Báo cáo đồ án Phát triển sản xuất enzyme từ bã mía

Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm vê

MỤC LỤC

Lời Mở Đầu 5

CHƯƠNG 1: LẬP LUẬN KINH TẾ 7

Sự cần thiết phải đầu tư 7

1.1 Đặc điểm tự nhiên 7

1.2 Vùng nguyên liệu 8

1.3 Hợp tác hóa 8

1.4 Năng suất của nhà máy 8

1.5 Giao thông vận tải : 9

1.6 Nhân công và thị trường tiêu thụ : 9

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 10

2.1 Tổng quan về enzyme cellulase 10

2.1.1 Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase 10

2.1.2 Ứng dụng của enzyme cellulase 12

2.1.3 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam và trên thế giới 14

2.2 Giới thiệu về Trichoderma reesei 15

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu của Trichoderma reesei 15

2.2.2 Nuôi cấy Trichoderma reersei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì 17

2.2.3 Hình thái của Trichoderma reesei 17

2.2.4 Đặc Điểm 18

2.2.5 Ứng dụng 19

2.3 Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei 21

2.3.1 Tính chất hóa lý của enzyme cellulase 22

2.3.2 Các nguồn thu nhận enzyme 23

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề mặt 23

2.3.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật cellulase 24

2.3.5 Môi trường sinh tổng hợp enzyme 25

2.3.6 Một số lưu ý trong sinh tổng hợp enzyme cellulase 26

2.4 Tổng quan về bã mía 26

2.5 Tổng quan về cám mì 27

Chương 3: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN 29

CÔNG NGHỆ 29

3.1 Chọn dây chuyền công nghệ 29

3.2 Thuyết minh dây chuyền công nghệ 31

3.2.1 Nguyên liệu 31

3.2.2 Phối trộn 32

3.2.3 Thanh trùng 32

3.2.4 Làm nguội 32

3.2.5 Nhân giống sản xuất 32

3.2.6 Gieo giống 33

3.2.7 Nuôi cấy 34

3.2.8 Thu nhận chế phẩm 35

3.2.10 Nghiền 36

3.2.11 Trích ly 36

3.2.12 Cô đặc 36

3.2.13 Sấy phun 36

3.2.14 Bao gói 37

Chương 4: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT 38

4.1 Kế hoạch sản xuất của nhà máy 38

4.2 Cân bằng vật chất 40

4.2.1 Dây chuyền sản xuất sản phẩm enzyme 40

4.2.3 Dây chuyền sản xuất bã mía 44

4.2.4 Dây chuyền gia công cám mì (Tỉ lệ hao hụt 2%) 44

4.2.5 Dây chuyền gia công trấu (Tỉ lệ hao hụt 2%) 44

4.2.6 Khoáng chất (Tỉ lệ hao hụt 0,05%) 44

4.2.7 Lượng nước cần dùng cho cả dây chuyền 45

4.2.8 Môi trường nhân giống 47

Bảng 4.3: Bảng tổng kết 47

Chương 5: CHỌN VÀ TÍNH THIẾT BỊ 49

5.1 Máy phân loại bã thải mía 49

5.2 Máy nghiền 50

5.3 Thiết bị vận chuyển 51

5.3.1 Gàu tải 51

5.3.3 Băng tải 57

5.4 Tính bunke 58

5.4.1 Bunke chứa trấu 60

5.4.2 Bunke chứa bã mía 60

5.4.3 Bunke chứa cám mì 61

5.4.5 Bunke chứa canh trường nấm mốc sau khi thu nhận 62

5.4.6 Tính thùng chứa nước 63

5.4.7 Bunke dự trữ cho quá trình phân phối môi trường vào khay 64

5.5 Thiết bị nuôi cấy 65

5.6 Máy trộn 66

5.7 Thiết bị tiệt trùng 67

5.8 Thiết bị sấy 69

5.9 Thiết bị trích ly 72

5.10 Thiết bị cô đặc 73

75

5.11 Chọn bơm 75

5.12 Chọn thiết bị lọc và vô trùng không khí 76

5.13 Chọn thiết bị điều hoà không khí 77

5.14 Chọn thiết bị làm sạch không khí thải 77

5.15 Chọn thiết bị bao gói sản phẩm 78

Chọn máy đóng gói định lượng YSDC-B4 của Công ty TNHH thiết bị đóng gói Dự Thịnh tỉnh Hồ Nam 78

Kích thước: 1200x600x1900 mm 78

6.3 Tính xây dựng 80

6.3.1 Phân xưởng sản xuất chính 81

6.3.2 Kho chứa nguyên vật liệu 81

6.3.3 Kho thành phẩm 81

6.3.4 Kho chứa khay 81

6.3.5 Phòng nhân giống 81

6.3.6 Phòng nuôi mốc 82

6.3.7 Phòng điều hòa 82

6.3.8 Phòng KCS 82

6.3.9 Trạm biến áp 82

6.3.10 Trạm bơm 82

6.3.11 Nhà hành chính và phục vụ khác 83

6.3.12 Phân xưởng điện cơ 83

6.3.13 Nhà để xe ôtô 83

6.3.14 Nhà để xe môtô cho cán bộ công nhân viên 83

6.3.15 Nhà ăn 83

6.3.16 Nhà vệ sinh 83

6.3.17 Đài chứa nước 84

6.3.18 Bể chứa nước ngầm 84

6.3.19 Bể xử lý nước thải 85

6.3.20 Bể xử lý chất thải rắn 85

6.3.21 Nhà bảo vệ 85

6.3.22 Máy phát điện 85

6.3.23 Phân xưởng lò hơi 85

6.3.24 Kho vật tư thiết bị 85

SẢN XUẤT ENZYME CELLULASE TỪ NẤM TRICHODEMA REESEI NUÔI TRÊN MÔI TRƯỜNG BÃ MÍA VÀ CÁM MÌ VỚI NĂNG SUẤT 2 TẤN/ THÁNG

Lời Mở Đầu

Hiện nay nguồn phế thải hữu cơ do các nhà máy công nghiệp chế biến thực phẩm thải ra là rất lớn như: rơm rạ, trấu, bã mía, cám gạo, agar…Các phế thải này có thành phần chính là cellulose Cellulose có thể bị thủy phân trong môi trường kiềm

hoặc axit Tuy nhiên việc phân hủy cellulose bằng phương pháp vật lý và hóa học rất

phức tạp, tốn kém và gây độc hại cho môi trường Trong khi đó, việc xử lý các chất thải hữu cơ chứa cellulose bằng công nghệ sinh học, đặc biệt sử dụng các enzyme cellulase ngoại bào từ vi sinh vật sẽ có nhiều ưu điểm về cả mặt kỹ thuật, kinh tế và môi trường Số lượng các loài vi sinh vật tham gia sinh tổng hợp enzyme cellulase có trong điều kiện tự nhiên rất phong phú Chúng thuộc nấm sợi, xạ khuẩn, vi khuẩn và trong một số trường hợp, các nhà khoa học còn thấy cả nấm men cũng tham gia qúa trình phân giải này

Vì vậy nếu ta sản xuất được một lượng enzyme cellulase lớn với mức chi phí thấp thì ta có thể tận dụng được nguồn phế thải lớn từ các nhà máy chế biến thực phẩm như: bã mía, trấu, rơm rạ, mạt cưa…góp phần vào bảo vệ môi trường và cung cấp một lượng lớn nguyên liệu cho nghành công nghiệp chế biến thực phẩm, nghành hóa được

phẩm Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác Chúng hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễcủa cây, một số giống có khả năng phát triển ngay trên rễ Những giống này có thể được bổ sung vào trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp Ngay khi chúng tiếp xúc với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống Các nhà khoa học đã thành công trong việc phân lập được chủng nấm

