Mục tiêu nghiên cứu của bài viết nhằm nuôi cấy tăng sinh vi khuẩn tả trong môi trường cảm ứng sinh độc tố tả in vitro và tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát hiện và antidote kháng độc tố tả.
TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 CẢM ỨNG VI KHUẨN TẢ SINH ĐỘC TỐ TARIN VITRO VÀ TÁCH CHIẾT ĐỘC TỐ TỪ MÔI TRƢỜNG NUÔI CẤY Hoàng Đắc Thăng*; Đỗ Minh Trung*; Phạm Thế Tài*; Lê Văn Đơng* TĨM TẮT Mục tiêu: cảm ứng vi khuẩn tả (VKT) Vibrio cholerae sinh độc tố tả (ĐTT) in vitro tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát ĐTT antidote kháng ĐTT Phương pháp: nuôi cấy tăng sinh đồng thời kích thích VKT sinh ĐTT in vitro mơi trường cảm ứng có chứa pepton, cao men bia, NaCl NaHCO3 Tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy kỹ thuật kết tủa phân đoạn protein Đánh giá hoạt tính sản phẩm thu kỹ thuật GM1-ELISA điện di SDS-PAGE Kết quả: nuôi cấy in vitro VKT mơi trường cảm ứng có sinh ĐTT, sản phẩm độc tố tách chiết từ môi trường ni cấy có khả gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 có kích thước tương ứng với tiểu phần ĐTT Kết luận: nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy * Từ khóa: Độc tố tả; Vi khuẩn tả; Tách chiết độc tố In Vitro Induction of Cholera Toxin Production and Extraction of Toxin from Culture Medium Summary Objective: Induction of cholera toxin (CT) in vitro production by Vibrio cholerae and extraction of CT from culture medium to be used as material for the development of CT detection kit and antidote Methods: Bacterial proliferation and stimulation of toxin production were done by culturing of V cholerae with the inducing medium which contained peptone, yeast extract, NaCl, NaHCO3 The toxin was extracted from culture medium by protein-precipitation fractionation method Obtained toxin was determined by GM1-ELISA and SDS-PAGE techniques Results: V cholerae produced CT in vitro as being cultured in the inducing medium The toxin extracted from culture medium bind specifically to GM1 receptor and has the size corresponding to CT subuits Conclusion: CT has been successfully induced and extracted from in in vitro culture medium * Key words: Vibrio cholerae; Cholera toxin; Toxin extraction ĐẶT VẤN ĐỀ Vi khuẩn tả (Vibrio cholerae) loại vi khuẩn gram âm sinh ĐTT ĐTT gắn vào thụ thể đặc hiệu GM1 bề mặt tế bào biểu mô niêm mạc ruột, gây tiêu chảy nặng, kèm theo rối loạn nước, điện giải, dấu hiệu đặc trưng bệnh tả Trường hợp bệnh nặng gây tử vong thời gian ngắn Bệnh tả có khả * Häc viƯn Qu©n y Người phản hồi (Corresponding): Lê Văn Đông (levandong@yahoo.com) Ngày nhận bài: 10/01/2015; Ngày phản biện đánh giá báo: 22/01/2015 Ngày báo đăng: 28/01/2015 32 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 bùng phát thành đại dịch thời gian ngắn phạm vi rộng, ảnh hưởng nặng nề đến sức khoẻ, kinh tế xã hội an ninh nhiều quốc gia [1] Tuy nhiên, VKT thường sinh ĐTT điều kiện in vivo nhiễm vào tăng sinh môi trường đường ruột đối tượng bị nhiễm Trong điều kiện nuôi cấy in vitro môi trường nuôi cấy thông thường, vi khuẩn tăng sinh mà không tiết độc tố [3, 4, 5] Phát ĐTT có kháng thể đặc hiệu làm antidote chống ĐTT biện pháp quan trọng điều trị nhiễm trùng, nhiễm độc vi khuẩn ĐTT, đặc biệt ĐTT sử dụng tác nhân vũ khí sinh học Để có ngun liệu phát triển kít phát antidote kháng ĐTT, cần có nguyên liệu ban đầu ĐTT, sản phẩm ĐTT chủng VKT gây tiêu chảy cấp thành dịch Việt Nam Nghiên cứu tiến hành nhằm: Nuôi cấy tăng sinh VKT môi trường cảm ứng sinh ĐTT in vitro tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít phát antidote kháng ĐTT VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu nghiên cứu - Chủng VKT V50 khảo sát tuyển chọn nghiên cứu trước chúng tơi, chủng có khả tăng sinh mạnh số 10 chủng VKT Khoa Vi sinh Y học, Bệnh viện Quân y 103 phân lập từ vụ dịch tiêu chảy cấp thành dịch Hà Nội vào năm 2007 2008 [2] - Hóa chất, thiết bị nghiên cứu: mơi trường nuôi cấy TCBS agar, thạch kiềm, 33 pepton, cao men bia, NaCl, NaHCO 3, NaH2PO4, NaOH, HCl, H2CO3, (NH)2SO4 (Hãng Merck) Protein GM1, ĐTT chuẩn, kháng thể đơn clôn kháng ĐTT, kháng thể kháng IgG gắn enzym HRP (Hãng Sigma); hóa chất thơng thường dùng cho phản ứng ELISA điện di SDSPAGE đạt tiêu chuẩn phân tích hãng có uy tín cung cấp Phƣơng pháp nghiên cứu * Nuôi cấy VKT môi trường cảm ứng sinh độc tố: Nuôi cấy VKT mơi trường cảm ứng sinh tổng hợp ĐTT có chứa pepton, cao men bia, NaHCO3 có bổ sung NaCl mô tả nghiên cứu trước [2] Sau 72 nuôi cấy, thu hoạch môi trường ni cấy cách ly tâm 4.500 vòng/phút 25 phút lấy dịch chứa ĐTT Định lượng nồng độ protein dịch nuôi cấy phương pháp Bradford sử dụng BSA làm protein chuẩn để định lượng nồng độ protein tổng số Xác định có mặt ĐTT môi trường nuôi cấy kỹ thuật GM1-ELISA * Tách chiết ĐTT: Được thực theo phương pháp kết tủa phân đoạn nhiều bước với muối sulphat amôn - Bước 1: gây kết tủa thành phần protein Tính thể tích dịch thu sau ni cấy lượng muối sulphat amôn đạt 20% độ bão hòa Cho từ từ sulphat amơn vào dung dịch ni cấy để đá lạnh khuấy nhẹ nhàng máy khuấy từ thời gian tiếng Ly tâm 9.000 vòng/phút thời gian 25 phút máy ly tâm lạnh 40C, thu dịch chứa ĐTT bỏ cặn TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 - Bước 2: tủa phân đoạn với muối sulphat amôn các nồng độ 30%, 40%, 60% 70% theo cách làm tương tự bước Sau ly tâm 9.000 vòng/ phút thời gian 25 phút máy ly tâm lạnh 4ºC, thu cặn kết tủa protein chứa ĐTT - Bước 3: rửa cặn tủa protein thẩm tích protein chứa ĐTT với dung dịch PBS lạnh Hòa tan cặn protein dung dịch PBS, sau cho vào túi thẩm tích (khơng q 2/3 thể tích túi) Thẩm tích bình chứa dung dịch PBS lạnh 48 Trong thời gian thẩm