Cây húng tây (Thymus vulgaris L.) thuộc họ Lamiaceae, được sử dụng nhiều trong chế biến thực phẩm và trong điều trị các bệnh về hệ hô hấp, hệ tiêu hóa, hệ thần kinh do có các hợp chất thứ cấp như thymol và carvarol trong tinh dầu ở lá. Tuy nhiên, sự hình thành và tích lũy tinh dầu của cây húng tây chịu ảnh hưởng nhiều bởi sự thay đổi môi trường và sinh thái. Nghiên cứu này được thực hiện nhằm tìm hiểu các điều kiện thích hợp cho sự tăng trưởng của cây húng tây nuôi cấy in vitro trong điều kiện nhiệt độ và ẩm độ tương đối ổn định và được kiểm soát (T 24 ± 2oC, RH 50 ± 5%). Sau 28 ngày nuôi cấy, đốt thân cây T. vulgaris mang chồi ngủ tạo chồi nhiều nhất (4,3 chồi/mẫu) trên môi trường MS có bổ sung 1 mg L-1 BA, 0,5 mg L-1 IBA, 30 g L-1 đường sucrose dưới cường độ ánh sáng 40 µmol m-2 s -1 và thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. Ở ngày thứ 35, sự tăng trưởng của cây húng tây phát triển từ đốt thân tốt nhất khi được nuôi cấy trong điều kiện quang tự dưỡng (môi trường nuôi cấy không bổ sung đường, vitamin và chất điều hòa sinh trưởng thực vật) dưới cường độ ánh sáng 95 µmol m-2 s -1 , thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày. Môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng MS với thành phần đa lượng giảm 1/2, có bổ sung thêm 200 mg L-1 KNO3, 200 mg L-1 KH2PO4.
TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 234-241 NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SINH TRƯỞNG CỦA CÂY HÚNG TÂY (Thymus vulgaris L.) DƯỚI TÁC ĐỘNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA HỌC VÀ VẬT LÝ CỦA MÔI TRƯỜNG NUÔI CẤY Nguyễn Thụy Phương Duyên, Hoàng Ngọc Nhung, Nguyễn Thị Quỳnh* Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, (*)qtnguyen_vn@yahoo.com TÓM TẮT: Cây húng tây (Thymus vulgaris L.) thuộc họ Lamiaceae, sử dụng nhiều chế biến thực phẩm điều trị bệnh hệ hơ hấp, hệ tiêu hóa, hệ thần kinh có hợp chất thứ cấp thymol carvarol tinh dầu Tuy nhiên, hình thành tích lũy tinh dầu húng tây chịu ảnh hưởng nhiều thay đổi môi trường sinh thái Nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu điều kiện thích hợp cho tăng trưởng húng tây nuôi cấy in vitro điều kiện nhiệt độ ẩm độ tương đối ổn định kiểm soát (T 24 ± 2oC, RH 50 ± 5%) Sau 28 ngày nuôi cấy, đốt thân T vulgaris mang chồi ngủ tạo chồi nhiều (4,3 chồi/mẫu) mơi trường MS có bổ sung mg L-1 BA, 0,5 mg L-1 IBA, 30 g L-1 đường sucrose cường độ ánh sáng 40 µmol m-2 s-1 thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Ở ngày thứ 35, tăng trưởng húng tây phát triển từ đốt thân tốt nuôi cấy điều kiện quang tự dưỡng (môi trường nuôi cấy không bổ sung đường, vitamin chất điều hòa sinh trưởng thực vật) cường độ ánh sáng 95 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Môi trường nuôi cấy bao gồm khoáng MS với thành phần đa lượng giảm 1/2, có bổ sung thêm 200 mg L-1 KNO3, 200 mg L-1 KH2PO4 Từ khóa: Thymus vulgaris L., chất điều hòa sinh trưởng thực vật, ni cấy mơ quang tự dưỡng, tinh dầu MỞ ĐẦU Cây húng tây (Thymus vulgaris L.), thuộc họ Lamiaceae, sử dụng nhiều chế biến thực phẩm điều trị bệnh hệ hơ hấp, hệ tiêu hóa, hệ thần kinh có chứa hợp chất thứ cấp thymol carvarol tinh dầu Hiện nay, sản phẩm bào chế từ húng tây xem sản phẩm tiềm ngành công nghiệp thực phẩm, dược phẩm mỹ phẩm Nhu cầu thị trường húng tây cao, ước tính vào khoảng 500 tấn/năm Hoa Kỳ 1.000 tấn/năm châu Âu [13] Xu hướng chung xã hội ngày sử dụng chất tự nhiên để thay cho hợp chất tổng hợp, vậy, nhu cầu sử dụng loài theo dự báo gia tăng [10] Tuy nhiên, hàm lượng thành phần tinh dầu húng tây chịu ảnh hưởng yếu tố sinh thái giai đoạn phát triển cá thể Mặt khác, điều kiện môi trường ảnh hưởng đáng kể đến thời gian thu hoạch sản lượng nguyên liệu [10] Ngoài tự nhiên, húng tây trồng từ hạt, nhiên, hạt húng tây dễ sức nảy mầm sau thời gian ngắn, đồng thời hạt húng tây thường sản xuất phương pháp thụ phấn chéo [13] Vì vậy, nuôi cấy in vitro húng tây yêu cầu cần thiết để 234 trì dòng ưu việt Vi nhân giống húng tây biết đến qua cơng trình Lê (1989) [5] khảo sát thành phần mơi trường khống lên tăng trưởng húng tây in vitro Furmanowa & Olszowska (1992) [3] nghiên cứu việc sử dụng chất điều hòa sinh trưởng thực vật chứng minh IBA thích hợp cho việc tạo chồi in vitro húng tây Sáez et al (1994) [11] công bố việc sử dụng BA IAA vi nhân giống Thymus piperella Cho đến nay, Việt Nam chưa có cơng trình nghiên cứu ni cấy in vitro húng tây Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm tìm hiểu điều kiện thích hợp cho tăng trưởng húng tây điều kiện nhiệt độ ẩm độ tương đối phòng ni kiểm soát để làm tiền đề cho việc xây dựng quy trình sản xuất húng tây in vitro cho ngành dược liệu PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Các thí nghiệm húng tây (Thymus vulgaris L.) tiến hành điều kiện nhiệt độ 24 ± 2oC ẩm độ tương đối 50 ± 5% Các húng tây dùng thí nghiệm mơ tả có nguồn gốc từ hạt trước nuôi cấy in vitro môi trường MS Nguyen Thuy Phuong Duyen, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Thi Quynh (Murashige & Skoog, 1962) [7], bổ sung vitamin Morel [6], 10 g L-1 đường sucrose (Cơng ty Đường Biên Hòa), 7,5 g L-1 agar (Công ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long) cường độ ánh sáng 40 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV) lên tạo chồi húng tây Vật liệu nuôi cấy đốt thân húng tây in vitro vị trí thứ thứ (tính từ chồi ngọn), loại bỏ mở mọc đối xứng ni cấy bình tích 130 ml Môi trường nuôi cấy sử dụng môi trường khoáng MS, vitamin Morel, 30 g L-1 đường sucrose, giá thể sử dụng 7,3 g L-1 agar pH điều chỉnh 5,8 trước khử trùng Mỗi bình chứa 20 ml mơi trường Thí nghiệm gồm yếu tố, yếu tố thứ cytokinin (BA) với mức nồng độ (1 mg L-1), yếu tố thứ hai auxin với mức (0; 0,5; mg L-1 IBA hay 0,2; 0,5 mg L-1 NAA) Mỗi công thức gồm 10 mẫu cấy lặp lại lần Các bình ni cấy đặt cường độ ánh sáng 40 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày 28 ngày Ảnh hưởng nồng độ đường cường độ ánh sáng lên tăng trưởng húng tây in vitro Vật liệu nuôi cấy đốt thân húng tây in vitro vị trí thứ thứ tính từ mang mở mọc đối xứng, trọng lượng tươi trung bình 8,8 mg/đốt trọng lượng khơ trung bình mg/đốt Các đốt thân ni cấy hộp Magenta GA-7 (công ty Sigma, Hoa Kỳ) với nắp khơng có có đục lỗ (ф = cm) giúp trao đổi khí, nắp có lỗ dán màng Millipore (ф = 0,45 µm, cơng ty Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản) Môi trường sử dụng mơi trường khống MS với thành phần đa lượng giảm 1/2, bổ sung 200 mg L-1 KNO3 200 mg L-1 KH2PO4 pH môi trường điều chỉnh đến 5,8 trước khử trùng Giá thể sử dụng 7,5 mg L-1 agar Thí nghiệm gồm yếu tố, yếu tố thứ phương pháp nuôi cấy với mức độ phương pháp nuôi cấy quang dị dưỡng (QDD) với mơi trường có bổ sung 20 g L-1 đường sucrose vitamin Morel, phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng (QTD) với môi trường không bổ sung đường vitamin; yếu tố thứ hai cường độ ánh sáng (CĐAS) với mức độ 70, 95 hay 120 µmol m-2 s-1 Tồn thí nghiệm chiếu sáng 12 giờ/ngày 35 ngày Thí nghiệm có công thức, công thức gồm hộp, hộp mang đốt thân Mỗi công thức lặp lại lần Các tiêu tăng trưởng phân tích thống kê phần mềm MSTATC phiên 2.10 Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ vẽ đồ thị phần mềm Excel 2007 Ở thí nghiệm, sau phân tích ANOVA yếu tố, khác biệt cơng thức có ý nghĩa mức p≤ 0,05 hay 0,01 tiếp tục phân hạng theo Duncan's Multiple Range Test [2] KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tạo chồi húng tây Sau ngày nuôi cấy, chồi bắt đầu hình thành tất cơng thức Sự kết hợp CĐHSTTV nồng độ khác tác động rõ rệt lên tạo chồi Ở ngày thứ 28, công thức B1 I0,5 (0,1 mg L-1 BA 0,5 mg L-1 IBA) có tỷ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi cao (87%), ngược lại công thức B1N0,5 (1 mg L-1 BA 0,5 mg L-1 NAA) cho tỷ lệ mẫu cấy tạo cụm chồi thấp (17%) (hình 1) Hình Ảnh hưởng nồng độ BA nồng độ auxin lên tạo cụm chồi từ đốt cắt thân nuôi cấy in vitro ngày thứ 28 Số chồi/mẫu, chiều cao cụm chồi, số 235 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 234-241 mở/mẫu đạt cao đốt thân nuôi cấy môi trường bổ sung mg L-1 BA 0,5 mg L-1 IBA Ngược lại, môi trường nuôi cấy bổ sung nồng độ mg L-1 BA 0,5 mg L-1 NAA tiêu đo thấp (bảng 1) Bảng Ảnh hưởng BA auxin lên tạo cụm chồi từ đốt cắt thân húng tây nuôi cấy in vitro ngày thứ 28 Tênz B 10 B1I0,5 B1I1 B1N0,2 B1N0,5 B 20 B2I0,5 B2I1 B2N0,2 B2N0,5 Cơng thức thí nghiệm Nồng độ BA Nồng độ auxin (mg L-1) (mg L-1) 1 0,5 IBA 1 IBA 0,2 NAA 0,5 NAA 2 0,5 IBA IBA 0,2 NAA 0,5 NAA ANOVAy Nồng độ BA (A) Nồng độ auxin (B) AxB CV (%) Số chồi/mẫu 2,37 dx 4,27 a 2,07 e 2,53 c 1,50 g 2,53 c 2,73 b 2,13 e 1,80 f 1,70 f ** ** ** 2,79 Chiều cao cụm chồi (mm) Số mở/mẫu 11,57 g 23,83 a 13,20 f 17,50 b 9,50 h 15,27 d 15,30 d 16,97 c 13,17 f 13,87 e 12,23 e 25,30 a 10,90 f 16,13 c 7,80 i 16,30 c 17,67 b 13,80 d 10,47 g 9,33 h ** ** ** 0,52 ** ** ** 0,77 z B tượng trưng cho BA, tượng trưng khơng có auxin, I tượng trưng cho IBA, N tượng trưng cho NAA, số bên cạnh tượng trưng cho mức nồng độ; y **: khác biệt có ý nghĩa p≤ 0,01; x Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng Duncan's Multiple Range Test BA phối hợp với auxin ngoại sinh nồng độ thấp (0,5 mg L-1 IBA hay 0,2 mg L-1 NAA) giúp hình thành nhiều chồi so với khơng có auxin (bảng 1) Điều cho thấy, IBA hay NAA