Trichoderma Reesei KY-746 để tổng hợp nên enzyme cellulase một cách có hiệu quả

nhất mà giá thành lại rẻ

Xuất phát từ thực tế này với sự hướng dẫn của Th.Đỗ Thị Hoàng Tuyến chúng tôi đã thực hiện đồ án này:

“Sản xuất enzyme cellulase từ nấm Trichidema reesei nuôi trên môi trường

bã mía và cám mì Với công suất 20 tấn/tháng “

CHƯƠNG 1: LẬP LUẬN KINH TẾ

Enzyme Cellulase là một sản phẩm mang lại nhiều lợi ích to lớn Trong khi đó trong nước ta chưa có nhà máy nào sản xuất loại sản phẩm này nuôi trên môi trường bã mía và cám gạo Đây là một lợi thế lớn để chúng tôi bắt tay vào việc xây dựng và sản xuất

Sự cần thiết phải đầu tư

Enzyme cellulase được sử dụng nhiều trong công nghiệp, chăn nuôi Nhưng

lượng enzyme chiết từ tự nhiên không đủ để sử dụng Hơn nữa sau khi sử dụng mía làm nguyên liệu sản xuất đường thì phần bã mía sẽ bị thãi ra môi trường nếu không được xử lý

sẽ làm ô nhiễm môi trường, và phần cám mì cũng chỉ bán lại cho sản xuất thức ăn chăn nuôi với giá thành khá rẻ Vì vậy đầu tư cho xây dựng một nhà máy sản xuất chế phẩm enzyme cellulase là cần thiết vì sẽ vừa cung cấp chế phẩm enzyme cho công nghiệp, vừa

xử lý được lượng chất của bã mía và tận dụng tốt nguồn cám mì

1.1 Đặc điểm tự nhiên

Nhà máy sẽ được đặt ở khu công nghiệp Biên Hòa 1 Đường số 1 – KCN Biên Hòa 1 – phường An Bình – Biên Hòa - Đồng Nai Gần các khu công nghiệp lớn là điều kiện thuận lợi cho phát triển nhà máy

Đồng Nai là tỉnh nằm trong khu vực miền Đông Nam Bộ của Việt Nam, vùng đất nối liền giữa Nam Bộ, cực nam Trung Bộ và nam Tây Nguyên Tỉnh Đồng Nai nằm

ở cực bắc miền Đông Nam Bộ

Khí hậu Đồng Nai là khí hậu nhiệt đới gió mùa cận xích đạo, có hai mùa tương phản nhau (mùa khô và mùa mưa) Mùa khô từ tháng 12 đến tháng 3 hoặc tháng 4 nămsau (khoảng 5 – 6 tháng), mùa mưa từ tháng 5 đến tháng 11 (khoảng 6 – 7 tháng) Khoảng kết thúc mùa mưa dao động từ đầu tháng 10 đến tháng 12

Nhiệt độ không khí trung bình hằng năm từ 25,7 – 26,70C Mức độ chênh nhau giữa các năm không lớn Chênh lệch nhiệt độ cao nhất giữa tháng nóng nhất và lạnh nhất là 4,20C

Nhiệt độ trung bình mùa khô từ 25,4 – 26,70C, chênh lệch giữa tháng cao nhất và tháng

thấp nhất là 4,80C Nhiệt độ trung bình mùa mưa từ 26 – 26,80C So với mùa khô, mức dao động không lớn, khoảng 0,80C Độ ẩm trung bình 80 – 82%

1.2 Vùng nguyên liệu

Nằm gần các nhà máy sản xuất đường Biên Hòa, cám mì có thể nhập từ Ấn

Độ, Trung Quốc, Indonesia, Sri Lanka phần lớn là dạng viên và ít hơn là dạng bột Đâylà nơi cung cấp nguồn nguyên liệu dồi dào nhất cho sản xuất

1.3 Hợp tác hóa

Nhà máy đặt tại khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai nên các điều kiện về hợp tác hóa giữa các nhà máy và các nhà máy khác rất thuận lợi và sử dụng chung các công trình công cộng như điện, nước, hệ thống thoát nước, giao thông … vvv Nhờ đó

sẽ giảm thiểu vốn đầu tư ban đầu

Nguồn cung cấp điện hơi và nhiên liệu

Khu công nghiệp Biên Hòa 1, Đồng Nai là khu công nghiệp lớn nên các vấn đề về điện, hơi nhiên liệu được đầu tư rất đáng kể Nhà máy sẽ sử dụng nguồn điện, hơi cósẵn tại khu công nghiệp

Nguồn cung cấp nước và vấn đề xử lí nước

Nguồn cung cấp nước cho nhà máy như nước của công ty cung cấp nước thành phố, hoặc cũng có thể sử dụng nguồn nước sông Đồng Nai, hoặc từ giếng khoan

… Ở đây ta chọn nhà máy nước Thiện Tân cung cấp 25.000 m3/ngày

Nước từ nhà máy đưa về đều được lắng, lọc, làm mền và xử lí ion trước khi sản xuất

Công suất nhà máy xử lý nước thải: 4000m3/ ngày (nước thải được dẫn qua xử

lý tại KCN Biên Hòa II)

1.4 Năng suất của nhà máy

Nhà máy được thiết kế theo năng suất đủ cung cấp cho nhu cầu sử dụng enzymecủa các doanh nghiệp trong khu vực.

− Năng suất enzyme được sản xuất ra trong ngày là 20 tấn/ngày.

1.5 Giao thông vận tải :

Cách trung tâm thành phố Hồ Chí Minh khoảng 30 km

− Cách ga Sài gòn 30 km.

− Cảng Đồng Nai 2 km, Tân cảng 25 km, cảng Sài Gòn 30 km, cảng Phú Mỹ 44 km.

− Cách Sân bay Quốc tế Tân Sơn Nhất: 30 km.

Do đó thuận lợi cho việc vận chuyển nguyên liệu sản phẩm Kênh vận chuyển

đa dạng với đường sắt, đường bộ, đường thủy, đường hàng không là điều kiện rất thuậnlợi về giao thông

1.6 Nhân công và thị trường tiêu thụ :

Khu công nghiệp Biên Hòa 1 có nguồn nhân công dồi dào từ các tỉnh thành đỗ về Từ đó có thể thuê nhân công với giá rẻ Thị trường tiêu thụ được chọn là thị trường cho cả nước

Nguồn tiêu thụ sản phẩm

Nguồn tiêu thụ cho sản phẩm ở đây chủ yếu hướng vào các công ty chế biến dược phẩm, các công ty chế biến thức ăn gia súc, các công ty phân bón …

Kết luận : Tất cả các điều kiện trên là cơ sở thuận lợi, có tính khả thi để xây

dựng nhà máy sản xuất enzyme cellulose tại khu công nghiệp Biên Hòa 1

CHƯƠNG 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Tổng quan về enzyme cellulase.