tích, định kỳ thay dung dịch thẩm tích lần - Xác định nồng độ protein chứa ĐTT thu sau thẩm tích phương pháp Bradford sử dụng BSA protein chuẩn để định lượng nồng độ protein tổng số Xác định có mặt ĐTT kỹ thuật GM1-ELISA Độ tinh kích thước protein khảo sát phương pháp điện di SDS-PAGE có V cholera (chứng âm) cho vào giếng gắn GM1 để ĐTT gắn với GM1 giếng, rửa PBS-T Cho kháng thể kháng ĐTT vào giếng, thời gian giờ, rửa giếng PBS-T, cho kháng thể thứ hai gắn enzym HRP vào giếng, thời gian giờ, rửa lại PBS-T Cho chất vào giếng phản ứng với nồng độ 0,5 mg/ml, thời gian 10 phút Xác định kết thông qua mật độ quang học giếng đo máy đọc DTX 880 (Hãng Beckman Coulter, Mỹ) bước sóng 450 nm Kiểm tra độc tính ĐTT đường uống chuột nhắt trắng sơ sinh - ngày tuổi KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN Nuôi cấy tăng sinh V cholerae môi trƣờng sinh độc tố Bảng 1: Nồng độ protein hoạt tính ĐTT dịch sau ni cấy VKT * Phát thử hoạt tính ĐTT: Phát ĐTT phản ứng GM1ELISA theo nguyên lý kỹ thuật ELISA kiểu sandwich, sử dụng ganglioside GM1 phối tử đặc hiệu với ĐTT gắn lên pha rắn làm phân tử bắt giữ ĐTT Kháng thể đơn clôn kháng ĐTT dùng để phát có mặt ĐTT bị GM1 bắt giữ Các bước cụ thể sau: gắn GM1 vào giếng đĩa ELISA, để qua đêm rửa với PBS-T, block giếng BSA 1%, thời gian 30 phút, sau rửa PBS-T ĐTT chuẩn (chứng dương); sản phẩm ĐTT sau tách chiết, môi trường nuôi cấy chứa ĐTT môi trường nuôi cấy khơng 34 Nồng độ protein Hoạt tính ĐTT 0,096 mg/ml 0,094 mg/ml 0,101 mg/ml + + ++ Sau 24 nuôi cấy, VKT chết tiết ĐTT vào môi trường Nồng độ protein thu protein dịch sau ni cấy 72 có nồng độ protein cao (0,101 mg/ml) hoạt tính ĐTT mạnh Điều phù hợp với với chu trình tăng sinh VKT điều kiện nuôi cấy in vitro [2, 3] TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Tách chiết ĐTT từ môi trƣờng nuôi cấy Bảng 2: Nồng độ protein thu từ phân đoạn kết tủa Nồng độ protein 0,025 mg/ml 0,018 mg/ml 0,235 mg/ml 0,066 mg/ml Hình 1: Hoạt tính ĐTT phân đoạn kết tủa Phân đoạn kết tủa nồng độ muối sulphat amơn 60% bão hòa có nồng độ protein hoạt tính ĐTT cao so với phân đoạn kết tủa nồng độ muối sulphat amôn 30%, 40% 70%, cho thấy nồng độ muối thấp cao không gây kết tủa hết ĐTT môi trường Nồng độ 60% độ bão hòa muối sulphat amơn phù hợp cho mục đích thu cặn protein có chứa ĐTT với hoạt tính mạnh Hoạt tính ĐTT Hình 2: Hoạt tính ĐTT khảo sát kỹ thuật GM1-ELISA 35 TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 Sản phẩm thu kết tủa phân Vi khuẩn tả sản xuất độc tố ruột gọi đoạn nồng độ muối sulphat amôn 60% Choleragen (giống Cholerae enterotoxin) bão hòa có hoạt tính ĐTT gắn đặc hiệu vào gồm thành phần: tiểu phần A (phần hoạt phối tử GM1 Đồ thị biểu thị mức độ phản độc - active) tiểu phần B (phần gắn dính - ứng ĐTT pha lỗng bậc hai tương binding) ĐTT bao gồm tiểu đơn vị B đối điển