diện nồng độ thấp kích thích tế bào mơ phân sinh chồi ngủ phân chia nhanh mạnh mẽ Tuy nhiên, tăng nồng độ IBA từ 0,5 lên mg L-1 hay NAA từ 0,2 lên 0,5 mg L-1 số chồi hình thành giảm Kết tương tự với kết Furmanowa & Olszowska (1992) [3] Skoog & Miller (1955) [12] cho rằng, thêm cytokinin ngoại sinh vào môi trường nuôi cấy làm thay đổi gradient CĐHSTTV nội sinh bên mẫu, đồng thời thiết lập gradient chất điều hòa sinh trưởng Trong trường hợp húng tây thí nghiệm này, thay đổi gradient giúp phá vỡ trạng thái ngủ chồi bên kích thích hình thành chồi Tác giả Bùi Trang Việt (2000) [1] lại 236 cho rằng, auxin cytokinin có tác động tương tác với lên trình phát sinh hình thái thực vật ni cấy in vitro Khi tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng cytokinin thường kích thích tạo chồi, tỷ lệ auxin/cytokinin nghiêng auxin, phát triển phác thể chồi bị ức chế Ngồi ra, loại CĐHSTTV ảnh hưởng khác lên phát sinh hình thái [1] Trong thí nghiệm này, IBA có ảnh hưởng nhiều NAA lên gia tăng số chồi Điều giải thích tỷ lệ NAA/BA sử dụng thí nghiệm chưa phải tối ưu để kích thích tạo chồi húng tây Kết tương tự với kết Furmanowa & Olszowska (1992) [3] chứng minh IBA thích hợp so với NAA việc tạo chồi in vitro húng tây (Thymus vulgaris L.) từ đốt thân Số chồi cao đạt kết hợp 0,3 hay 0,5 mg L-1 IBA với 0,1 mg L-1 Kin Sáez et al (1994) [11] Nguyen Thuy Phuong Duyen, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Thi Quynh tiến hành nhân chồi Thymus piperella cho thấy BA có khả kích thích mẫu cấy tạo cụm chồi Khi tăng dần nồng độ BA (từ lên 1,5 mg L-1), số lượng chồi lớn mm tăng, tăng nồng độ BA lên tới mg L-1 số lượng chồi lớn mm giảm dần Mặt khác, BA kết hợp với IAA cho kết tốt so với kết hợp BA NAA việc kích thích tạo cụm chồi Thymus piperella [11] Ở cơng thức B1I0,5 thí nghiệm này, kết hợp BA (1 mg L-1) IBA (0,5 mg L-1) giúp cho tế bào phân chia mạnh mẽ dẫn đến số chồi công thức nhiều nhất, chiều cao cụm chồi số mở lớn (bảng 1) Ảnh hưởng nồng độ đường cường độ ánh sáng lên tăng trưởng húng tây in vitro Sự có mặt đường, vitamin mức CĐAS khác ảnh hưởng rõ rệt lên tăng trưởng húng tây giai đoạn in vitro (bảng 2, hình 2) Khi nuôi cấy mức CĐAS, môi trường không đường, không vitamin, gia tăng trọng lượng tươi gia tăng trọng lượng khô húng tây cao so với ni cấy mơi trường có bổ sung 20 g L-1 đường sucrose vitamin Morel Sau 35 ngày nuôi cấy, gia tăng trọng lượng tươi (119,3 mg/cây), gia tăng trọng lượng khô (14,1 mg/cây) lớn công thức nuôi cấy quang tự dưỡng (không đường, khơng vitamin) CĐAS 95 µmol m-2 s-1 (bảng 2) Chiều cao húng tây nuôi cấy môi trường có đường vitamin hay khơng có đường vitamin gia tăng CĐAS tăng từ 70 lên 95 µmol m-2 s-1 Tuy nhiên, CĐAS 120 µmol m-2 s-1 chiều cao giảm xuống đáng kể Chiều cao thấp (22,1 mm/cây) công thức QDD120 (ni cấy mơi trường có đường vitamin CĐAS 120 µmol m-2 s-1) (bảng 2) Cây húng tây công thức QTD95 (nuôi cấy môi trường không đường vitamin CĐAS 95 µmol m-2 s-1) có chiều cao lớn (79,5 mm/cây) dù tương tác hai yếu tố thí nghiệm khơng có ý nghĩa phương diện thống kê (bảng 2) Bảng Gia tăng trọng