− Định nghĩa: Cellulase là một phức hệ enzyme xúc tác thủy phân cellulose thành

cellobiose và cuối cùng là glucose Thuỷ phân cellulose thông qua việc thuỷ phân liên kết 1,4-β-glucoside trong cellulose

− Phân loại: Cellulase là enzyme đa cấu tử gồm endo-β-1,4-glucanase, exoglucanase,

và β-glucosidase hoạt động phối hợp để thủy phân cellulose thành glucose

Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên trong phân tử cellulose tạo ra các loại

oligosaccharide có chiều dài khác nhau Exoglucanase thủy phân các liên kết ở đầu khửvà đầu không khử của chuỗi cellulose để giải phóng ra glucose (glucanohydrolase) hoặc cellobiose (cellobiohydrolase)

EC 3.2.1.74

2.1.1 Cơ chế thuỷ phân cellulose của enzyme cellulase.

− − Endocellulase: xúc tác quá trìnhcắt liên kết α-1,4- glucoside trong cellulose, lignin và α-Dglucan một cách ngẫu nhiên Sản phẩm của quá trình phân giải là các cellulose phân

tử nhỏ, cellobiose và glucose

− Exocellulase: cắt 2 hoặc 4 đơn vị

glucose từ đầu không khử của chuỗicellulose tạo thành các cellobiose (disaccharide) và một số

cellotetrose

− Cellobiase: tham gia phân giải cellobiose (disaccharide) và cellotetrose thành

glucose

2.1.2 Ứng dụng của enzyme cellulase.

2.1.2.1 Cellulase với công nghiệp thực phẩm

Cellulase là thành phần cơ bản của tế bào thực vật, vì vậy nó có mặt trong mọi loạirau quả cũng như trong các nguyên liệu, phế liệu của các ngành trồng trọt và lâm nghiệp.Nhưng người và động vật không có khả năng phân giải cellulose Nó chỉ có giá trị làmtăng tiêu hóa, nhưng với lượng lớn nó trở nên vô ích hay cản trở tiêu hóa Chế phẩmcellulase thường dùng để:

+ Tăng chất lượng thực phẩm và thức ăn gia súc

+ Tăng hiệu suất trích ly các chất từ nguyên liệu thực vật

Ứng dụng trước tiên của cellulase đối với chế biến thực phẩm là dùng nó để tăng

độ hấp thu, nâng cao phẩm chất về vị và làm mềm nhiều loại thực phẩm thực vật Đặcbiệt là đối với thức ăn cho trẻ con và nói chung chất lượng thực phẩm được tăng lên.+ Một số nước đã dùng cellulase để xử lý các loại rau quả như bắp cải, hành, cà rốt,khoai tây, táo và lương thực như gạo Người ta còn xử lý cả chè, các loại tảo biển…

+ Trong sản xuất bia, dưới tác dụng của cellulase hay phức hệ citase trong đó cócellulase, thành tế bào của hạt đại mạch bị phá hủy tạo điều kiện tốt cho tác động củaprotease và đường hóa

+ Trong sản xuất agar-agar, tác dụng của chế phẩm cellulase sẽ làm tăng chấtlượng agar-agar hơn so với phương pháp dùng acid để phá vỡ thành tế bào Đặc biệt làviệc sử dụng chế phẩm cellulase để tận thu các phế liệu thực vật đem thủy phân, dùnglàm thức ăn gia súc và công nghệ lên men Những ứng dụng của cellulase trong côngnghiệp thực phẩm đã có kết quả rất tốt Tuy nhiên hạn chế lớn nhất là rất khó thu đượcchế phẩm có cellulase hoạt độ cao

2.1.2.2 Trong công nghiệp sản xuất giấy và bột giấy

Trong công nghiệp sản xuất bột giấy và giấy, bổ sung các loại enzyme trong khâunghiền bột, tẩy trắng có vai trò rất quan trọng Nguyên liệu ban đầu chứa hàm lượngcao các chất khó tan là lignin và một phần hemicellulose, nên trong quá trình nghiền đểtách riêng các sợi gỗ thành bột mịn gặp nhiều khó khăn Trong công đoạn nghiền bột

giấy, bổ sung endoglucanase sẽ làm thay đổi nhẹ cấu hình của sợi cellulose, tăng khảnăng nghiền và tiết kiệm khoảng 20% năng lượng cho quá trình nghiền cơ học Trướckhi nghiền hóa học, gỗ được xử lý với endoglucanase và hỗn hợp các enzymehemicellulase, pectinase sẽ làm tăng khả năng khuếch tán hóa chất vào phía trong gỗvà hiệu quả khử lignin.

2.1.2.3 Trong công nghiệp dệt

Trong công nghiệp dệt, người ta sử dụng enzyme cellulase để giữ màu vải sáng, bền vàkhông bị sờn cũ Đối với vải jean, cellulase được dùng để làm mềm vải jean và tạo ra các vệt “stone washed” Trước đây các vệt “stone washed” được làm thủ công bằng cách dùng đá bọt chà lên vải jean, làm mất lớp kiềm trên bề mặt vải và tạo ra những sợichỉ trắng Hiện nay người ta sử dụng enzyme cellulase trong giai đoạn giặt vải jean thay cho việc sử dụng đá bọt Enzyme cellulase chỉ phân hủy theo các vết kiềm trên vảijean đã nhuộm màu để tạo ra các vệt “stone washed” Các vệt “stone washed” được tạo

ra bằng phương pháp này bền hơn bằng cách dùng đá bọt Ngoài ra , người ta có thể tăng độ đậm nhạt của các vệt này bằng cách tăng hay giảm lượng cellulase sử dụng trong giai đoạn giặt

2.1.2.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi

Trong chăn nuôi (với động vật ăn cỏ) nếu thức ăn có trộn thêm cellulose sẽ tăng sựtiêu hóa hấp thụ thức ăn cho động vật - đặc biệt động vật còn non, do đó sẽ giảm chiphí thức ăn cho động vật và chúng sẽ tăng trọng nhanh hơn

2.1.2.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu cơ

Trong giai đoạn đường hóa của quá trình sản xuất ethanol, amylase là thành phầnchính trong quá trình thủy phân tinh bột Tuy nhiên, bổ sung một số enzyme phá hủythành tế bào như cellulase, hemicellulase có vai trò quan trọng, giúp tăng lượng đườngtạo ra và đẩy nhanh tốc độ tiếp xúc của tinh bột với amylase, dẫn tới hiệu suất thu hồirượu tăng lên 1,5%

2.1.2.5 Trong công nghệ xử lý rác thải và sản xuất phân bón vi sinh

Các chất thải hữu cơ chiếm một khối lượng rất lớn trong tổng số chất thải hữu

cơ hiện nay ở các đô thị và các khu công nghiệp Trong các chất thải hữu cơ có nguồn gốc thực vật, cellulose chiếm khoảng 50% Các chất thải hữu cơ chứa cellulose thường là những chất rất khó phân hủy trong điều kiện tự nhiên Nếu để các chất hữu cơ phân hủy trong điều kiện tự nhiên thì thời gian phân hủy rất lâu (khoảng hơn tám tháng ở điều kiện khí hậu nhiệt đới); tuy nhiên nếu bổ sung vi sinh vật giàu cellulase thì thời gian phân hủy sẽ rút ngắn chỉ còn khoảng một tháng Điều này rất có ý nghĩa trong việc

bảo vệ môi trường (hạn chế sự ô nhiễm nước, không khí và đất) đồng thời thúc đẩy quá

qua trình chuyển hóa trong tự nhiên

Ngoài việc bổ sung trực tiếp vi sinh vật vào bể ủ để xử lý rác thải thì việc tạo ra

các chế phẩm vi sinh có chứa các vi sinh vật sinh ra cellulase đã được nghiên cứu và sản xuất

Phức hệ cellulase được sử dụng để xử lý nguồn nước thải do các nhà máy giấy

thải ra Nguyên liệu làm giấy là gỗ (sinh khối của thực vật bậc cao) Sinh khối này chứa rất nhiều loại polysaccharide, trong đó các polysaccharide quan trọng quyết định tới chất lượng, số lượng giấy là cellulose Vì vậy, nước thải của các nhà máy giấy, các

cơ sở chế biến gỗ, các xưởng mộc khi bổ sung các chế phẩm chứa phức hệ cellulase đem lại hiệu quả cao

2.1.3 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam và trên thế giới

2.1.3.1 Tình hình sản xuất enzyme cellulase ở Việt Nam [13]

Ở Việt Nam chưa có một chế phẩm enzyme cellulase nào được sản xuất chủ động

từ những nguồn nguyên liệu trong nước Việc sản xuất chỉ mới dừng lại ở việc nghiêncứu nên nhu cầu enzyme chủ yếu là nhập khẩu từ nước ngoài

Năm 1999, Nguyễn Đức Lượng và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

cellulase từ Astinomyces griseus.

