tốt khi phân tích các loại mô khác nhau, ví dụ khi chiết rút ARN của nấm men sẽ đồng thời làm mất một phần ADN Cần chú ý rằng việc nghiên cứu nguyên liệu vi khuẩn bằng phương pháp này phụ

Trang 25

thuộc vào sự kéo dài thòi gian tách chiết ARN (ngay cả đến 30 giò) Phương pháp Ogur

và Rosen cũng được sử dụng để xác định axit nucleic của một số mô động vật.

Quá tiình xác đỉnh theo bảng 9.3

Bổng 9.3 - Các hợp chất photpho ò các giai đoạn theo phuong pháp Ogur và Rosen

Các giai

Các họi]p chất photpho có trong thành phần của các

giai đoạnMôtưdi Mô tươi có tìiể giữ trong etanol 70-90% ỏ

0“c trưốc khi đước chiết rút

I Chiết rút bằng etanol 70%, phần mô còn

lại đưỢc rửa bằng etanol 70% có HCIO4

0,lN tiếnhànhỏ4“C

Các chất hoà tan trong etanol

II Chiẽt rút hai lần phần mô còn lại bằng

hỗn hợp etanol 96% và ete (3:1)

Các chất hoà tam trong hỗn hợp etanol - ete

m Nhanh chóng chiết rút (lạnh) hai lần

phần mô còn lại (II) bằng dung dịch HCIO4 0,1N

Các chất axit hoà tan

IV Phần mô còn lại sau khi chiết rút ở phần

Trang 26

IV PHƯƠNG PHÁP QUANG P H ổ

Phương pháp của Tsanev và Markov sử dụng HCIO4 để phân chia ARN và ADN bởi sự thủy phân bằng kiềm ỏ phần III Tách chiết ADN và xác định dịch chiết ồ bưốc sóng tử ngoại

giai đoạn

photpho từ photphoprotem

IV Phần dịch li tâm nhận được sau khi thủy

phân bằng bazd (III) đưdc tnuig hoà bằng HCIO4, tiếp tục cho thêm HCIO4 đến nồng độ cuối cừng là 3% ỏ nhiệt độ 0°c

Trang 27

ADN = K a n d mg%p

w X 1

Trong đó: V - thể tích mẫu chiết rút (ml),

1 - độ dày của lốp dịch đo,

w - khối lượng mẫu (g),

Trong đó: M - khối lượng mol photpho,

6(P) • h ệ số moi hấp thụ của axit nucleic ỏ 260nm liên quan đến khôi

lượng mol photpho E(P) đối vối ARN = 10130, 8(P) đối vối ADN = 8782,

r • sự liên quan giữa hấp thụ và độ sạch của axỉt nucleic ỏ 260nm đến

sự hấp thụ ả Xg (nghĩa là ỏ 286nm đốì vối ARN và 284nm đổì vối ADN),

r = ^ 2 6 0 ^ 2 , 2 đ ố i v ớ i A R N ,

A.280

r = Ể tm = 1,79 đối vổi ADN

A2»4

V ĐỊNH LƯỢNG HỢP gỊỈẤT PHOTPHO TRONG MÔ RUỘT THEO PHƯƠNG

PHÁP SCHMIDT VÀ THANNHAUSER c ó SỬA Đ ổl

Trang 28

- Dung dịch HCIO4 3%, 50% và 0,2N.

- Dung dịch KOH IN

4 Dụng cụ và máy móc

Phễu lọc đưòng kừứi 5 - lOcm, cốc 200mỉ, ống li tâm 25mỉ, 5 ông nghiệm lOml, nồi

c ác h thuỷ, tủ ấm, máy so màu, máy nghiền đồng thể

Gipit)

3 lần chiết rút bằng HCIO4 0,2N

Thuỷ phân bằng KOH IN, 37®c, 18 giò

Dịch thuỷ phân (nucleotit của ARN, ADN

và p của photphoprotein)

D Dừng HCIO4 50% để tnm g hoà,

tiếp tục dẫn đến nồng độ 3%

(ribonucleotit + (ADN + protem)

p vô cơ từ photphoprotein)

Trang 29

1 Loại lipit của mô ruột (A): lấy 300g mô ruột nghiền cẩn thận với hỗn hợp axeton - cloroform (5:1) trong máv nghiền đồng thể Li tâm Tiến hành chiết rút 3 lần vói hỗn hỢp axeton - clorofom (5:1) ở 0"c Tiếp tục chiết rút 3 lần bằng hỗn hỢp etanol-ete (3:1) ở 37°c Sau mỗi lần chiết rút, li tâm 5 phút ồ 3000 vòng/phút Dịch chiết chứa hỢp chất lipit, tập trung các phần chiết lại, dẫn đến thể tích xác định bằng hỗn hđp axeton - cloroform.

2 Chiết rút các hợp chất axit hoà tan (B): mô đã loại lipit, tiếp tục chiết rút trong ống nghiệm 3 lần vối 4 - 5ml dung dịch HCIO4 0,2N lạnh ở nhiệt độ 0 - 4^c

trong 10 phút Sau mỗi lần chiết li tâm lạnh 10 phút ở 4000 vòng/phút Dịch li tâm

cho vào ông đong và dẫn đến 15ml bằng HCIO4 0,2N Kết tủa là hđp chất axit không hoà tan, rửa hai lần bằng etanol 96% lạnh, mỗi lần 4-5ml, ba lần hỗn hđp etanol - ete (1:1) và một lần bằng ete Mỗi lần rửa phải li tầm Kết tủa được làm khô trong không khí

3 Thuỷ phân hỢp chất axit không hoà tan (C): cho thêm 5ml KOH IN vào kết tủa của hỢp chất axit không hoà tan, ủ ỏ 37°c (chính xác) trong 18 giờ

4 Phân chia ARN và ADN (D): sản phẩm thuỷ phân làm lạnh đến 0"c vàtrung hoà b ằ i^ HCIO4 50% (cần đặt trong chậu nưóc đá), thử bằng giấy đo pH Tiếp tục cho thêm HCIO4 50% đến nồng độ HCIO4 có trong dung dịch là 3% Khuấy cẩn thận và để 30 phút trong chậu nước đá, li tám lạnh 10 phút ỏ 2800 vòng/phút Kết tủa

là ADN, rửa kết tủa 3 lần bằng HCIO4 3% (3-4ml), sau mỗi lần rửa lại li tâm lạnh

Dịch li tâm được tập trung và dẫn đến 20ml bằng HCIO4 3% Kết tủa đưỢc rửa hai lầnbạng ẹtạnọl lạiủi 96% (4-5jnl) và một lần bằng etanol 96% ỏ nhiệt độ phòngị 3 lần bằng hỗn hỢp etanol - ete (1:1) và 1 lần bằng ete (mỗi lần rửa đểu phải li tâm)

5 Xác định hàm lượng photpho bằng phưđng pháp Horecker:

+ Trong toàn bộ mẫu

+ Trong phần lipit

+ Trong d\mg dịch A (photpho của toàn bộ axit hoà tan)

+ Trong dung dịch D (photpho của ARN và photphoprotein)

+ Trong kết tủa D (photpho của ADN) giá trị photpho tính bằng mg% mô tưđi qua thang chuẩn của hỢp chất photpho

dịch D xem như photpho của ARN

Trang 30

VI ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO THEO PHƯƠNG PHÁP HORECKER VÀ CÁC

- Dung dịch amoni molypđat [(NH4)2Mo0 4] 5%

- Dung dịch ejkonogen hoặc amidol [2,4 - điaminophenol đihi&oclorit

H0 C(;IÌ3(NH2)2-2HC1)] [dung dịch eịkonogen, 0,2% hoặc amidol cho thêm 1 2g natrỉ pyrosunphit (Na2S2 0 5)]

VII ĐỊNH LƯỢNG PHOTPHO v ô c ơ c ó NGUồN G ố c TỪ PHOTPHOLIPIT THEO PHƯƠNG PHÁP DELORY

Trang 31

2 Hoá chất

- Dung dịch CaCl2 2,5%

- Dimg dịch MgCOg 0,5%

- Dung dịch amoniac 2%

- Dung dịch HCIO4 eo^/o

- Dung dịch amoni moilypđat ((NỈỈ4)2Mo0 4] 5%

- Dung dịch ejkonog«n (xem phần hoá chất trên)

- Dung dịch phenolphtaỉein trong etanol 45%

3 Dụng cụ và máy móc

Ống li tâm lõmỉ, pipet 1, 2, 5 và lOml, máy li tầm, máy so màu

4 Tiến hành

1 Lấy 15ml dving dịch chứa photpho vô cơ (từ photphoprotem) cho vào ốhg li tám

2 Cho thêm từng giọt dimg dịch amoniac đậc vói sự có mặt của phenolphtaỉein để tnm g hoà dung dịch Sau khi trung hoà dung dịch cho thêm 0,2ml hoá chất đó

3 Cho tiếp vàơ ô«ig nghiệm Iml CaCl2 2,5% và Iml MgCOg 0,5% Lắc cẩn thận và để yên 30 phút

4 Li tâm Cẩn thtận iỉạn bỏ lốp dịch phía trên Thành ồihg ỉi tâm đưỢc thấm khô bằng giấy thấm

6 Kết tủa hoà tan vào HCIO4 60%, cho thêm khoảng lOml nước cất, Iml (NH4)2Mo0 4 5%, 0,5nal dung dịch eịkonogen và dẫn nước đến 15ml

7 Sau 10 phút, xác định sự hấp thụ dung dịch ở máy so màu vổi bưốc sóng 720nm Giá trị của photpho được tính theo giá trị sự hấp thụ của dung dịch chuẩn

VIII ĐỊNH LƯỢNG ARN BẰNG ORXINOL

Trang 32

tan vào benzen nóng Lọc qua than hoạt tính và loại orxinol kết tủa sinh ra sau khi cho thêm hexan.

- Dung dịch KOH IN

- Dung dịch HCIO4 60%

- Dvmg dịch chuẩn ARN nấm men có lOng/ml photpho ARN (ARN-P)

- Dung dịch bazơ yếu của magie ribonucleonat có nồng độ xác Chuẩn bị dimg dịch có nồng độ khoảng Img/ml

2 Trung hoà bằng HCIO4 60%, tiếp tục cho thêm HCIO4 60% cho đến nồng

độ dung dịch 3% Đặt ốhg nghiệm vào chậu nưốc đá Sau 15 phút đem li tâm Kết tủa

có KCIO4 và có thể có ADN

3 Dịch li tâm cho vào bùứi định mức 25mỉ Rửa kết tủa hai lần bằng ỉmỉ nưổc để tách chiết hoàn toàn kết tủa ribonucleotit, tất cả dịch chiết cho vào bình địnỉi mức Dân nưốc đến vạch ngấn và lắc cẩn thận

4 Cho vào ốhg nghiệm khô 2ml dịch thuỷ phân, cho thêm Iml nước và 3ml

thuốc thử orxinol Lắc đều các ống nghiệm và để trong chậu nừốc nống 20 phút.

Đồng thời chuẩn bị ốhg kiểm tra với các hoá chất, còn các ống thí nghiệm vối dung dịch ARN chuẩn Trong các ốhg thí nghiệm có ARN xuất hiện màu xanh da trời bển vững của phức chất furfural vói orxin

5 Sau khi để nguội, các ốhg thí nghiệm được đo ỏ bước sóng 669nm (giá trị

cực đại của phức chất tạo thành) đối chứng vối ông kiểm tra Giá trị của ARN trong các ốhg nghiên cứu được tửửi theo độ hấp thụ của các mẫu chuẩn Mẫu chuẩn được pha theo đơn vỊ ^g, mg magie ribonucleat trong Iml

* Chú ý: Phức chất màu orxin phản ứng với các riboza tự do của các nucleotit và

của các nucleozit purin Riboza liên kết của các bazơ pyrimiđin không c6 phản ứng Vì vậỵ, để xác định 80' lượng ARN không dựa vào riboza tự do mà phải xác định bằng giá trị photpho ARN (ARN-P) Ngoài riboza, orxin cũng phản ứng với 2 - đeoxiriboza nhưng cho màu xanh yếu hđn 10 lần so vối riboza Để xác định sô" ỉượng ARN trong sự

có mặt của ADN phải loại trừ giá trị của ADN

Trang 33

DC ĐỊNH LƯỢNG ADN BẰNG p h ư ơ n g p h á p ĐIPHENYLAMIN

1 Nguyên tắc

ADN phản ứng với điiphenylamin cho phức chất màu xanh da trời Dựa vào cưdng

độ hấp thụ ADN của thang chuẩn, tính được hàm lưỢng ADN nghiên cứu

2 Hoá chất

- Dung dịch CCI3COOH 10%

- D\mg dịch HCIO4 0, 6N

- Thuốc thử đỉpheriylamm: Ig điphenylamin (C,2H^]N) hoà tan vào lOOml

CH3COOH đậc, cho thêm 2,75ml H2SO4 đặc Độ tinh khiết của điphenylamin phụ thuộc vào sản phẩm thương mại kết tũih bỏi hexan

- Dving dịch ADN chưẩn có nồng độ 20fig ADN-P/ml

4 Cho vào kết tua lOml dung dịch HCIO4 0,6N và lắc đều 15 phút trong nồi cách thuỷ ỏ 90“c Diu% (dịch HCIO4 nổng làm cho axit nucleic (ARN và ADN) tich khỏi proteũi, các hỢp chất axit hoà tan được thuỷ phân và chuyển vào dung dịch Sau

HCIO4 0,6N Còn dịch li tầm chuyển vào bình định mức 25ml, dẫn nưóc đến Vich ngấn và trộn đểu

5 Cho vào ông nghiệm Iml dung dịch axit nucleic, Iml nước cất và 4ml thiốc thử điphenylamin Trộn (đều và đặt vào nồi cách thuỷ, đun sôi trong 10 phút Đóng thời làm thí nghiệm kiểm tra vối thuốc thử và dung dịch ADN chuẩn đã biết giá trị

Trang 34

photpho của ADN (ADN-P) Trong các ống nghiệm có ADN xuất hiện màu xanh da

trời bền vững

6 Độ hấp thụ được xác định là hiệu giá trị OD của các ống thí nghiệm có d\mg dịch chuẩn và ông thí nghiệm kiểm tra đo ồ bưốc sóng 600nm (hấp thụ cực đại đốỉ vối

hợp chất màu tạo thành) Hàm lượng của ADN trong các ông thí nghiệm nghiên cứu

tính theo độ hấp thụ của các ốhg thí nghiệm dung dịch chuẩn Hàm lưỢng của ADN

tính theo mg trong Ig mô tươi

Trang 35

C hư ơ ng 9XÁC ĐINH HOAT ĐÔ CỦA MÔT s ố ENZIM• • • •

I ĐỊNH NGHĨA ĐƠN VỊ HOẠT ĐỘ CỦA ENZIM

Hoạt động của enzim được tính theo đđn vị quốc tế u (Unit) hoặc mU (mili Unit) Một u là hoạt động của en2Ìm xúc tác cho sự chuyển hoá một micro mol (1 nmol) cơ chất sau 1 phứt ỏ các điều kiện thích hdp nhất

Đốì vối chế phẩm enzim, ngoài việc xác định mức độ hoạt động cần phải đánh giá

độ sạch của nó Đại lượng đặc trưng cho độ sạch của chế phẩm enzim là hoạt độ riêng Hoạt độ riêng đưdc biểu thị bằng sô" đơn vị enzim/lmg protein (U/mg), cũng có thể là 1

gam chế phẩm hoặc Iml dung dịch enzim, thông thường hàm lượng protein đưỢc xác định bằng phưđng pháp Lowry Một sô' trường hỢp đậc biệt (ví dụ một số hidrolaza) thì

^ n h nghĩa này không thể áp dụng được Trong một sô' trường hđp cần phải xác định các đỉều kiện phản ứng (ví dụ bản chất nồng độ cơ chất), khi cần thiết có thể đưa ra định nghĩa của những đdn vị khác hoặc đỉểu kiện thí nghiệm tưđng ứng Nhiệt độ đo cũng hình thành một hoạt độ riêng của enzỉm, ví dụ 400U/mg (25“C) Nếu biết được khốỉ lượng phân tử của enzim có thể tứửi được hoạt độ phân tử cơ chất (hoặc sô' đương ỈIÙỢII^Ỉ các nhóm tương ứng) bị chuvển hoá dưới tác dụng của một phân tử

ẹiụim sạu.l phứt .

II CHÚ Ý KHI XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ ENZIM

- Độ bền của enzim thường cao hơn coenzim Các vi sũih vật sản xuất proteinaza thưòi^ không bền nên có thể cho thêm chất bảo quản để làm bền Để bền enzim, người ta thưòng cho thêm cơ chất hoặc chất tưđng tự cđ chất (ví dụ: để làm bền glixerol kinaza, thêm etylen glycol 1% (v/v), đây là cách duy nhất có thể ổn định giông hơn 1 năm) Tuy lứìiên csẩn phải kiểm tra các chất bảo quàn này có ức chế enzim không để có biện pháp xử lý khi xác định enzim

- Cần tránh các yếu tố gây biến túih protein như nhiệt độ cao, pH quá axit hoặc quá kiềm, muối kim loại nặng

- Cần có các ^ ề u kiện tiêu chuẩn và thích hởp nhất của enzim xúc tác như nồng

độ cơ chất, pH môi trường, nhiệt độ (thưòng tiến hành trong điều kiện dư cơ chất,

khi ngừng phàn ứng, lượng cơ chất bị chuyển hoá từ 20 - 30%)

Trang 36

III XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA ASCORBAT OXIDAZA

H-C

c = o-> C=C) ^

HO-C-H

CH2OHaxit L-ascorbic

HO-C-H

H-C -CH2OH axit L-đehiđroascorbicEnzim này có nhiểu trong rau quả tươi Hoạt độ enzim này cũng có thể xác định

bằng cách dùng iot để đo số ỉượng axit.

3 Lọc hoặc li tâm Dịch lọc dừng để nghiên cứu hoạt độ en2Ìm

4 Cho vào 2 bình định mức dung tích 50ml, mỗi bình lOml dịch enzim

5 Bình kiểm tra đun sôi 2 phút, sau đó làm lạnh

6 Đặt cả hai bình vào nồi ổn nhiệt ỏ 37°c trong 5 phút

7 Cho thêm vàa mỗi bình lOml dung dịch axit ascorbic đã ủ trưốc ở 37°c ủ hỗn hợp phản ứng 30 phút

Trang 37

8 Đun sôi cả hai binh và làm lạnh Cho nước cất vào 2 bình đến vạch.

9 Lấy lOml dịch cho vào bình nón lOOml, thêm 5ml dung dịch KI 10%, lOml

HCl 5%, 10 giọt dung dịch túih bột 1% và lOml dung dịch KIO3

10 Sau 5 phút, chuẩn độ cả hai bình bằng dxmg dịch Na2S203 đến khi mất màu xanh

4 Tinh k ết quả

Kết quả đưỢc tứih theo côaig thức

^ _ (a - b) X f X 0,088

wTrong đó: X - hoạt độ của ascorbat oxidaza biểu thị bằng miligam axit ascorbic bị

oxi hoá dưđi sự tác động của enzim chiết từ một gam mẫu thực vật sau thời gian cào tác động,

a - sô' ml dxang dịch NagSgOg 0,001N dùng để chuẩn độ bình thí nghiệm,

b - số ml dumg dịch NagSgOg 0,001N dùng để chuẩn độ bình kiểm tra,

f - hệ sô' ciiỉnh lý dung dịch Na2S2 0;Ị tướng ứng với Iml dving dịch NagSgOs 0, 0 0 1N,

w- khốỉ lượng Iiíguyên liệu lấy để phân tích

IV XÁC ĐỊNH HOẠT ĐỘ CỦA a- AMYLAZA THEO RUKHLIADEVA GERIACHEVA

1 Nguyên tắc

Amyỉaza có khả nảng thuỳ phần tinh bột tạo thành các dextrm có khối lượng mol khác nhau Khi cho tác dụixg vái iot, chứng sẽ tạo màu Đo cưòng độ màu tạo thành, tứih đưỢc hoạt độ của aniiylaza Đơn vỊ hoạt độ amylaza là lượng enzim xúc tác thủy phân được Ig tinh bột thàĩih dextrin có phân tử lượng khác nhau ỏ nhiệt độ 30"c trong 1 giò

pH cho amylaza của malt là 4,8-4,9; cho amylaza nấm mốc là 4,7; cho amylaza của vi khuẩn là 6,0

Amylaza xúc tác cho các phản ứng thủy phân tinh bột, glycogen, các polisacarit tương tự Amylaza được chia làm 3 ỉoại:

- a - amylaza (1,4 - a - I>- Glucan - glucanohiđrolase; EC 3.2.1.1) có trong nưóc bọt, hạt hoà thảo nảy mầnn, trong tuỵ tạng, nấm mốc, vi khuẩn Nó phân giải liên kết1,4 - glycozit ở giữa chuỗỉ polisaccarit (nên gọi là “endo amylaza”) tạo thành dextrin phân tử thấp Dưới tác dụng của enzim này, dung dịch tũủi bột nhanh chóng bị mất khả năng tạo màu vối duiig dịch iot và bị giảm độ nhót mạnh, a - amylaza bển vổi nhiệt, nhưng kém bến với axit

Trang 38

- p - amylaza (EC 3.2.1.2) có nhiều ỏ hạt, củ thực vật Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4 - glycozit từ đầu không khử tạo thành chủ yếu mantaza và dextrin phân tử lớn Mất hoạt tính ở nhiệt độ trên 70°c, nhưng bền với axit hơn

a - amylaza.

- Glucoamyỉaza có nhiều ỏ vi sũih vật, gan động vật Nó xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết 1,4 - và 1,6 - glycozit bắt đầu từ đầu không khử của chuỗi polisaccarit sả n phẩm chủ yếu là glucozơ và dextrin Nó bị mất hoạt tứủi ỏ nhiệt độ trên 70°c Nhiều glucoamylaza hoạt động mạnh ỏ pH 3,5 - 5,5

lọ màu, dừng trong vòng một tháng

- Dung dịch iot phân tích

Pha loãng 2ml dung dịch iot gốc bằng dtmg dịch HCl0,1N trong bìnli định mức lOOmL Trưốc khi dừng dung

dịch iot phân tích cần kiểm tra mật độ quang ở bước sóng

453mm là 0,16 (I 0,01) Nếu sai lệch mật độ quang cần phải hiệu chỉnh bằng cách thêm vài giọt dxmg dịch iot gốc

• Dung dịch chế phẩm enzim gcc

Cân 0,lg chế phẩm cần nghiên cứu cho vào cốc thvợ tinh dung tích 25ml, hoà với một lượng nước nhỏ rồi chuyển vào bình định mức lOOmỉ, thêm nưốc cất đến vạch, trộn đều, lọc Có thể bảo quản dung dịch enzim 1 ngày ỏ 2 - 4°c

- Dung dịch chế phẩm enzim nghiên cứu

Pha ỉoăng dung dịch enzỉm gốc sao cho trong 3ml dung dịch enzim phân tích cố chứa một ỉượng enzim đủ để thuỷ phân tinh bột từ 20% đến 70% Muốn vậy cần lấy lưỢng dung dịch gốc khác nhau tuỳ thuộc vào hoạt độ của chế phẩm mà pha loãng bằng nước tới 50ml (có hoạt độ

từ 20-700 đđn vỊ/g) hoặc tỏi 200ml (hoạt độ 700 đđn vỊ/g trỏ lên)

Trang 39

p h a loăng (ml)

• Dung dịch đệm axetat pH = 7,4 dừng để xác định amylaza của nâ'm mốc,

pH = 4,9 dừng để xác định amyỉaza của malt (xem phần đệm trang 159)

■ Dimg dịch tinh bột 1%

Hoà Ig tinh bột (theo khối ỉượng khô tuyệt đối) trong binh địnhmức lOOml với 50mỉ nước cất, lắc đều khi tinh bột tan hoàn toàn,làm nguội bình và thêm lOml dung dịch đệm axetat (pH ứng vâi

phản ứi^) rồi thêm nưóc cất đến vạch, lắc đểu Chuẩn bị dxmg dịch

tinh bột dừng trong ngày

» Tiến hành

1 Cho vào 2 bìiứi nón 50ml, mỗi bình lOml dimg dịch tũih bột 1% và đặt vào

máy ủ nhiệt ồ 30°c, giữ 10 phút.

2 Thêm vào bình 2 (bình thí nghiệm) 5ml dịch chiết enzim Khuấy đểu và giữ 1 0 phứt

3 Lấy từ mỗi binh 0,5ml hỗn hỢp cho vào 2 bình khác có chứa 50ml dimg dịch iot Lắc đều Bình đốì chứng có màu xanh, bình thí nghiệm có màu tím

4 Đo độ hấp thụ ỏ bưốc sóng 656iun Mật độ quang của bình đốỉ chứng (ODj)

là lượng tinh bột ban đầVL Mật độ quang của bình thí nghiệm (OD2) là lượng tinh bột còn lại sau khi a-amylaza thủy phân Sự khác nhau giữa mật độ quang của bình đối chứng và bình thí nghiệm là lượng tũủi bột bị enzim thủy phân

4 T ính k ế t quả

• LưỢng tỉnh bột bị thủy phân (c) từứỉ theo công thức;

Trang 40

ODl — ODo n 1

c = - ^x O ,l

ODiTrong đố: ODịi • mật độ quang của dimg dịch đối chứng ,

0 D2 - mật độ quang của dung dịch nghiên cứu,

0 ,1 - lượng tinh bột phân tích (g)

Nếu lượng tinh bột bị thủy phân nhỏ hđn 0,02g hay lốn hđn 0,07g thì lặp lại thí nghiệm bằng cách thay đổi lưdng enzim cho tác diu^ (nhiều hay ít) dùng để phân tích

5 Cách tính hoạt độ amylaza từ các ch ế phẩm enzim khác nhau

- Hoạt độ amylaza (tính theo đđn vỊ/gam) của chế phẩm enzim vi khuẩn mốc (HdAv) tính theo công thức:

đem thí nghiệm (mg),

c - ỉượng tinh bột bị thủy phân (g),

1 0 0 0 - hệ sô" chuyển mg thànk gam,5,885; 0,001671; 7,264; 0,03766; 6,889; 0,029388 là các hệ số của phương trình tính hoạt độ thu được bằng phưđng pháp xử toán học sô' liệu thực nghiệm vể sự phụ thuộc của lượng tinh bột bị thủy phân

và lượng enzim lấy để nghiên cứu Trong các hệ sô" này có đưa vào thừa sô' tính chuyển ra 1 giờ tác dụng của enzim

- Hoạt độ amylaza (HdA) tính theo hoạt độ chất khô tuyệt đốì của các loại chế phẩm (HdAcp) đưỢc xác định

H d A = i y ^ ^

100 - w

Trong đó;

w- độ ẩm của chế phẩm (%)

Ngày đăng: 28/03/2016, 23:37

TỪ KHÓA LIÊN QUAN

TÀI LIỆU CÙNG NGƯỜI DÙNG

TÀI LIỆU LIÊN QUAN

w