lượng tươi, gia tăng trọng lượng khô, chiều cao cây, chiều dài rễ, số đốt húng tây (Thymus vulgaris L.) nuôi cấy điều kiện nồng độ đường cường độ ánh sáng khác ngày thứ 35 Cơng thức thí nghiệm Nồng độ CĐAS đường Tênz (mol m-2 s-1) -1 (g L ) QTD70 70 QTD95 95 QTD120 120 QDD70 20 70 QDD95 20 95 QDD120 20 120 ANOVAy Nồng độ đường (A) CĐAS (B) AxB CV (%) Gia tăng trọng lượng tươi (mg/cây) Gia tăng trọng lượng khô (mg/cây) Chiều cao (mm/cây) Chiều dài rễ (mm/cây) Số đốt/cây 72,2 bx 119,3 a 60,2 c 42,2 d 63,6 bc 33,2 d 9,07 b 14,1 a 10,3 b 5,9 c 6,4 c 5,2 c 56,2 79,5 43,6 30,8 52,9 22,1 8,1 bc 13,0 a 9,5 b 10,2 b 14,4 a 6,7 c 12,04 17,59 8,77 13,61 6,4 ** ** ** 6,9 ** ** ** 6,24 ** ** NS 7,69 NS ** ** 8,81 ** ** NS 5,7 Z QTD biểu thị cho môi trường nuôi cấy không đường vitamin; QDD biểu thị cho mơi cấy có bổ sung đường vitamin; số 70, 95,120 biểu thị cho mức cường độ ánh sáng; y NS, **: khơng khác biệt, khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01; x Các trị số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo phân hạng Duncan's Multiple Range Test 237 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 234-241 Rễ húng tây nuôi cấy in vitro dài CĐAS 95 µmol m-2 s-1 cơng thức QDD95 (14,4 mm/cây) hay QTD95 (13 mm/cây) vào ngày thứ 35 (bảng 2) Tuy nồng độ đường (0 hay 20 g L-1) khơng tạo khác biệt có ý nghĩa chiều dài rễ công thức, CĐAS có ảnh hưởng rõ rệt dẫn đến khác biệt mặt thống kê công thức mức p ≤ 0,01 (bảng 2) Chiều dài rễ gia tăng CĐAS tăng từ 70 lên 95 µmol m-2 s-1 giảm nuôi cấy cường độ ánh sáng 120 µmol m-2 s-1 cơng thức nuôi cấy QTD hay QDD (bảng 2) Số đốt thân húng tây công thức không khác biệt thống kê dựa tương tác hai yếu tố thí nghiệm, nhiên yếu tố, phương pháp nuôi cấy hay CĐAS, khác biệt công thức rõ rệt với số đốt thân công thức QTD95 lớn (17,59 đốt/cây) so với cơng thức lại (bảng 2) Hiệu suất quang hợp thuần, Pn, nuôi cấy ba công thức QDD thấp (≤ 0,2 µmol mol-1 h-1 cây-1) giảm dần theo thời gian ni cấy Trong từ ngày thứ 10 đến ngày thứ 20, hiệu suất quang hợp húng tây nuôi cấy QTD tăng dần theo thời gian ni cấy cơng thức có CĐAS 70, 95 hay 120 µmol m-2 s-1 (hình 3) Ở ngày thứ 30, nuôi cấy QTD hộp Magenta có màng trao đổi khí cường độ ánh sáng 95 µmol m-2 s1 có hiệu suất quang hợp lớn (2,6 µmol mol-1 h-1 cây-1), Pn tăng trưởng CĐAS 70 µmol m-2 s-1 (2,4 µmol mol-1 h-1 cây-1) Trong đó, hiệu suất quang hợp húng tây công thức QTD120 giảm dần từ ngày thứ 20 (2,1 µmol mol-1 h-1 cây-1) đến ngày thứ 30 (1,9 µmol mol-1 h-1 cây-1) thí nghiệm (hình 3) Hình Cây húng tây (Thymus vulgaris L.) nuôi cấy điều kiện nồng độ đường cường độ ánh sáng khác vào ngày thứ 35 (thước đo cm) QTD Quang tự dưỡng (môi trường không đường, không vitamin); QDD Quang dị dưỡng (mơi trường có bổ sung đường vitamin); số 70, 95, 120 biểu thị cho mức CĐAS (µmol m-2 s-1) 238 Nguyen Thuy Phuong Duyen, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Thi Quynh Hình Ảnh hưởng nồng độ đường cường độ ánh sáng lên hiệu suất quang hợp (Pn) húng tây theo thời gian nuôi cấy Cây húng tây nuôi cấy điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng (môi trường khơng đường, khơng vitamin) có tăng trưởng tốt so với nuôi cấy quang dị dưỡng (môi trường có đường, có vitamin) Khả quang hợp ni cấy quang dị dưỡng nồng độ CO2 hộp ni cấy kín giai đoạn chiếu sáng ln ln thấp (số lần trao đổi khí hộp Magenta kín khơng lỗ 0,2 lần/giờ), nên lượng CO2 cần thiết cho quang hợp không đủ Mặt khác, nồng độ đường cao môi trường làm cho lục lạp phát triển khơng bình thường [16], hoạt động enzyme RubisCO mơi trường có nồng độ đường cao bị giới hạn dẫn đến hiệu suất quang hợp thấp [4] Hơn nữa, độ ẩm tương đối hộp ni cấy QDD cao tới mức bão hòa hộp kín làm cho húng tây nước chậm dẫn đến tốc độ hấp thu nước khoáng chất từ mơi trường giảm sút, ni cấy QDD tăng trưởng Trong đó, ni cấy QTD có khả quang hợp tốt nhận khí CO2 qua màng Millipore gắn nắp bình ni cấy (số lần trao đổi khí hộp Magenta lỗ 3,96 lần/giờ), với enzyme RubisCO hoạt động bình thường nên có tăng trưởng tốt so với nuôi cấy QDD Hiệu suất quang hợp húng tây nuôi cấy công thức QDD thấp (thay đổi khoảng từ 0,130,23 µmol mol-1 h-1 cây-1 ) giảm dần theo thời gian ni cấy (hình 3) Điều cho thấy khả quang hợp húng tây nuôi cấy mơi trường có đường vitamin khơng phát huy Để tăng trưởng, phải sử dụng nguồn đường có mơi trường chế thẩm thấu qua vết cắt đốt thân Trong hiệu suất quang hợp húng tây công thức QTD70 QTD95 với màng trao đổi khí tăng dần theo thời gian, từ µmol mol-1 h-1 cây-1 ngày thứ 10, sau tăng lên 2,4 (QTD70) hay 2,6 (QTD95) µmol mol-1 h-1 cây-1 ngày thứ 30 Vì nguồn carbon vơ nguồn chất nuôi cấy quang tự dưỡng nên gia tăng hiệu suất quang hợp nuôi cấy QTD phản ánh khả tổng hợp chất hữu từ nguồn carbon vơ khơng khí húng tây hiệu Trong thí nghiệm này, CĐAS tăng dần theo thời gian nuôi cấy Ở hai công thức QTD120 QDD120, CĐAS nâng lên mức 120 µmol m-2 s-1 vào ngày ni cấy thứ 17 Sau tăng CĐAS lên 120 µmol m-2 s-1 ngày hiệu suất quang hợp giảm dần kể từ ngày nuôi cấy thứ 20 Theo Taiz & Zeiger (2002) [14], ánh sáng ảnh hưởng lớn đến quang hợp, lượng ánh sáng tiếp nhận quan quang hợp (lá) thông qua trình cố định CO2 chuyển thành lượng vật chất hữu cho sử dụng Tùy vào chất thực vật nồng độ CO2 239 TẠP CHÍ SINH HỌC, 2012, 34(3SE): 234-241 khơng khí mà có mức cường độ ánh sáng giúp đạt quang hợp tối đa gọi điểm bão hòa ánh sáng (light saturated point LSP) Khi cường độ ánh sáng tăng vượt mức LSP lúc lượng CO2 cung cấp cho thực vật không đổi làm cho máy quang hợp bị phá hủy hệ thống enzyme bị họat tính dư thừa lượng ánh sáng [14] Theo Vũ Văn Vụ (2009) [15], quang hợp bình thường khơng xảy q trình quang oxid hóa Nhưng điều kiện thừa lượng ánh sáng tạo nên tình trạng thừa phân tử chlorophyll bị kích thích thực vật khơng dùng hết lượng vào q trình đồng hóa CO2, nên lượng thừa dùng vào phản ứng quang oxy hóa dẫn đến suy giảm hoạt động quang hợp đến ngừng hẳn Như vậy, thí nghiệm này, CĐAS tăng từ 95 µmol m-2s-1 lên 120 µmol m-2 s-1 lượng CO2 cung cấp cho húng tây qua màng millipore khơng tăng dẫn đến tình trạng thừa lượng ánh sáng làm hư hỏng máy quang hợp khiến hóa vàng tăng trưởng húng tây bị chậm lại Đồng thời CĐAS