Năm 1999, Lý Kim Bảng và cộng sự đã xây dựng quy trình công nghệ sản xuất

Năm 2003, Hoàng Quốc Khánh và cộng sự đã nghiên cứu khả năng sinh tổng hợp

và đặc điểm cellulase từ chủng Aspergillus niger.

2.1.3.2 Tình hình sản xuất enzyme cellulase trên thế giới

Ở Nhật Bản, theo Yamada (1977), có khoảng 48 tấn cellulase được sản xuất từ Tr Viride và Asp Niger.

Ở Mỹ, phòng thí nghiệm của quân đội Mỹ và trường đại học Rusgers đầu tiên sửdụng chủng T.viride hoang dại để sản xuất cellulase sau đó gây đột biến và chọn lọcđược biến chủng QM 9414 có khả năng sinh tổng hợp cellulase cao

Ở Pháp, hãng Lyven sản xuất cellulase từ Tr Reesei và Asp Niger sử dụng trong

công nghệ thực phẩm

Ở Canada, hãng Logene sản xuất cellulase sử dụng trong thức ăn gia súc, côngnghiệp giấy, sản xuất ethanol

Ở Nhật Bản, hãng Nagada, Amano… hằng năm đã sản xuất đến 8000 tấn enzymecác loại để dùng trong nông nghiệp

2.2 Giới thiệu về Trichoderma reesei.

2.2.1 Lịch sử nghiên cứu của Trichoderma reesei.

Gần 200 năm về trước, Trichoderma được phát hiện ra và hiện nay loài đó được biết là Trichodermaviride Hơn 150 năm sau, Trichoderma chỉ là đối tượng của vài nhà

phân loại nấm học nhưng không hấp dẫn được mối quan tâm của các ngành khoa họckhác Tình hình thay đổi trong thế chiến lần thứ II, khi quân đội Mỹ cảnh báo về hiệntượng các trang bị quân sự bị mục ở xứ nhiệt đới, đặc biệt là ở Nam Thái Bình Dương

Chương trình điều tra của quan đội Mỹ chỉ ra rằng Trichoderma"viride" mã số QM

6a là loài nấm phân hủy cellulose ở khu vực này

Sự nhầm lẫn này kéo dài suốt 20 năm cho đến khi chủng Trichoderma QM 6a này được nhận diện và đặt tên lại là Trichoderma reesei để tỏ lòng tôn kính người

đã khám phá ra loài này là Elwyn T.Reese, tác giả làm việc tại viện nghiên cứu Natick

với sự cộng tác của Mary Mandels đã nghiên cứu nhiều đề tài về sinh tổng hợp, cơ chế

phân hủy cellulose và các hợp chất polysaccharides khác của chủng Trichoderma reesei này và các thể đột biến trên chủng đó.

Nhờ những công trình đó mà nhiều phòng thí nghiệm khác ở Mỹ, Châu Âu vàChâu Á tiếp tục nghiên cứu và khám phá ra hệ thống phân giải cellulose của

Trichoderma vào cuối thập niên 60 Cùng thời điểm đó, Rifai và Webster ở Anh lần đầu tiên phân loại và mô tả được 9 loài Trichoderma, việc nuôi cấy dể dàng và không tốn kém các chủng Trichoderma đã lôi kéo các nhà nghiên cứu đi vào các hướng

nghiên cứu cơ bản hơn là nghiên cứu ứng dụng về phân giải cellulose của chúng Một

phát hiện quan trọng trong nghiên cứu về Trichoderma là khả năng kích thích tăng

trưởng cho cây trồng và khả năng đối kháng với các loài nấm bệnh

giúp Trichoderma được dùng như là tác nhân kiểm soát sinh học trong nông nghiệp.

Ngày nay, lĩnh vực này đã trở thành hướng nghiên cứu của nhiều nhà khoa học trên thếgiới

Hình 2.1 Ảnh nhìn qua kính hiển vi về những sợi tơ phát triển của dòng nấm

Trichoderma reesei.

Trong hình, các protein trong các tế bào nấm được đánh dấu màu đỏ trong khi chấtchitin – một thành phần của các thành tế bào – được đáng dấu màu xanh dương (Ảnh:

Mari Valkonen, VTT Finland)

2.2.2 Nuôi cấy Trichoderma reersei trên môi trường bã mía kết hợp cám mì.

Trichoderma reesei VTT-D-80133 sinh trưởng trên môi trường bán rắn với cơ

chất bã mía kết hợp với cám mì Tỷ lệ BM:CM (7:3), 8 lần nồng độ dinh dưỡng, độ ẩm

ban đầu 60%, thời gian nuôi cấy 7 ngày là tối ưu cho Trichoderma reesei

VTT-D-80133 sinh tổng hợp cellulase trên môi trường lên men bán rắn

2.2.3 Hình thái của Trichoderma reesei.

Trichoderma là một loài nấm bất toàn, sinh sản vô tính bằng đính bào tử từ

khuẩn ty Khuẩn ty của vi nấm không màu, cuống sinh bào tử phân nhánh nhiều, ở cuốinhánh phát triển thành một khối tròn mang các bào tử trần không có vách ngăn, khôngmàu, liên kết nhau thành chùm nhỏ ở đầu cành nhờ chất nhầy Bào tử hình cầu, hìnhelip hoặc hình thuôn Khuẩn lạc nấm có màu trắng hoặc từ lục trắng đến lục, vàngxanh, lục xỉn đến lục đậm

Hình 2.2 Hình thái Trichoderma reesei

2.2.4 Đặc Điểm

Nấm Trichoderma spp hiện diện gần như trong tất cả các loại đất và trong một

số môi trường sống khác, chúng là loại nấm được nuôi cấy thông dụng nhất Nấm

Trichoderma hiện diện với mật độ cao và phát triển mạnh ở vùng rễ của cây, một số

giống có khả năng phát triển ngay trên rễ, những giống này có thể được bổ sung vào

trong đất hay hạt giống bằng nhiều phương pháp Nấm Trichoderma khi chúng tiếp xúc

với rễ, chúng phát triển trên bề mặt rễ hay vỏ rễ phụ thuộc vào từng giống Vì vậy, khiđược dùng trong xử lý hạt giống, những giống thích hợp nhất sẽ phát triển trên bề mặt

rễ ngay cả khi rễ phát triển dài hơn 1m phía dưới mặt đất và chúng có thể tồn tại và cònhiệu lực cho đến 18 tháng sau khi sử dụng, tuy nhiên không nhiều giống có khả năngnày