hình theo dạng đường cong chuẩn tiểu đơn vị A, tiểu đơn vị B có khối phản ứng ELISA, cho thấy sản phẩm lượng phân tử khoảng 11,6 Kda, tiểu phần thu có phản ứng gắn đặc hiệu với thụ A1 khối lượng phân tử khoảng 23,5 kDa, thể GM1 Đánh giá sơ qua đường uống tiểu phần A2 khối lượng phân tử khoảng 9,7 sản phẩm thu gây chết chuột nhắt kDa [3, 4] Dựa vào kết điện di thu trắng sơ sinh được, kết giếng số môi trường - ngày tuổi, chứng tỏ sản phẩm thu độc tố gắn GM1 Độ tinh kích thƣớc ĐTT thu đƣợc ni cấy trước kết tủa có xuất nhiều băng protein, tương đối mờ nhạt nồng độ protein dịch nuôi cấy thấp Sản phẩm thu sau kết tủa có băng Phân tích sản phẩm protein có hoạt tính tương ứng với kích thước tiểu phần B ĐTT điện di SDS-PAGE cho thấy xuất 11,6 Kda, A2 9,7 kDa Bên cạnh băng băng tương ứng với kích thước có số băng phụ Tuy nhiên, mật tương đương 11,6 kDa tiểu phần B độ tương đối thấp so với băng chính, 9,7 Kda tiểu phần A2 chứng tỏ sản phẩm thu chứa chủ yếu protein tương ứng với ĐTT, sử dụng làm nguyên liệu cho việc tách tinh sạch, phục vụ cho nghiên cứu phát triển kít phát antidote chống ĐTT sau KẾT LUẬN Đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy phương pháp tủa phân đoạn protein Sản phẩm độc tố tách chiết từ Hình 3: Kết điện di SDS-PAGE mơi trường ni cấy có khả gắn đặc hiệu vào thụ thể GM1 có kích thước (1: Môi trường nuôi cấy chưa kết tủa; 2: Protein sau kết tủa 60% sulphat amơn bão hòa; M: thang protein chuẩn) 36 tương ứng với tiểu phần ĐTT TẠP CHÍ Y - DƯỢC HỌC QUÂN SỰ SỐ 2-2015 TÀI LIỆU THAM KHẢO Phùng Đắc Cam Vibrio cholerae bệnh dịch tả Nhà xuất Y học Hà Nội 2013 Đỗ Minh Trung, Hoàng Đắc Thăng, Lê Văn Đông CS Nghiên cứu tuyển chọn nuôi cấy VKT sinh ĐTT in vitro Tạp chí Y - Dược học Quân 2013, 38 (9), tr.84-90 Davy Vanden Broeck, Caroline Horvath, Marc JS De Wolf Vibrio cholerae: Cholera 37 toxin The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 2007, 39, pp.1771-1775 Stephen H Richardson, Dolores G Evans, John C Feeley Biochemistry of Vibrio cholerae Virulence I Purification and Biochemical Properties of PF/Cholera Enterotoxin Infection and immunity 1970, June, pp.546-554 Mark Dertzbaugh Method for purifying cholera toxin United States Patent 1999, 6, pp.308-329 ... gây tiêu chảy cấp thành dịch Vi t Nam Nghiên cứu tiến hành nhằm: Nuôi cấy tăng sinh VKT môi trường cảm ứng sinh ĐTT in vitro tách chiết độc tố từ môi trường nuôi cấy làm nguyên liệu chế tạo kít... * Nuôi cấy VKT môi trường cảm ứng sinh độc tố: Nuôi cấy VKT môi trường cảm ứng sinh tổng hợp ĐTT có chứa pepton, cao men bia, NaHCO3 có bổ sung NaCl mô tả nghiên cứu trước [2] Sau 72 nuôi cấy, ... liệu cho vi c tách tinh sạch, phục vụ cho nghiên cứu phát triển kít phát antidote chống ĐTT sau KẾT LUẬN Đã nuôi cấy cảm ứng VKT sinh độc tố in vitro tách chiết ĐTT từ môi trường nuôi cấy phương