cao, môi trường bị bốc nhanh dẫn đến việc hấp thu nước bị cản trở, vậy, tỷ lệ chất khô cao công thức nuôi cấy cường độ ánh sáng cao Dựa gia tăng trọng lượng tươi trọng lượng khô cây, húng tây nuôi cấy QTD tăng trưởng tốt so với nuôi cấy theo phương pháp truyền thống (nuôi cấy QDD) Kết tương tự với kết Nguyễn Trí Minh & Nguyễn Thị Quỳnh (2008) [9] nuôi cấy dâu tây (Fragaria ananassa Duch.) Cây dâu tây nuôi cấy QTD (môi trường không bổ sung đường vitamin với số lần trao đổi khí 2,3 lần/giờ) tăng trưởng tốt so với dâu tây ni cấy QDD (mơi trường có 30 g L-1 đường sucrose vitamin MS, với số lần trao đổi khí 0,3 lần/giờ) Khi CĐAS tăng lên 120 µmol m-2 s-1 chiều cao húng tây giảm công thức nuôi cấy QDD lẫn nuôi cấy QTD (bảng 2) Nguyen & Kozai (2005) [8] cho thấy nuôi cấy quang tự dưỡng Neem (Azadirachta indica), chiều cao Neem nhỏ nuôi cấy cường độ ánh sáng tăng đến 230 µmol m-2 s-1 Ngược lại, nuôi cấy Neem cường 240 độ ánh sáng 70 µmol m-2 s-1 chiều cao đạt lớn KẾT LUẬN Khi nuôi cấy húng tây (Thymus vulgaris) điều kiện nhiệt độ 24 ± 2oC, ẩm độ tương đối 50 ± 5%, hình thành chồi tăng trưởng húng tây in vitro chịu ảnh hưởng yếu tố hóa học lẫn vật lý Nồng độ loại CĐHSTTV ảnh hưởng rõ rệt lên tạo cụm chồi húng tây in vitro Đốt thân húng tây ni cấy mơi trường khống MS có bổ sung 30 g L-1 đường sucrose, mg L-1 BA, 0,5 mg L-1 IBA tạo nhiều chồi Cây húng tây hồn tồn phát triển điều kiện nuôi cấy QTD (môi trường không bổ sung đường vitamin) tăng trưởng tốt CĐAS 95 µmol m-2s-1 Lời cảm ơn: Nghiên cứu nhận hỗ trợ trang thiết bị Phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Cơng nghệ Tế bào Thực vật kỹ thuật cô Trịnh Thị Thanh Vân TÀI LIỆU THAM KHẢO Bùi Trang Việt, 2002 Sinh lý thực vật đại cương, Phần II: Phát triển Nxb Đại học quốc gia Hồ Chí Minh, 78-121 Duncan D B., 1955 Multiple range and multiple F test Biometrics, 11: 1-42 Furmanowa M and Olszowska O., 1992 Micropropagation of Thyme (Thymus vulgaris L.) In Bajaj Y P S (ed.) Biotechnology in Agriculture and Forestry Springer-Verlay, Berlin Heideberg, 19: 230243 Hdider C and Dejardins Y., 1994 Effects of sugar on photosynthesis and phosphoenolpyruvate carboxylase activity of in vitro cultured strawberry plantlets Plant Cell Tiss Org Cult., 36: 27-33 Lê C L., 1989 Microbouturage in vitro du thym (Thymus vulgaris L.) Revue suisse Vitic Arboric Hortic., 21: 355-358 Morel G and Wetmore R H., 1951 Fern tissue culture Am J Bot., 38: 141-143 Nguyen Thuy Phuong Duyen, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Thi Quynh Murashige T and Skoog E., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissues Physiol Plant, 15: 473-497 11 Sáez F., Sánchez P and Piqueras A., 1994 Micropagation of Thymus piperella Plant Cell Tiss Org Cult., 39: 269-272 Nguyen T Q and Kozai T., 2005 Photoautotrophic micropropagation of woody species In Kozai T., Afreen F and Zobayed S M A., eds Photoautotrophic (sugar-free medium) micropropagation as new micropropagation and transplant production system Springer, Dordrecht, The Netherlands, 123-146 12 Skoog F., Miller C O., Okumura F S., Vo Saltza M H and Strong F M., 1955 Structure and synthesis of Kinetin J Am Chem Soc., 77: 2662-2665 Nguyễn Trí Minh Nguyễn Thị Quỳnh, 2008 Ảnh hưởng đường, trao đổi khí giá thể lên sinh trưởng dâu tây (Fragaria ananassa Duch.) in vitro tỷ lệ sống dâu tây ex vitro Tạp chí Sinh học, 30(2): 45-49 10 Ozgen M and Tansi S., 1996 Drug yield and essential oil of Thymus vulgaris L as influenced by ecologycal and ontogenetical variation Trop J Agric For., 22: 537-542 13 Stahl-Biskup E and Sáez F., 2002 Thyme The genus Thymus Taylor & Francis, London, UK, 330 14 Taiz L and Zeiger E., 2002 Photosynthesis: Physiological and Ecological Considerations Physiol Plant, 3rd edition Sinauer Associates, Sunderland, England, 171-190 15 Vũ Văn Vụ, 2009 Sinh lý học thực vật NXB Giáo Dục Việt Nam, 139-147 16 Wetztein H I and Sommer H E., 1982 Leaf anatomy of tissue cultured Liquidambar styraciflua (Hamamelidaceae) during acclimatization Am J Bot., 69: 1579-1586 A STUDY ON GROWTH ABILITY OF Thymus vulgaris L UNDER IMPACT OF CHEMICAL AND PHYSICAL FACTORS OF CULTURE MEDIUM Nguyen Thuy Phuong Duyen, Hoang Ngoc Nhung, Nguyen Thi Quynh Institute of Tropical Biology, VAST SUMMARY Thyme plants (Thymus vulgaris L.) belonging to the family Lamiaceae have been used as ingredients in food processing and drugs in treating respiratory, gastrointestinal or nervous disorders, thanks to the secondary metabolites, such as thymol and carvacrol, existing in its leafy essential oils However, the formation and accumulation of thyme oils are mostly affected by the variation of environmental and ecological systems This study aimed to find appropriate conditions for the in vtro growth of thyme plants under stable and controlled temperature (T 24 ± 2oC) and relative humidity (RH 50 ± 5%) On day 28, the number of shoots was the largest (4.3 shoots/explants) when nodal explants containing dormant buds were cultured on the MS medium suplemented with mg L-1 BA, 0,5 mg L-1 IBA and 30 g L-1 sucrose under PPF of 40 µmol m-2 s-1 and photoperiod of 12 h d-1 When cultured photoautotrophically (on sugar-free medium), in vitro thyme plants derived from nodal cuttings grew significantly on MS salt medium having macro-elements 1/2 and supplemented with 200 mg L-1 KNO3 and 200 mg L-1 KH2PO4 under the PPF of 95 µmol m-2 s-1 and photoperiod of 12 h d-1 on day 35 Key words: Thymus vulgaris L., essential oil, plant growth substance, photoautotrophic culture Ngày nhận bài: 21-6-2012 241 ... (Pn) húng tây theo thời gian nuôi cấy Cây húng tây nuôi cấy điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng (môi trường khơng đường, khơng vitamin) có tăng trưởng tốt so với nuôi cấy quang dị dưỡng (môi trường. .. LUẬN Khi nuôi cấy húng tây (Thymus vulgaris) điều kiện nhiệt độ 24 ± 2oC, ẩm độ tương đối 50 ± 5%, hình thành chồi tăng trưởng húng tây in vitro chịu ảnh hưởng yếu tố hóa học lẫn vật lý Nồng độ... (2008) [9] nuôi cấy dâu tây (Fragaria ananassa Duch.) Cây dâu tây nuôi cấy QTD (môi trường không bổ sung đường vitamin với số lần trao đổi khí 2,3 lần/giờ) tăng trưởng tốt so với dâu tây ni cấy QDD