Ngoài sự hình thành khuẩn lạc trên rễ, nấm Trichoderma còn tấn công, ký sinh và lấy chất dinh dưỡng từ các loài nấm khác Bởi vì nơi Trichoderma phát triển tốt nhất là nơi có nhiều rễ khỏe mạnh, và Trichoderma sở hữu nhiều cơ chế cho việc tấn công

các loài nấm gây bệnh cũng như cơ chế cho việc nâng cao sự sinh trưởng và phát triểncủa cây Nhiều phương pháp mới trong kiểm soát sinh học và nâng cao sự sinh trưởngcủa cây hiện nay đã được chứng minh rõ ràng Quá trình này được điều khiển bởi nhiềugen và sản phẩm từ gen khác nhau Sau đây là một số cơ chế chủ yếu: Ký sinh nấm,kháng sinh, cạnh tranh chất dinh dưỡng và không gian, sự chịu đựng các điều kiện bấtlợi bằng việc gia tăng sự phát triển của cây và rễ, làm hòa tan và cô lập chất dinhdưỡng vô cơ, cảm ứng sự kháng bệnh, bất hoạt enzyme gây bệnh

Hầu hết các giống Trichoderma không sinh sản hữu tính mà thay vào đó là cơ

chế sinh sản vô tính Tuy nhiên, có một số giống sinh sản hữu tính đã được ghi nhậnnhưng những giống này không thích hợp để sử dụng trong các phương pháp kiểm soátsinh học Phương pháp phân loại truyền thống dựa trên sự khác nhau về hình thái chủyếu là ở bộ phận hình thành bào tử vô tính, gần đây nhiều phương pháp phân loại dựa

trên cấu trúc phân tử đã được sử dụng Hiện nay nấm Trichoderma có ít nhất là 33 loài.

Hình 2.3 Cấu trúc không gian của nấm Trichoderma reesei

2.2.5 Ứng dụng

2.2.5.1 Lương thực và ngành dệt

Trichoderma là những vi sinh vật sản xuất nhiều enzyme ngoại bào có hiệu quả

cao Chúng được thương mại hóa trong việc sản xuất enzyme cellulase và các enzyme khác phân hủy các polysaccharide phức tạp Nhờ vậy chúng thường được sử dụng trong công nghiệp chế biến thực phẩm và ngành công nghiệp dệt cho các mục đích tương tự

2.2.5.2 Chất kiểm soát sinh học

Hiện nay loài nấm này đã được sử dụng một cách hợp pháp cũng như được đăng

ký trong việc kiểm soát bệnh trên thực vật Các chế phẩm nấm Trichoderma được sản

xuất và sử dụng như là chất kiểm soát sinh học một cách có hiệu quả Hình thức sửdụng dưới dạng chế phẩm riêng biệt hoặc được phối trộn vào phân hữu cơ để bón chocây trồng vừa cung cấp dinh dưỡng cho cây vừa tăng khả năng kháng bệnh của cây

2.2.5.3 Kích thích sự tăng trưởng của cây trồng

Những lợi ích mà những loài nấm này mang lại đã được biết đến từ nhiều nămqua bao gồm việc kích thích sự tăng trưởng và phát triển của thực vật do việc kíchthích sự hình thành nhiều hơn và phát triển mạnh hơn của bộ rễ so với thông thường.Những cơ chế giải thích cho các hiện tượng này chỉ mới được hiểu rõ ràng hơn trong

thời gian gần đây Hiện nay, một giống nấm Trichoderma đã được phát hiện là chúng

có khả năng gia tăng số lượng rễ mọc sâu (sâu hơn 1 m dưới mặt đất) Những rễ sâunày giúp các loài cây như: bắp hay cây cảnh có khả năng chịu được hạn hán

Một khả năng có lẽ đáng chú ý nhất là những cây bắp có sự hiện diện của nấm

Trichoderma dòng T22 ở rễ có nhu cầu về đạm thấp hơn đến 40% so với những cây

không có sự hiện diện của loài nấm này ở rễ

2.2.5.4 Nguồn gen để sử dụng trong chuyển gen

Nhiều vi sinh vật kiểm soát sinh học đều có chứa một số lượng lớn gen mã hoácác sản phẩm có hoạt tính cần thiết sử dụng trong kiểm soát sinh học Nhiều gen có

nguồn gốc từ Trichoderma đã được tạo dòng và có tiềm năng ứng dụng rất lớn trong

chuyển gen để tạo ra cây có khả năng kháng được nhiều bệnh Chưa có gen nào đượcthương mại hóa, tuy nhiên có một số gen hiện đang được nghiên cứu và phát triển

2.2.5.5 Biện pháp canh tác hữu cơ

Hiện nay, việc bón phân hữu cơ cho cây cao su hầu như chưa được bà con nôngdân chú trọng dẫn đến mất cân bằng sinh thái môi trường đất Hệ vi sinh vật suy giảm

đã làm cho nấm bệnh, đặc biệt là nấm Corynespora cassiicola có điều kiện phát triển

và phát tán rất nhanh trong mùa mưa

Vì vậy, việc bón phân hữu cơ là một trong những giải pháp quan trọng cần đượcquan tâm thúc đẩy Trong khi bệnh vàng lá, rụng lá đang có chiều hướng lây lan nhanh

việc bón phân hữu cơ có chứa nấm đối kháng Trichoderma là một giải pháp rất hữu

hiệu Ngoài việc giúp cho bộ rễ cây phát triển, đất giữ ẩm tốt, đồng thời nấm đối kháng

Trichoderma sẽ tấn công các mầm bệnh corynespora và các loai nấm bệnh khác có

trong đất

Việc phun các chế phẩm sinh học có chứa Trichoderma lên tán cây cũng là một

giải pháp rất tốt nhằm đưa các bào tử nấm đối kháng phát tán rộng rãi trong môi trườngcủa vườn cao su tạo nên một hệ thống phòng thủ hữu hiệu lâu dài

Qua nhiều kết quả thực tiễn cho thấy, nấm Trichoderma giết nhiều loại nấm gây thối rễ chủ yếu như: Pythium, Rhizoctonia và Fusarium, do vậy nấm Trichoderma đã

được khuyến cáo sử dụng rộng rãi trong sản xuất nông nghiệp công nghệ cao ở tỉnhLâm Đồng những năm qua

2.3 Sơ lược về enzyme cellulase thu nhận từ Trichoderma reesei

Cellulase là nhóm enzyme thủy phân có khả năng cắt mối liên kết β -1, glucoside trong phân tử cellulose và một số cơ chất tương tự khác Đó là một phức hệ gồm nhiều loại enzyme khác nhau và được xếp thành 3 nhóm cơ bản: endo-β-1, 4-glucanase hay carboxymethyl cellulase (CMCase) (EC 3.2.1.4), exo-β-1, 4-glucanase hay cellobiohydrolase (EC 3.2.1.91) và β-glucosidase hay β-D-glucoside

4-O-glucohydrolase (EC 3.2.1.21)

Mỗi loại enzyme tham gia thủy phân cơ chất theo một cơ chế nhất định và nhờcó sự phối hợp hoạt động của các enzyme đó mà phân tử cơ chất được thủy phân hoàntoàn tạo thành các sản phẩm đơn giản nhất

Hình 2.7 Cấu trúc không gian của enzyme cellulase

2.3.1 Tính chất hóa lý của enzyme cellulase

Tùy thuộc vào cấu trúc và nguồn gốc của enzyme, hoạt tính enzyme đạt mạnhnhất ở nhiệt độ, pH nhất định

 Ảnh hưởng của nhiệt độ: vận tốc phản ứng do enzyme xúc tác chỉ tăng lên khităng nhiệt độ trong một giới hạn nhất định, chưa ảnh hưởng đến cấu trúcenzyme Hoạt tính enzyme đạt cực đại ở nhiệt độ thích hợp, khoảng nhiệt độthích hợp của nhiều enzyme vào khoảng 40-500C Ở nhiệt độ cao, enzyme bịbiến tính làm hoạt tính giảm mạnh hoặc mất hoạt tính, còn ở nhiệt độ thấp dưới

00C, hoạt tính enzyme bị giảm nhiều nhưng lại có thể phục hồi khi đưa về nhiệt

độ thích hợp Hoạt tính của enzyme cellulase từ Trichoderma reesei đạt tối đa ở

550C

 Ảnh hưởng của pH: Khả năng hoạt động của enzyme còn phụ thuộc vào pH môitrường phản ứng Tùy thuộc vào bản chất của enzyme mà pH thích hợp đểenzyme hoạt động có thể trung tính, kiềm hoặc acid Theo nghiên cứu trước đây

cho thấy, pH tối ưu cho hoạt động của cellulase từ Trichoderma reesei là

4,0-5,0

 Ảnh hưởng của ion kim loại: Các ion kim loại có thể kìm hãm hoặc hoạt hóa sựhoạt động của các enzyme Các ion kim loại nặng ở nồng độ nhất định có thểgây biến tính và kìm hãm không thuận nghịch enzyme

 Ngoài ra, các dung môi hữu cơ, các chất tẩy rửa cũng ảnh hưởng mạnh mẽ đếnhoạt tính của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các chất trên cũng như bảnchất của enzyme mà tính chất và mức độ ảnh hưởng tới hoạt động của enzymelà khác nhau Các dung môi hữu cơ methanol, ethanol, isopropanol và acetoneđều ức chế hoạt động của cellulase, đặc biệt là n-butanol ức chế mạnh nhất, hoạttính cellulase chỉ còn 33-63% Các chất tẩy rửa tween 20, tween 80, SDS vàtriton X-100 đều làm giảm hoạt tính cellulase ở mức độ khác nhau, trong đóSDS làm giảm mạnh hoạt tính cellulase chỉ còn 18-34%

2.3.2 Các nguồn thu nhận enzyme

Hiện nay trên thế giới có 3 nguồn để thu nhận enzyme là từ thực vật, động vật và vi sinh vật Do những ưu điểm nổi bật về tốc độ sinh trưởng, sinh sản và phát triển mà nguồn vi sinh vật được quan tâm nhiều hơn Mặt khác, do kích thước vi sinh vật nhỏ nên ta có thể cơ giới hóa và tự động hóa trong quá trình nuôi cấy, điều kiện nuôi cấy vi sinh vật có thể kiểm soát được mà không phụ thuộc vào yếu tố bên ngoài như thu enzym từ nguồn thực vật và động vật

Có 2 phương pháp để nuôi cấy vi sinh vật tạo enzyme là nuôi cấy bề mặt và nuôi cấy bề sâu Mỗi phương pháp có ưu và nhược điểm riêng, tuy nhiên ngày nay phương pháp nuôi cấy bề sâu ngày càng được ứng dụng rộng rãi do khả năng cơ giới hóa và tự động hóa

2.3.3 Phương pháp nuôi cấy bề mặt

Nuôi cấy nấm mốc và một số vi khuẩn theo phương pháp bề mặt để sản xuấtenzyme thường dùng môi trường rắn, đôi khi dùng môi trường lỏng

Môi trường rắn thường là các nguyên liệu tự nhiên: cám mì, cám gạo, ngô mảnh,bột đậu tương,… Môi trường lỏng thường là các dịch rỉ đường, dịch thủy phân từ thócmầm, nước bã rượu… có thêm muối khoáng Môi trường lỏng ít dùng để nuôi cấy nấmmốc theo phương pháp này

- Ưu điểm của phương pháp này:

+ Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ không phức tạp

+ Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều sovới nuôi cấy chìm

+ Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

+ Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hànhcông nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém

+ Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

- Tuy nhiên phương pháp này có những nhược điểm:

+ Chỉ có thể nuôi cấy gián đoạn

+ Tốn nhiều diện tích cho quá trình nuôi cấy

2.3.4 Thành phần môi trường nuôi cấy vi sinh vật cellulase

2.3.4.1 Nguồn Cacbon

Trong môi trường nuôi cấy nấm sợi sinh enzyme cellulase nhất thiết phải có cellulose là chấtcảm ứng và nguồn cacbon Nấm sợ có khả năng đồng hóa rất nhiều cacbon khác nhau Nguồncacbonhydrat là dễ hấp thu nhất, trong đó glucose là nguồn cacbon duy nhất tham gia vào phảnứng trong ba chu trình chuyển hóa: con đường Embden Meyerhof (1930), Pentose và EntnerDoudorff Cơ chất dùng để cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase thường là giấylọc ,bông,bột cellulose,cám , lõi ngô, mùn cưa, bã mía, trấu, rơm,than bùn Các chủng

Trichoderma nuôi trên môi trường có nguồn cacbon là giấy lọc cho hoạt tính enzyme cao nhất.

Ngày nay, bã mía được dùng như một chất cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase

2.3.4.2 Nguồn Nitơ

Các nguồn nitơ vô cơ thích hợp nhất đối với các sinh vật sinh cellulase là muối

nitrat Đối với các giống của bộ nấm bông (Hyphomycetates) nguồn nitơ tốt nhất lại là

(NH4)2HPO4 Nói chung các muối amon ít tác dụng nâng cao hoạt lực enzyme này,thậm chí còn ức chế quá trình tổng hợp, vì rằng môi trường trong các muối này làmcho môi trường acid hóa Điều này không những ức chế trong quá trình sinh tổng hợpenzyme mà còn có thể làm mất hoạt tính enzyme sau khi tạo thành

Natri nitrat làm cho môi trường kiềm hóa, tạo điều kiện thuận lợi cho sự tạo thànhcellulase Các hợp chất nitơ hữu cơ có tác dụng khác nhau đến sinh tổng hợp cellulase.Điều này phụ thuộc vào điều kiện sinh lý của từng chủng giống Cao ngô và cao nấmmen có tác dụng nâng cao hoạt lực cellulase của vi sinh vật, nhưng với cao ngô khảnăng sinh tổng hợp C1 – và C2 – cellulase cao hơn so với cao nấm men

2.3.4.3 Nguồn khoáng chất

Những nguyên tố khoáng (Fe, Mn, Zn, B, Mo, Cu,…) có ảnh hưởng rõ rệt đến khảnăng tổng hợp cellulase của vi sinh vật Zn, Mn, Fe có tác dụng kích thích tạo thànhenzyme này ở nhiều chủng Nồng độ tối thích của Zn là 0,11 – 22 mg/l, sắt 2 – 10 mg/l,Mn: 3,4 – 27,2 mg/l.

2.3.4.4 Chất kích thích sinh trưởng

Biotin và tiamin trong môi trường dinh dưỡng không có ảnh hưởng đến sinh tổnghợp enzyme này

2.3.5 Môi trường sinh tổng hợp enzyme

Môi trường nuôi nấm mốc để sinh tổng hợp enzyme cellulase bằng phương pháp bề mặtvới nguyên liệu chủ yếu là bã mía kết hợp cám mì, các chất khoáng cần thiết và một số chấtkhác Ngoài ra trong môi trường còn sử dụng trấu để tăng độ xốp của môi trường

Tỷ lệ thành phần môi trường tính theo lượng chất khô tuyệt đối như sau:

2.3.6 Một số lưu ý trong sinh tổng hợp enzyme cellulase

- Nhiều nhà nghiên cứu cho biết cellulose là nguồn cơ chất thích hợp nhất đối vớisự tổng hợp cellulase Rõ ràng đây là sự tổng hợp mang tính chất cảm ứng mà celluloselà “chất cảm ứng” Do đó nồng độ của nó trong môi trường nuôi sẽ có ảnh hưởng lớnđến năng suất của quá trình nuôi cấy

- Một số chất có tác dụng ức chế sinh tổng hợp cellulase như glucose, succinat,citrat, các sản phẩm trung gian của chu trình kreb…

- Cao nấm men, cao bắp, pepton có thể là chất tăng sinh tổng hợp cellulase ở một sốchủng vi sinh vật Một số acid amin như: aspartic, valin…tăng cường tổng hợp cellulase

- Nguyên tố vi lượng cần thiết cho sự tổng hợp cellulase như: Fe, Mn, Zn, Co,

….pH thích hợp cho tổng hợp cho đa số nấm tích tụ cellulase là 4,6 Nhiệt độ thích hợpcho tổng hợp cellulase là 28 ¿ 30oC Đa số cellulose chịu nhiệt độ cao, enzyme chịuđược 90 ¿ 1000C trong vài phút như cellulose của Tricoderma viride, khi nâng lên

1000C/5 phút hoạt tính vẫn giữ được 96%

2.4 Tổng quan về bã mía.

Ngày nay, bã mía được dùng như một cơ chất cảm ứng nấm sợi sinh enzyme cellulase.Trên thế giới, lượng bã mía thải ra rất lớn khoảng 150 triệu tấn/ năm Ở Việt Nam,Bãmía phần lớn dùng để đốt lò hơi,làm phân bón hữu cơ,bột giấy, trồng nấm ăn Tuynhiên, không sử dụng hết và đã gây ôi nhiễm cho môi trường xung quanh Bã mía cóhàm lượng cellulase rất cao hơn 40% ( theo A.G.Keller,1964 là 46%) ngoài ra cònchứa:

 Bã mía chiếm 25-30% trọng lượng mía đem ép Trong bã mía chứa trung bình 49%là nước, 48% là xơ (trong đó chứa 45-55% cellulose) 2,5% là chất hoà tan (đường)

 Hemicellulose: 30%

 Hàm lượng lignin trong bã mía khá lớn với chiếm khoảng 20% khối lượng nguyênliệu Lignin vốn là một thành phần khó phân hủy thường gây ảnh hưởng đến sựphát triển của vi sinh vật

2.5 Tổng quan về cám mì.

Thành phần chính của cám mì

Chất khoáng có trong cám mì

Amino axit cám mì

Cám mì thường được sử dụng với tỉ lệ (6:4) do nó có chứa đầy đủ các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự sinh trưởng và sinh tổng hợp enzyme của nấm sợi, có tính chất vật lý rất thích hợp để vừa đảm bảo khối kết dính cần thiết, vừa đảm bảo lượng dinh dưỡng cần thiết

Chương 3: CHỌN VÀ THUYẾT MINH DÂY CHUYỀN

CÔNG NGHỆ

3.1 Chọn dây chuyền công nghệ

Trong công nghiệp sản xuất enzyme hiện nay có hai phương pháp: phương phápnuôi cấy bề mặt và phương pháp nuôi cấy bề sâu

So sánh hai phương pháp ta thấy phương pháp nuôi cấy bề mặt có những ưu điểm sau:

- Nuôi bề mặt rất dễ thực hiện, quy trình công nghệ không phức tạp

- Lượng enzyme được tạo thành từ nuôi cấy bề mặt thường cao hơn rất nhiều sovới nuôi cấy chìm

- Chế phẩm enzyme thô sau khi thu nhận rất dễ sấy khô và bảo quản

- Nuôi cấy bề mặt không cần sử dụng nhiều thiết bị phức tạp, do đó việc vận hànhcông nghệ cũng như đầu tư ban đầu vừa đơn giản vừa không tốn kém

- Trong trường hợp bị nhiễm vi sinh vật lạ rất dễ xử lý

- Trong kĩ thuật nuôi cấy bề mặt có hai loại môi trường nuôi cấy, đó là môi trường bánrắn và môi trường lỏng Ở môi trường lỏng thì vi sinh vật sẽ phát triển trên bề mặt dung dịchlỏng nơi phân cắt giữa pha lỏng và pha khí Khi đó các tế bào vi sinh vật sẽ tạo thành nhữngván phủ kín bề mặt dung dịch lỏng Enzyme sẽ được tổng hợp trong tế bào và thoát khỏi tếbào vào trong dung dịch nuôi cấy Do đó việc thu nhận enzyme thô trong dịch nuôi cấy cũngrất đơn giản Tuy nhiên phương pháp nuôi cấy này tỏ ra không hiệu quả vì hoạt lực củaenzyme thu nhận được của phương pháp này không cao bằng nuôi cấy trên môi trường bánrắn Một mặt phương pháp này vi sinh vật phát triển chủ yếu trên bề mặt nên hệ sử dụngmôi trường nuôi cấy không cao Vì vậy phương pháp này ít được dùng

Chính vì những lý do trên mà tôi quyết định chọn phương pháp nuôi cấy bề mặttrên môi trường bán rắn với dây chuyền công nghệ như sau:

Nhân giống sản xuất Làm nguội33 - 340C

Thanh trùng khayPhân phối vào khay nuôi

Nuôi cấy 28 – 320C, 7 ngày, w = 60%

Thu nhận chế phẩm (W: 60%) enzyme

Trích lyBã

Chủng Trichoderma reesei

Làm sạch, định lượng

3.2 Thuyết minh dây chuyền công nghệ

+ Cách tiến hành: Phân loại và làm sạch bằng thiết bị phân loại mảnh có kíchthước khác nhau

- Nghiền, định lượng

+ Mục đích: Tạo kích thước thích hợp đồng thời phá vỡ một phần các cấu trúc đạiphân tử để quá trình lên men được tiến hành thuận lợi hơn

+ Cách tiến hành: Bã mía nhập vào kho bảo quản chờ sản xuất Khi sản xuất, bã mía từkho chuyển đến máy nghiền tán để nghiền đến mức độ công nghệ yêu cầu

3.2.1.2 Nguyên liệu trấu

- Mục đích: Bổ sung trấu với mục đích tạo độ tơi xốp và tránh nguyên liệu bị kết dính

- Cách tiến hành: Trấu từ kho chứa được đưa đi làm sạch, sau đó được gàu tảichuyển lên bunke định lượng, và từ bunke xả xuống thiết bị trộn

3.2.1.4 Nguyên liệu cám mì.

Nghiền, định lượng

- Mục đích: Bổ sung nguồn cacbon tạo điều kiện cho mốc phát triển tốt và tạo rahàm lượng enzyme cao.

- Cách tiến hành: Cám mì từ kho chứa được nghiền đạt kích thước cần thiết sau đóđược định lượng vào thiết bị phối trộn

3.2.2 Phối trộn

- Mục đích: Tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình lên men sau này

- Cách tiến hành: Hỗn hợp bột bã mía,cám mì, trấu, nước, muối khoáng và các chấtdinh dưỡng cần thiết khác được định lượng và trộn đều theo tỉ lệ đã tính toán

Nước làm ẩm, phục vụ trực tiếp cho thanh trùng, đảm bảo chế độ làm ẩm cho quátrình nuôi cấy, độ ẩm tối ưu là 58% ÷ 60%

3.2.3 Thanh trùng

- Mục đích: Làm cho môi trường được tinh khiết về phương diện vi sinh vật

- Cách tiến hành: Thanh trùng bằng hơi nước nóng ở 1400C Thời gian giữ nhiệt là

50 ÷ 60 phút

3.2.4 Làm nguội

- Mục đích: Làm nguội gần đến nhiệt độ nuôi cấy nhằm tạo điều kiện thích hợp vềmặt nhiệt độ cho vi sinh vật phát triển Đây cũng là giai đoạn kiểm tra và loại bỏ nhữngthành phần quá nhão hoặc khô so với yêu cầu

- Cách tiến hành:

+ Sau khi thanh trùng, môi trường được băng chuyền chuyển qua băng tải làmnguội đến nhiệt độ khoảng 330C ÷ 340C

+ Yêu cầu thời gian thực hiện quá trình này phải ngắn để tránh bị nhiễm vi sinh vật tạp

3.2.5 Nhân giống sản xuất

Để phù hợp với môi trường được chọn ta chọn giống nuôi cấy là Trichoderma

Giống trong ống nghiệm được giữ ở trạng thái hoạt động bằng cách cấy chuyềnmỗi tháng một lần trong các môi trường thạch czapek.

Thành phần môi trường thạch czapek:

+ Kích hoạt giống gốc và cho giống vi sinh vật làm quen với môi trường lên men

sẽ sản xuất trên quy mô công nghiệp

+ Tạo đủ lượng giống để sản xuất trên quy mô công nghiệp

- Cách tiến hành:

Nhân giống trên máy lắc

Môi trường trong giai đoạn này cũng là môi trường trên mốc giống được nuôitrong bình tam giác 1 lít và được đặt trên máy lắc

Từ môi trường sản xuất sau khi làm nguội kết thúc, trích ra 10% chuyển quaphòng nhân giống để nhân giống sản xuất Quá trình nhân giống sản xuất cũng đượcthực hiện trên khay và được thực hiện trong phòng nhân giống

- Cách tiến hành:

Sau khi kết thúc quá trình gieo giống, canh trường nấm mốc được gàu tải chuyểnlên bunke trung gian Từ bunke này canh trường qua cân định lượng và được đưa vàokhay, khay chuyển vào phòng nuôi cấy được đặt trong phòng nuôi cấy và tiến hànhnuôi

Trong quá trình nuôi không cần điều chỉnh pH môi trường Đây là môi trường bánrắn nên sự thay đổi pH ở vị trí này không ảnh hưởng đến toàn bộ môi trường Độ ẩm96% ÷ 98%

Thời gian nuôi cấy nấm mốc khoảng 36 ÷ 60 giờ, trung bình thường là 42 giờ.Quá trình nuôi cấy trong môi trường bán rắn nuôi bằng phương pháp bề mặt trảiqua các giai đoạn sau:

- Giai đoạn 1: Giai đoạn này thường kéo dài 10 ÷ 14 giờ kể từ thời gian bắt đầunuôi cấy Trong giai đoạn này có những thay đổi sau:

+ Nhiệt độ tăng chậm

+ Sợi nấm bắt đầu hình thành và có màu trắng hoặc màu sữa

+ Thành phần dinh dưỡng bắt đầu có sự thay đổi

+ Khối môi trường còn rời rạc.

+ Enzyme mới bắt đầu hình thành

Trong giai đoạn này cần quan tâm đến chế độ nhiệt độ Tuyệt đối không được đểnhiệt độ cao hơn 300C vì thời kỳ này giống rất mẫn cảm với nhiệt độ

- Giai đoạn 2: Giai đoạn này kéo dài 14 ÷ 18 giờ tiếp theo Trong giai đoạn này cónhững thay đổi cơ bản sau:

+ Toàn bộ bào tử đã phát triển thành sợi nấm và sợi nấm bắt đầu phát triển rấtmạnh Các sợi nấm này tạo ra những mạng sợi chằng chịt khắp trong các hạt môitrường, trong lòng môi trường

+ Môi trường được kết lại khá chặt

+ Độ ẩm của môi trường giảm dần

+ Nhiệt độ của môi trường tăng nhanh có thể lên đến 400C ÷ 450C

+ Các chất dinh dưỡng bắt đầu giảm nhanh do sự đồng hoá của nấm sợi

+ Các loại enzyme được hình thành, trong đó cellulase hình thành nhiều nhất + Lượng oxy trong môi trường giảm và CO2 tăng dần, do đó trong giai đoạn nàycần thông khí mạnh và điều chỉnh nhiệt độ khoảng 290C ÷ 300C

Giai đoạn 3:

Giai đoạn này kéo dài 10 ÷ 20 giờ tiếp theo Ở giai đoạn này có những thay đổi cơ bản sau:+ Quá trình trao đổi chất sẽ yếu dần, do đó quá trình giảm chất dinh dưỡng sẽ chậm lại.+ Nhiệt độ khối môi trường giảm, do đó làm giảm lượng không khí môi trường xuốngcòn 20% ÷ 25% thể tích không khí trong 1 giờ Nhiệt độ nuôi cấy duy trì ở 300C

Cần dừng quá trình nuôi cấy và thu nhận enzyme trong giai đoạn này Vì tronggiai đoạn này bào tử được hình thành nhiều và làm giảm hoạt lực của enzyme.

3.2.10 Nghiền

- Mục đích: vừa phá vỡ tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm enzymethô Khi thành tế bào bị phá vỡ, các enzyme nội bào chưa thoát khỏi tế bào sẽ dễ dàngthoát khỏi tế bào

- Cách thực hiện:

Canh trường nấm mốc sau khi sấy được gàu tải chuyển sang máy nghiền

Kết thúc quá trình nghiền, canh trường nấm mốc được gàu tải chuyển vào bunkechứa và chuyển sang kho bảo quản

3.2.12 Cô đặc

Mục đích của giai đoạn này là nâng cao nồng độ chất khô từ 4 - 6g/l tới 15 - 20 g/

l, cho thêm một số chất bảo quản để đưa dung dịch đạt nồng độ 35 – 40 g/l Sau đó

Chương 4: TÍNH CÂN BẰNG VẬT CHẤT

4.1 Kế hoạch sản xuất của nhà máy

- Các ngày nghỉ trong năm:

Nghỉ ngày chủ nhật

Bảng 4.1: Kế hoạch sản xuất của phân xưởng sản xuất trong năm như sau

Như vậy sau khi trừ ngày lễ thì số ngày làm việc trong một năm của nhà máy là 305ngày Trong đó số ngày ngừng sản xuất để bảo dưỡng và vệ sinh phân xưởng máy mócthiết bị là 15 ngày Vậy trong một năm số ngày sản xuất thật sự của phân xưởng là 290ngày

Nhà máy làm việc 3 ca/ngày Số liệu ban đầu

Thành phần môi trường tính theo lượng chất khô tuyệt đối:

Bã mía : 62,72% MgSO4 : 0,05%

Cám mì : 26,88% KH2PO4 : 0,2%

Trấu : 10% NH4NO3 : 0,15%

Công đoạn Tỉ lệ hao hụt (%)

Dây chuyền gia công bã mía

Dây chuyền gia công cám gạo

Dây chuyền gia công trấu

4.2 Cân bằng vật chất

4.2.1 Dây chuyền sản xuất sản phẩm enzyme

Năng suất enzyme được sản xuất ra trong ngày là 2 tấn/ngày =2000 kg/ngày

4.2.1.1 Bao gói (Tỉ lệ hao hụt 0,1%)

Lượng sản phẩm enzyme thô trước công đoạn này là:

2000 × 100

100−0,1 =2002,02 (kg/ngày)

4.2.1.2 Sấy phun (Tỉ lệ hao hụt 2%)

Trước khi sấy độ ẩm đạt 40%

Sau khi sấy độ ẩm đạt 10%

2002,02× (100−10)×100

(100−40)×(100−2)=3064,288 (kg/ngày)Lượng chất khô tuyệt đối trước khi sấy là: