Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng .... Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian ch
Trang 1ĐẠI HỌC QUỐC GIA THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH
TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN
LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC
NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS TS NGUYỄN THỊ QUỲNH
TP HỒ CHÍ MINH, NĂM 2012
Trang 2LỜI CÁM ƠN
Để hoàn thành luận văn, em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến:
Cô PGS TS Nguyễn Thị Quỳnh, người đã giảng dạy, tận tình hướng dẫn và truyền
đạt nhiều kinh nghiệm quý báu và động viên em rất nhiều trong suốt thời gian họctập và thực hiện luận văn Đó sẽ mãi là hành trang trên suốt chặng đường học tập
và rèn luyện của em sau này
Em xin được bày tỏ lời cảm ơn đến tất cả Thầy Cô Bộ môn Sinh lý Thực vật đã
truyền đạt kiến thức, giúp đỡ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho em trong thời gianhọc tập và thực hiện luận văn tốt nghiệp
Các bạn chuyên ngành Sinh lý Thực vật: chị Hồng Anh, chị Linh, chị Diệu, chị
Mỹ, chị Xuân, Trúc mập đã luôn động viên và giúp đỡ Nhung suốt thời gian học
tập
Em xin chân thành cám ơn chị Vân, anh Hiến đã chia sẻ kinh nghiệm và giúp đỡ
em thực hiện đề tài này
Cám ơn gà mẹ, gà mập, gà ngố đã luôn quan tâm và giúp đỡ Nhung trong suốt thời
gian thực hiện luận văn
Cuối cùng, con xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc nhất đến Bố Mẹ, những người đã sinh
thành, chăm sóc, yêu thương, dạy bảo và luôn tạo những điều kiện tốt nhất để con
có thể học tập và hoàn thành tốt nhất luận văn tốt nghiệp
Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 12 tháng 09 năm 2012
Hoàng Ngọc Nhung
Trang 3i 129
MỤC LỤC
MỤC LỤC i
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT v
DANH MỤC BẢNG vi
DANH MỤC HÌNH viii
MỞ ĐẦU 1
1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3
1.1 Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba Kitagawa 3
1.1.1 Phân loại 3
1.1.2 Đặc điểm thực vật 4
1.1.3 Phân bố sinh thái 4
1.1.4 Thành phần hóa học 5
1.1.5 Công dụng dược lý 6
1.1.6 Trồng và chế biến (Fukuda và cs, 2009) 6
1.2 Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa 8
1.2.1 Trong nước 8
1.2.2 Ngoài nước 9
1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật 10
1.3.1 Nuôi cấy lớp mỏng tế bào 10
1.3.2 Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation) 12
1.3.3 Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation) 17
1.4 Những đặc điểm của một số yếu tố hóa học và vật lý in vitro và ảnh hưởng của chúng đối với sinh trưởng của cây 25
1.4.1 Yếu tố hóa học 25
Trang 41.4.2 Yếu tố vật lý 28
2 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 33
2.1 Vật liệu 33
2.1.1 Vật liệu thí nghiệm 33
2.1.2 Vật liệu sinh trắc nghiệm 33
2.1.3 Các dụng cụ sử dụng trong thí nghiệm 33
2.1.4 Các thiết bị sử dụng trong thí nghiệm 33
2.1.5 Các hóa chất sử dụng trong thí nghiệm 34
2.1.6 Giá thể sử dụng trong thí nghiệm 34
2.2 Phương pháp 35
2.2.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau 35
2.2.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro 37
2.2.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng 39
2.2.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng 41
2.2.5 Quan sát hình thái giải phẫu 42
2.2.6 Hàm lượng chlorophyll a, b (mg/g lá khô) 42
2.2.7 Hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 43
2.2.8 Hàm lượng đường tổng số, hàm lượng tinh bột 45
2.2.9 Hiệu suất quang hợp thuần P n (µmol mol -1 h -1 /cây) 46
2.2.10 Tốc độ tăng trưởng tương đối (Relative growth rate, RGR) (mg mg -1 ngày -1 ) và hiệu suất đồng hóa thuần (Net assimilation rate, NAR) (mg cm -2 ngày -2 ) 47
Trang 5131 3
2.2.11 Chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng 47
2.3 Phương pháp tính toán số liệu 48
2.3.1 Tỷ lệ (%) cây sống trong giai đoạn ex vitro 48
2.3.2 Gia tăng trọng lượng tươi (GTTLT) (mg/cây) 48
2.3.3 Gia tăng trọng lượng khô (GTTLK) (mg/cây) 48
2.3.4 Tỷ lệ trọng lượng thân lá/rễ 48
2.3.5 Số lá (SL) (lá/cây) 48
2.3.6 Chiều cao tán (CCT) (mm/cây) 49
2.3.7 Chiều dài rễ (CDR) (mm/cây) 49
2.3.8 Phần trăm chất khô (% CK) 49
2.3.9 Diện tích lá (DTL) (cm 2 /cây) 49
2.4 Phân tích thống kê 49
2.5 Nơi thực hiện đề tài nghiên cứu của luận văn 49
3 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 50
3.1 Kết quả 50
3.1.1 Thí nghiệm 1: Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các nguồn vật liệu khác nhau 50
3.1.2 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro 58
3.1.3 Thí nghiệm 3: Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng 67
3.1.4 Thí nghiệm 4: Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng 80
3.2 Thảo luận 95
Trang 63.2.1 Ảnh hưởng của CĐHSTTV lên sự tạo chồi đương quy Nhật Bản từ các
nguồn vật liệu khác nhau 95
3.2.2 Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuôi cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro 98
3.2.3 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng 102
3.2.4 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng 108
4 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 115
4.1 Kết luận 115
4.2 Đề nghị 115
TÀI LIỆU THAM KHẢO 116
Tài liệu tiếng Việt 116
Tài liệu tiếng Anh 117 PHỤ LỤC
Trang 7133 5
DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT
CĐHSTTV: Chất điều hòa sinh trưởng thực vật
NAA: 1-naphthalene acetic acid
TDZ: 1-phenyl-3-(1,2,3-thiadiazol-5-yl)urea
Pn: Hiệu suất quang hợp thuần (Net photosynthesis rate)
TGCS: Thời gian chiếu sáng
GTTLT: Gia tăng trọng lượng tươi
GTTLK: Gia tăng trọng lượng khô
Trang 8DANH MỤC BẢNG
Bảng 2.1 Bảng bố trí thí nghiệm 1 36
Bảng 2.2 Bảng bố trí thí nghiệm 2 37
Bảng 2.3 Bảng bố trí thí nghiệm 3 40
Bảng 2.4 Bảng bố trí thí nghiệm 4 41
Bảng 3.1 Sự hình thành chồi đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy 51
Bảng 3.2 Tỷ lệ chồi hình thành theo vị trí lát cắt sau 42 ngày nuôi cấy 53
Bảng 3.3 GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ và TLK rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy trong điều kiện QTD và QDD vào ngày nuôi cấy thứ 42 58
Bảng 3.4 CCT, CDR, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày nuôi cấy 60
Bảng 3.5 Hàm lượng chlorophyll a, b, chlorophyll a + b và tỷ lệ chlorophyll a/b của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở các điều kiện nuôi cấy khác nhau sau 42 ngày 60
Bảng 3.6 GTTLT, GTTLK, % CK, TLT rễ, TLK rễ và % CK rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro sau 150 ngày trồng ở vườn ươm 63
Bảng 3.7 Chiều cao tán, chiều dài rễ, số lá mở và diện tích lá của cây đương quy Nhật Bản ex vitro sau 150 ngày ở vườn ươm 66
Bảng 3.8 GTTLT và GTTLK của cây đương quy Nhật Bản dưới tác động của các thành phần khoáng và giá thể vào ngày nuôi cấy thứ 21 và 42 67
Bảng 3.9 TLT rễ, TLK rễ, tỷ lệ cây có rễ thứ cấp và CDR của cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 70
Bảng 3.10 SL héo, SL mở và DTL của cây đương quy Nhật Bản in vitro ở ngày nuôi cấy thứ 21 và 42 76
Bảng 3.11 Hàm lượng chl a, chl b, chl a+b và tỷ lệ chl a/b của lá cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 78
Trang 9Bảng 3.12 Cường độ ánh sáng, thời gian chiếu sáng và lượng ánh sáng cung cấp/ngày
tương ứng của từng nghiệm thức trong thí nghiệm 4 80
Bảng 3.13 GTTLT, GTTLK và tốc độ tăng trưởng tương đối (RGR) của cây đương
quy Nhật Bản vào ngày nuôi cấy thứ 42 81
Bảng 3.14 % CK, TLK thân lá/rễ, TLK rễ và TLK lá của cây đương quy Nhật Bản sau
42 ngày nuôi cấy 85
Bảng 3.15 SL mới, SL mở, DTL mới và DTL mở của cây đương quy Nhật Bản sau 42
ngày nuôi cấy 86
Bảng 3.16 Tỷ lệ chl a/b, chiều dài (CD) khí khổng, Chiều rộng (CR) khí khổng và số
lượng khí khổng (SLKK) của cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 89
Bảng 3.17 Hiệu suất đồng hóa thuần (NAR), đường tổng và tinh bột của cây đương
quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 92
Bảng 3.18 Hoạt tính các CĐHSTTV nội sinh trong cây đương quy Nhật Bản sau 42
ngày nuôi cấy 93
Bảng 3.19 Hàm lượng các ion đa lượng và tỷ lệ ion giữa các môi trường 106
Trang 108 136
DANH MỤC HÌNH
Hình 1.1 Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi 3
Hình 1.2 Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản 5 Hình 1.3 Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung Quốc (Fukuda và cs, 2009) 7
Hình 1.4 Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí 19
Hình 1.5 Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a) 22
Hình 2.1 Mẫu ban đầu: (a) phiến lá, (b) cuống lá, (c) chồi 35
Hình 2.2 Chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro 37
Hình 2.3 Sơ đồ ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật 43
Hình 3.1 % mẫu tạo chồi theo thời gian 50
Hình 3.2 Cụm chồi đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức vào ngày nuôi cấy thứ 42 52
Hình 3.3 Sự phát sinh chồi từ lớp mỏng chồi đương quy Nhật Bản 54
Hình 3.4 Sự biến đổi của phiến lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 55
Hình 3.5 Sự biến đổi hình thái của cuống lá ở các nghiệm thức vào ngày thứ 42 56
Hình 3.6 Cây đương quy Nhật Bản in vitro sau 42 ngày nuôi cấy 59
Hình 3.7 Nồng độ CO2 bên ngoài (OUT) phòng nuôi cây và bên trong (IN) hộp nuôi cây ở hai nghiệm thức QTD và QDD theo thời gian 61
Hình 3.8 Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy 62
Hình 3.9 Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 150 64
Hình 3.10 Cây đương quy Nhật Bản in vitro trồng tại vườn ươm ngày thứ 100 65
Hình 3.11 Bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản sau 150 ngày trồng tại vườn ươm 65
Hình 3.12 Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy trên các thành phần khoáng và giá thể khác nhau 69
Trang 119 137
Hình 3.13 Rễ đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới ảnh hưởng của khoáng
và giá thể 72
Hình 3.14 Sự hình thành rễ bất định của cây đương quy Nhật Bản ở nghiệm thức EV
(khoáng Enshi, giá thể Vermiculite) 73
Hình 3.15 Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên tỷ lệ trọng lượng khô thân
lá/rễ của cây đương quy Nhật Bản in vitro vào ngày nuôi cấy thứ 42 75
Hình 3.16 Pn của cây đương quy Nhật Bản theo thời gian nuôi cấy 79
Hình 3.17 Cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy dưới tác động của thời gian
chiếu sáng và cường độ ánh sáng 82
Hình 3.18 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên TLT lá và
TLT rễ của cây đương quy Nhật Bản ở ngày nuôi cấy thứ 42 84
Hình 3.19 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều cao tán
và chiều dài rễ cây đương quy Nhật Bản sau 42 ngày nuôi cấy 88
Hình 3.20 Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên chiều dài
chiều rộng và số lượng khí khổng sau 42 ngày nuôi cấy 90
Hình 3.21 Pn của cây đương quy Nhật Bản in vitro theo thời gian nuôi cấy 91
Trang 12Luận văn thạc sĩ Danh mục
DANH MỤC CÁC BẢNG
Bảng 1.1 Vai trò và chức năng các protein đặc trưng của virus cúm A 3
Bảng 1.2 Các epitope virus cúm ở người được lựa chọn để kiểm tra khả năng phòng ngừa virus 8
Bảng 1.3 Danh sách các epitope đã được dự đoán bằng phương pháp Tin Sinh học bởi đề tài KC.04.18/06-10 15
Bảng 2.1 Trình tự nucleotide của các mồi sử dụng trong luận văn 28
Bảng 2.2 Thành phần gel điện di polyacrylamide 12,5% 42
Bảng 3.1 Kết quả đo nồng độ plasmid pVFT-hab 53
Bảng 3.2 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng với các nồng độ IPTG khác nhau 61
Bảng 3.3 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2-HAeB theo các nồng độ IPTG cảm ứng 62
Bảng 3.4 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các nhiệt độ khác nhau 63
Bảng 3.5 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các nhiệt độ cảm ứng khác nhau 63
Bảng 3.6 Mật độ tế bào (OD600) sau 4 giờ cảm ứng ở các tốc độ lắc khác nhau 65
Bảng 3.7 Kết quả định lượng bằng phần mềm Quantity One tỉ lệ GST-H:1,2- HAeB theo các tốc độ lắc khác nhau 65
Bảng 3.8 Kết quả phân tích hàm lượng và độ sạch mẫu protein tinh chế bằng đo hấp thu quang phổ 68
Trang iii
Trang 13DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, TỪ VIẾT TẮT
ANN artificial neural network
CEP conformational epitope prediction
DNA deoxyribose nucleic acid
dH2O distilled water (nước cất)
dNTP deoxynucleotide triphosphate
ĐHKHTN Đại học Khoa học Tự nhiên
ĐHQG-HCM Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh
E coli Escherichia coli
EDTA ethylene diamine tetra acetic acid
ELISA enzyme-linked immunosorbent assay
GST gluthathione-S-tranferase
HAeB epitope hemagglutinin H5N1 được nhận diện bởi tế bào B
IFA incomplete Freund adjuvant
IPTG Isopropyl-β-D-thio-galactoside
Kan r kanamycin resistance (kháng kanamycin)
Trang i
Trang 14MCS multiple cloning site
MHC major histocompatibility complex
PBS phosphate buffered saline
PBST phosphate buffered saline tween
PCR polymerase chain reaction
PMSF phenyl methyl sulphonyl fluoride
PTN.CNSHPT Phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Phân tử
RNase ribonuclease (enzyme thuỷ giải RNA)
SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresisTEMED N, N, N’, N’-tetramethyl-ethane-1,2-diamine
Trang ii
Trang 15MỞ ĐẦU
Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) là loài
thảo dược lâu năm được sử dụng trong rất nhiều đơn thuốc tại Nhật Bản và nhiều quốcgia châu Á trong đó có Việt Nam Cây đương quy Nhật Bản được trồng rộng rãi tạichâu Á nhờ vào bộ rễ có chứa nhiều hợp chất có tính dược liệu cao và các lá non có thể
ăn được (Ninh và cộng sự, 2006) Chỉ tính riêng tại Nhật Bản, sản lượng rễ đương quyNhật Bản năm 2005 đạt xấp xỉ 197 tấn trong khi nhu cầu thực sự là vào khoảng
450 tấn hoặc nhiều hơn Do đó, một lượng lớn rễ đương quy Nhật Bản trồng tại Trung quốc được nhập vào Nhật Bản (Fukuda và cs, 2009)
Cây đương quy Nhật Bản được trồng tại Việt Nam từ những năm 1990 để thuhoạch rễ dùng làm nguồn nguyên liệu thô cho ngành công nghiệp sản xuất dược liệu.Thời gian trồng cây đương quy Nhật Bản tại Nhật Bản là 2 năm để thu được rễ trưởngthành trong khi tại Việt Nam, do rất nhiều yếu tố bất lợi, thời gian trồng cây chỉ là 1năm, do đó, sản lượng thấp (Phạm Văn Ý, 2000) Trong suốt quá trình phát triển, câyđương quy Nhật Bản chịu tác động rất lớn từ các yếu tố môi trường chẳng hạn như sựtấn công của sâu bệnh và côn trùng ảnh hưởng trực tiếp đến sản lượng và chất lượng.Khả năng sản xuất thấp cũng như các điều kiện tự nhiên không thuận lợi đã hạn chếviệc mở rộng diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản Chính vì vậy, tại Việt Nam,80% lượng rễ đương quy Nhật Bản được nhập từ Trung Quốc (Viện dược liệu, 2000).Bên cạnh những khó khăn trong vấn đề canh tác, một trong những lý do khiếngiống cây thuốc quý này đang mất dần đi tại Việt Nam là do chất lượng giống khôngđồng nhất và thiếu hụt Cây đương quy Nhật Bản hiện nay vẫn được trồng bằng phươngpháp gieo hạt Tuy nhiên, hạt đương quy Nhật Bản được gieo trồng tốt nhất là trongđiều kiện lạnh và phải gieo ngay sau khi hạt được thu hoạch bởi vì khả năng sống rấtngắn và mất đi sức nảy mầm nhanh chóng của chúng (Huxley, 1992)
Từ những lý do trên, đề tài: “Khảo sát sự tăng trưởng in vitro của cây đương quy
Trang 16Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) dưới tác động của một số
yếu tố hóa học và vật lý” đã được tiến hành nhăm tim ra biện pháp nhân giống loài câynày để tạo ra nguồn giống lớn, đồng nhất, đồng thời tìm ra môt sô điều kiện tối ưu đểgia tăng sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản Bên cạnh đó, một số chỉ tiêu sinh
lý cũng được nghiên cứu nhằm giúp hiểu rõ hơn sự tăng trưởng của cây trong các điều
kiện in vitro khác nhau.
Trang 171 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Giới thiệu sơ lược về cây Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa
Chi (Genus): Angelica
Loài (Species): Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa
Tên thường gọi ở Nhật là Touki, ở Việt Nam là cây đương quy Nhật Bản
Hình 1.1 Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi
Ghi chú: A: hoa; B: hạt; C: rễ cây đương quy Nhật Bản đã phơi khô sau thu hoạch
( http://www.nippon-shinyaku.co.jp/herb/db/arekore/01_10/angelica_acutiloba.html )
Trang 181.1.2 Đặc điểm thực vật
Cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba (Siebold & Zucc.) Kitagawa) là loài
thực vật thân thảo lớn, sống nhiều năm, cao 40 – 80 cm, không lông Lá mọc so le, ởphía dưới có cuống dài 10 – 30 cm, gốc có bẹ ngắn dạng máng, xẻ lông chim 1 – 2 lần,
lá chét phân thùy hình mác dài 2 – 7 cm, rộng 1 – 3 cm, có cuống ngắn hoặc khôngcuống; các thùy lại phân nhỏ, gốc hình nêm, đầu nhọn, mép có răng to sắc; lá ở phíangọn tiêu giảm Cụm hoa là tán kép, có cuống dài từ 5 – 20 cm gồm 25 – 40 tán; tổngbao và tiểu bao giống nhau có lá bắc dạng sợi; hoa nhỏ màu trắng lục nhạt; dài không
có răng, tràng năm cánh lõm ở đầu; nhị 5, bầu hình chóp ngược, có gân lồi Quả bế đôi,hơi dẹt, có cạnh và gân lồi, gân ở mép rộng dạng cánh (Đỗ Huy Bích và cs, 2003)
1.1.3 Phân bố sinh thái
Chi Angelica có khoảng 70 loài, phân bố chủ yếu ở vùng ôn đới Bắc bán cầu và
New Zealand Việt Nam đã 3 lần nhập giống cây đương quy Nhật Bản từ Trung Quốc(khoảng giữa năm 1960), Triều Tiên (1978) và gần đây là từ Nhật Bản (1996) Giốngcây đương quy Nhật Bản nhập từ Trung Quốc hiện không còn, hai giống còn lại vẫnđang được trồng ở các tỉnh Hà Giang, Lào Cai, xung quanh Hà Nội (Đỗ Huy Bích và cs,2003) Gần đây, diện tích trồng cây đương quy Nhật Bản được mở rộng từ cao nguyênđến khu vực sông Hồng (Ninh và cs, 2009)
Cây đương quy Nhật Bản ưa khí hậu ẩm mát, đến mùa đông toàn bộ phần trên mặtđất tàn lụi, phần củ dưới mặt đất chịu đựng được băng tuyết và mọc lại vào mùa xuânnăm sau Cây đương quy Nhật Bản trồng ở Việt Nam thường cũng phải lựa chọn thời
vụ, sao cho mùa gieo hạt và sinh trưởng của cây trùng với thời gian có nhiệt độ thấptrong năm Theo Phạm Văn Ý (2000), thời gian gieo hạt tốt nhất là đầu tháng 10 Việcgieo hạt vào thời điểm muộn hơn (tháng 11 đến tháng 2) sẽ dẫn đến tỷ lệ nẩy mầm cũngnhư trọng lượng của rễ thu được giảm đáng kể do nhiệt độ giảm mạnh ở thời điểm này
Trang 191.1.4 Thành phần hóa học
Cây đương quy Nhật Bản chứa nhiều các hợp chất hóa học khác nhau trong đóquan trọng nhất là tinh dầu Du và cs (2002) đã tiến hành phân tích các hợp chất cótrong tinh dầu cây đương quy Nhật Bản bằng GC-MS (sắc ký khí khối phổ) Kết quảcho thấy tinh dầu chứa 47 hợp chất khác nhau trong đó ligustilide (22,8%) vàbutylidenephthalide (19,5%) là những hợp chất chính
Theo Đỗ Huy Bích và cs (2003) các hợp chất có trong cây đương quy Nhật Bảngồm tinh dầu, coumarin, saccharid, acid amin, polyacetylen, sterol Tinh dầu ở rễ chiếm0,26%, chứa ligustilid 0,1941%, n-butylphtalid 0,0244%, n-butylidenephtalid
0,1762%, cnidilid, p cymen Tinh dầu ở lá chiếm 0,6 – 0,7% (so với khối lượng khôtuyệt đối), chứa γ-terpinen 36,5%, p cymen 17,1%, ligustilid 16,1%, myrcen 5,1%, β-ocimen 3,1%
Hình 1.2 Một số hợp chất hóa học chính có trong tinh dầu Cây đương quy Nhật Bản
Bighelli và các cs (2010) bằng phương pháp GC(RI), GC/MS và 13C-NMR đãphân tích các thành phần chính có trong tinh dầu của hạt đương quy Nhật Bản là
Trang 20dodecyl acetate (33,0%), (Z)-ligustilide (17,4%), dodecanol (7,1%), p-cymene(6,4%), gamma-terpinene (5,9%) và tetradecyneacetate (5,0%).
Theo Ninh và cs (2007) hàm lượng ligustilde là chỉ tiêu chính để xác định chấtlượng cho việc làm thuốc
Fukuda và cs (2009) đã tiến hành nghiên cứu chất lượng rễ cây đương quy NhậtBản được trồng tại Trung Quốc và Nhật Bản Trong đó thì các chất ligustilid, z-butylidenephtalid, falcarindiol, ferulic acid, adenosin, fructose, glucose, sucrose được
đo lường để xác định chất lượng rễ
1.1.5 Công dụng dược lý
Cây đương quy Nhật Bản 3 năm tuổi được đào vào mùa thu để lấy rễ Rễ được sấythan, cắt thành lát mỏng dùng làm thuốc Những lá non có thể ăn sống hoặc làm trà tươiuống Cây đương quy Nhật Bản là một vị thuốc dùng rất phổ biến trong đông y, là đầu
vị trong thuốc chữa bệnh phụ nữ, đồng thời được chỉ định trong nhiều đơn thuốc bổ vàtrị bệnh như thuốc chữa thiếu máu xanh xao, đau đầu, cơ thể gầy yếu, suy tim, mệt mỏi,đau lưng, đau ngực bụng, viêm khớp, chân tay đau nhức lạnh, tê bại, tê liệt, đại tiện táobón, mụn nhọt lở ngứa, tổn thương ứ huyết, kinh nguyệt không đều, đau kinh, bế kinh(uống trước khi thấy kinh 7 ngày) Ngày uống 10 – 20 g dạng thuốc sắc hoặc rượuthuốc (Đỗ Huy Bích và cs, 2003; Yoon và cs, 2007)
“Mekuri” là một phương pháp xử lý truyền thống được tiến hành bằng cách khoét một
Trang 21lỗ trên ngọn thân cây đương quy Nhật Bản để ngăn chặn sự tăng trưởng của cuống hoa.Cây con sau đó được chuyển sang cánh đồng và trồng nghiêng một góc 35 – 45o (Hình1.3).
Hình 1.3 Quy trình trồng cây đương quy Nhật Bản tại miền Bắc tỉnh Sichuan, Trung
Quốc (Fukuda và cs, 2009)
Thu hoạch và chế biến
Rễ cây đương quy Nhật Bản được thu hoạch từ giữa đến cuối tháng 12 của nămthứ hai Rễ đương quy Nhật Bản sau khi thu hoạch sẽ trải qua 2 lần làm khô Ở lần làmkhô đầu tiên, rễ được treo trên các kệ để làm khô một cách tự nhiên mà không cần bất
kỳ xử lý nào khác trong khoảng từ 2 – 3 tháng
Lần làm khô thứ hai được xử lý bằng phương pháp “Yumomi” Đầu tiên, rễ đượcngâm trong nước nóng (khoảng 55oC) khoảng 45 – 50 phút Bước thứ hai, rễ được chà
Trang 22xát một cách cẩn thận trên một bảng đựng nước nóng (nhiệt độ của nước là vào khoảng
45oC) để rửa sạch đất và và các chất bẩn Bước thứ ba, rễ được xếp cuộn lại Sau khitiến trình Yumomi kết thúc, rễ được phơi khô dưới mặt trời khoảng 3 – 4 ngày Sau đó,các chân lá còn lại sẽ được loại bỏ hoàn toàn Cuối cùng, rễ được xếp cẩn thận thànhtừng đống để làm khô cho tới khi rễ trở nên chắc, bền Lượng nước xấp xỉ 10 - 15% saukhi làm khô
1.2 Một số nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba (Siebold
& Zucc.) Kitagawa
1.2.1 Trong nước
Cây đương quy Nhật Bản được du nhập vào Việt Nam từ những năm 1990 và từ
đó đến nay đã có nhiều công trình về loài cây này ở Việt Nam được công bố Nổi bậtnhất trong các nghiên cứu về cây đương quy Nhật Bản tại Việt Nam là các công trìnhnghiên cứu tại Viện Dược liệu, Hà Nội (Viện Dược liệu, 2001) Có thể liệt kê một sốcông trình như: Nghiên cứu chọn lọc giống cây đương quy Nhật Bản thích hợp với điềukiện khí hậu miền Bắc Việt Nam; Trồng khảo nghiệm cây đương quy Nhật Bản
(Angelica acutiloba Kitagawa) tại 2 huyện Đồng Văn và Quản Bạ - Hà Giang; Nghiên cứu sơ chế và bảo quản rễ củ đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di thực từ Nhật Bản; Tác dụng sinh học của cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di
thực từ Nhật Bản; Kết quả thử tác dụng kích thích miễn dịch của Angala trên lâm sàng(Angala là thuốc kích thích miễn dịch bào chế từ chế phẩm polysaccharid toàn phầnchiết xuất từ rễ củ cây đương quy Nhật Bản); Nghiên cứu đa dạng hóa sản phẩm làm
thuốc từ cây đương quy Nhật Bản (Angelica acutiloba Kit.) di thực từ Nhật Bản; v.v.
Có thể nhận thấy các nghiên cứu này tập trung nghiên cứu cây đương quy Nhật Bảnngay từ khâu trồng trọt đến chế biến và tạo ra cũng như thử nghiệm các chế phẩm dượcliệu
Trang 23Bên cạnh đó, nhiều công trình về công dụng dược lý của cây đương quy Nhật Bảncũng đã được công bố chẳng hạn như: Nghiên cứu tác dụng của cây đương quy Nhật
Bản và cây đương quy Trung Quốc với hệ đông máu in vitro của Lê Kim Loan và cs
(1998); Tác dụng phục hồi miễn dịch của polysaccharid chiết xuất từ rễ cây đương quy
Nhật Bản (Angelica acutiloba Kitagawa) thông qua thông báo số 2: Tác dụng phục hồi
đáp ứng miễn dịch dịch thể và đáp ứng miễn dịch tế bào của Nguyễn Gia Chấn và cs(1998)
Năm 2000, Phạm Văn Ý thực hiện luận án tiến sĩ với đề tài “Nghiên cứu, tuyển
chọn và xây dựng quy trình sản xuất Angelica acutiloba Kitagawa di thực vào miền Bắc
Việt Nam”
Năm 2009, Ninh và cs cũng đã tiến hành nghiên cứu về ảnh hưởng của việc xử lýhạt bằng gibberellin (GA3), kinetin và nhiệt độ lên nảy mầm và sinh trưởng của cây con
A acutiloba Kitagawa.
Năm 2012, Hoàng Ngọc Nhung và cs đã tiến hành nghiên cứu sự phát sinh cơ
quan từ lớp mỏng tế bào cây đương quy Nhật Bản Angelica acutiloba Kitagawa nuôi cấy in vitro bằng cách sử dụng vật liệu là lớp mỏng chồi và phiến lá để tạo chồi và rễ.
1.2.2 Ngoài nước
Cây đương quy Nhật Bản được nghiên cứu ở nhiều nước từ rất sớm, tuy nhiên, đaphần các nghiên cứu tập trung chứng minh công dụng dược liệu của loài cây này.Kumazawa và cs (1982) đã tiến hành ly trích polysaccharide có trong dịch trích rễ câyđương quy Nhật Bản và nhận thấy rằng nó có khả năng kích thích hệ thống miễn dịchcủa cơ thể Hatano và cs (2004) đã chứng minh rằng dịch trích từ rễ cây đương quyNhật Bản tăng cường sự tạo máu bằng cách hoạt hóa các tế bào hồng cầu chưa trưởngthành của chuột Thêm vào đó, Yoon và cs (2007) cũng nhận thấy rằng dịch trích từ rễcây đương quy Nhật Bản còn có vai trò điều hòa đại thực bào của chuột phản ứng lạivới sự viêm
Trang 24Bên cạnh công dụng dược lý, dịch trích từ rễ cây đương quy Nhật Bản còn đượcxem như là một loại thuốc trừ sâu tự nhiên Miyazawa và cs (2004) đã chứng minh khả
năng chống lại ruồi Drosophila melanogaster nhờ vào các hợp chất phthalides và
furanocoumarins có trong dịch trích từ cây đương quy Nhật Bản Khả năng trừ sâu củadịch trích cây đương quy Nhật Bản được so sánh với rotenone, một hợp chất hóa họckhông mùi được sử dụng rộng rãi trong việc trừ sâu bệnh Kết quả cho thấy (Z)-butylidenephthalide có hoạt tính trừ sâu mạnh hơn cả rotenone Các tác giả này nhậnđịnh rằng hợp chất này rất có thể là một tác nhân mới trong việc điều khiển sâu bệnh.Watanabe và cs (1998) đã khảo sát sự tạo cụm chồi từ nuôi cấy chồi ngọn
Angelica acutiloba Kitagawa trên môi trường MS có bổ sung NAA và kinetin để tạo
nguồn vật liệu nghiên cứu nhận dạng hình thái DNA
Ninh Thị Phíp và cs (2006, 2007) tại đại học Chiba, Nhật Bản, đã nghiên cứu về
sự nảy mầm của hạt và ảnh hưởng của nồng độ dung dịch dinh dưỡng trong hai hệthống khí canh và thủy canh lên sự phát triển của cây đương quy Nhật Bản Nhật Bảnngoài vườn ươm Hệ thống khí canh giúp cây phát triển tốt hơn, tuy nhiên do các rễ thứcấp là nguyên liệu thô dùng làm thuốc tại Việt Nam, hệ thống thủy canh được xem như
là thích hợp hơn vì hệ rễ thứ cấp phát triển trong hệ thống thủy canh tốt hơn
1.3 Nuôi cấy mô tế bào thực vật
1.3.1 Nuôi cấy lớp mỏng tế bào
Phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào (TCL) được mô tả bởi Tran Thanh Van
K (1973) và được thực hiện lần đầu tiên trên cây thuốc lá Với hệ thống này, TranThanh Van K tách một hay vài lớp tế bào thực vật đã biệt hóa ra khỏi mạng lưới tươngquan giữa cơ quan/mô /tế bào của thực vật, và chương trình hóa lại chúng trong nuôi
cấy in vitro Quá trình “biệt hóa” là tiêu chuẩn quan trọng nhất để theo dõi mẫu cấy.
Điều này cho phép các nhà nghiên cứu tế bào thực vật lần theo dấu vết những sự kiện
Trang 25tại mỗi thời điểm bắt đầu Hệ thống nuôi cấy lớp mỏng tế bào thường được chia thành
2 loại chính:
- Lớp mỏng cắt theo chiều dọc cơ quan (lTCL), mẫu được thu nhận (cắt) theochiều dọc với kích thước khoảng 1 mm x 0,5 hoặc 1,0 mm lTCL chỉ mangmột loại mô, ví dụ như lớp tế bào biểu bì
- Lớp mỏng cắt theo chiều ngang cơ quan (tTCL), mẫu được thu nhận theochiều ngang với bề dày khoảng 0,2 – 0,5 mm hoặc 3 – 6 lớp tế bào tTCLmang một số lượng nhỏ tế bào của nhiều loại mô khác nhau như: biểu bì, nhu
mô vỏ, tượng tầng, mô mạch, nhu mô lõi
Một số ưu điểm của phương pháp nuôi cấy lớp mỏng tế bào
- Diện tích tiếp xúc của lớp mỏng tế bào với môi trường lớn, do đó tế bào dễdàng hấp thu chất dinh dưỡng từ môi trường
- Dễ định vị vùng cho phản ứng do chỉ có một vài lớp tế bào
- Lượng chất điều hòa sinh trưởng thực vật (ĐHSTTV) nội sinh trong mẫuthấp nên các CĐHSTTV ngoại sinh dễ tác động lên mẫu
- Mẫu nuôi cấy đồng nhất và đáp ứng nhanh với các cảm ứng
- Tạo thực vật hoàn chỉnh ít bị biến dị
- Giảm sự phân cực tế bào
- Tương tác giữa các cơ quan thực vật với toàn bộ cơ thể thực vật được triệttiêu
Trang 26- TCL cho phép sự tăng trưởng sạch bệnh của những tế bào đã hoặc không biệt hóa trong thời gian ngắn, dưới điều kiện có thể kiểm soát.
- Có thể thu nhận, tách chiết và tinh sạch những protein lạ từ sinh khối, dịch nuôi cấy TCL
- Giúp tạo ra số lượng lớn mô hay cơ quan mong muốn có thể giúp sản xuấtvượt mức một protein lạ
1.3.2 Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation)
1.3.2.1 Sơ lược về phương pháp vi nhân giống truyền thống
Vi nhân giống truyền thống là hình thức nhân giống in vitro mà môi trường nuôi
cấy có sự hiện diện của đường, vitamin hoặc một số chất hữu cơ như CĐHSTTV, dịchchiết nấm men Theo định nghĩa của Kozai và Kubota (2005a), nuôi cấy in vitro thông
thường hay còn gọi là nuôi cấy truyền thống bao gồm nuôi cấy dị dưỡng (heterotrophy)
và nuôi cấy quang dị dưỡng Trong đó, dị dưỡng là hình thức nuôi cấy mà nguồn carbonhữu cơ trong môi trường dinh dưỡng là nguồn năng lượng duy nhất Ở hình thức này,mẫu cây hoặc mô thực vật hoàn toàn không có chức năng quang hợp, không có các cơquan chuyên biệt (lục lạp) để thực hiện quang hợp, và sống hoàn toàn dựa vào nguồncarbon hữu cơ từ các hợp chất hữu cơ trong môi trường nuôi cấy Đây là trường hợpnuôi cấy các mô sẹo đặt trong tối Còn quang dị dưỡng (photomixotrophy) là hình thứcnuôi cấy mà mẫu cây hoặc mô thực vật sử dụng cả hai nguồn là carbon vô cơ từ CO2trong không khí và nguồn carbon hữu cơ có được từ các chất hữu cơ trong môi trườnglàm nguồn năng lượng Tất cả các dạng tế bào, mô, cơ quan hay cây con đã hình thànhlục lạp được nuôi cấy trên môi trường có đường đặt dưới một điều kiện ánh sáng nào đóđều thuộc hình thức nuôi cấy này
Đặc điểm chung của vi nhân giống truyền thống (vi nhân giống quang dị dưỡng)
là nuôi cấy kín (nhằm ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật), sử dụng đường và một sốhợp chất có chứa carbon hữu cơ khác (vitamin, CĐHSTTV, nước dừa, v.v.) như mộtthành phần thiết yếu trong môi trường dinh dưỡng, trong đó đường được xem như
Trang 27nguồn cung cấp năng lượng duy nhất hoặc chủ yếu cho cây Hình thức này gây rakhông ít ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng, hình thái và đặc biệt là tỷ lệ sống của
cây in vitro khi đem ra điều kiện ex vitro Do đó để tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro, người ta bắt buộc phải thực hiện nhân giống in vitro qua nhiều giai đoạn khác nhau để
tạo được cây con có khả năng sống cao và từng bước thích nghi với điều kiện khắcnghiệt bên ngoài
1.3.2.2 Các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống
Theo Sahay và Verma (2000) nhân giống in vitro truyền thống (vi nhân giống
quang dị dưỡng) bao gồm bốn giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng
Giai đoạn 2: Nhân chồi
Giai đoạn 3: Tạo rễ và chuẩn bị cho sự phát triển trong điều kiện tự nhiên
Giai đoạn 4: Thuần hóa ex vitro
1.3.2.3 Nhược điểm của phương pháp vi nhân giống truyền thống
Mặc dù vi nhân giống theo lối truyền thống đã được nghiên cứu và ứng dụng quavài thập kỷ, được cải tiến khá nhiều để tăng hệ số nhân, giảm chi phí và phù hợp vớinhiều loài cây khác nhau, nhưng những nghiên cứu cải tiến này phần lớn vẫn tập trungvào vấn đề cải thiện các thành phần của môi trường hóa học (thành phần và nồng độkhoáng, loại và nồng độ đường, pH, v.v.) hay các biện pháp kiểm soát phát sinh hình
thái của thực vật nuôi cấy in vitro (loại và nồng độ của CĐHSTTV, loại vật liệu mẫu và
phương pháp xử lý với từng vật liệu mẫu khác nhau như đỉnh sinh trưởng, mô sẹo, tếbào đơn, lớp tế bào mỏng, v.v.) Trong khi đó, nhiều yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sinh lýthực vật như ánh sáng, nồng độ CO2, độ ẩm không khí, nhiệt độ môi trường, giá thể,v.v lại ít được quan tâm, và thực tế thì, nếu áp dụng vi nhân giống truyền thống, cũngkhó có thể cải thiện được Chính điều này đã làm cho phương pháp này còn mang một
số nhược điểm như:
Sự rối loạn về sinh lý, hình thái của thực vật in vitro
Trang 28Trong nuôi cấy in vitro, những mẫu thực vật được đặt vào một vi môi trường với điều kiện tối ưu nhất sự phát triển của cây (Hazarika, 2006) Các thực vật in vitro
thường được phát triển trong hộp nuôi cây kín vô trùng dưới cường độ ánh sáng thấp,trên môi trường nhiều thành phần khoáng và các hợp chất carbon hữu cơ cho phép sựphát triển cả tự dưỡng và dị dưỡng, cùng với không khí có độ ẩm tương đối cao Những
điều kiện đặc biệt trong suốt giai đoạn nuôi cấy in vitro dẫn đến kết quả là một số thực vật có sự phát triển bất thường về sinh lý và hình thái Thực vật in vitro trong nuôi cấy
truyền thống thường được mô tả với khả năng quang hợp yếu, sự bất thường trong chứcnăng khí khổng và sự giảm lớp sáp bề mặt (Hazarika, 2006) Nhiều nghiên cứu cho thấy
khí khổng của cây in vitro mất khả năng đóng khi cây được chuyển ra khỏi điều kiện nuôi cấy in vitro (Brainerd và Fuchigami, 1982; Wardle và Short, 1983) Cấu trúc khí
khổng và hoạt động của khí khổng bị bất thường là những yếu tố gây nên sự mất nước
nhanh chóng của cây nuôi cấy in vitro Hiện tượng thủy tinh thể cũng là một sự rối loạn
về hình thái và sinh lý của những cây được nhân giống theo kiểu truyền thống Ziv(1991) Mohamed-Yasseen và cs (1992) nhận thấy rằng ở các lá bị thủy tinh thể mật độkhí khổng thấp hơn so với các lá không bị thủy tinh thể Khí khổng bị biến dạng, đóngchặt và bít, tế bào nhu mô bề mặt bị kéo dài ra và rữa nát ở các lá bị thủy tinh thể Sựthay đổi của khí khổng và bề mặt lá khiến cho sự mất nước nhờ vào sự bốc thoát hơinước giảm kéo theo đó là sự gia tăng tích lũy nước trong các khoang và cuối cùng dẫnđến hiện tượng thủy tinh thể Kataeva và cs (1991) đã chứng minh rằng thủy tinh thểphụ thuộc vào lượng nước, hàm lượng vi lượng và sự cân bằng hormon trong môitrường Tuy nhiên, vi môi trường và sự tích lũy ethylene bên trong hộp nuôi cây cũng lànhững yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng thủy tinh thể
Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn cao
Việc sử dụng đường và các chất hữu cơ trong môi trường nuôi cấy của vi nhângiống truyền thống tạo nên điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật.Chính vì vậy trong vi nhân giống truyền thống, tạp nhiễm thực sự là một vấn đề lớn
Trang 29Các hộp chứa cây bị nhiễm thường phải bị loại bỏ do vi sinh vật phát triển quá mạnh,
lấn át chồi in vitro và phân giải các chất hữu cơ trong môi trường tạo nên nhiều chất độc
gây chết chồi cây nhanh chóng Tạp nhiễm làm hao hụt một lượng không nhỏ cây con
và góp phần làm tăng giá thành cây có nguồn gốc từ vi nhân giống
Tăng trưởng kém do hoạt động của bộ máy quang hợp yếu
Khả năng quang hợp của thực vật trong điều kiện vi nhân giống truyền thống bị ứcchế bởi nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là nồng độ đường và nồng độ CO2(Kubota, 2002)
Trong vi nhân giống truyền thống, đường được sử dụng như là nguồn carbonchính cung cấp năng lượng chủ yếu cho cây Việc bổ sung đường sucrose hay các loạiđường khác cũng như một số thành phần hữu cơ như nước dừa, chuối, vitamin, dịch
chiết nấm men, v.v., vào môi trường đã giúp thực vật in vitro phát triển tốt Một số
trong các thành phần này sau đó đã được sử dụng một cách rộng rãi và phổ biến, thậmchí gần như trở thành thiết yếu trong các môi trường nuôi cấy mô trong nhiều thập kỷ.Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đã có rất nhiều nghiên cứu thực hiện trên nhiềuloài cây khác nhau khẳng định ảnh hưởng không tốt của việc bổ sung đường vào môi
trường nuôi cấy lên khả năng quang hợp của thực vật in vitro Nghiên cứu của Hdider
và Desjardins (1994) trên cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch cv Kent) đã cho thấy
với nồng độ đường sucrose thấp (0 – 10 g/l), cây con có khả năng quang hợp tốt hơn,hiệu suất quang hợp cao hơn và điểm bù ánh sáng cũng thấp hơn một cách rõ rệt so với
ở nồng độ đường cao (30 – 50 g/l) Nghiên cứu của Capelladesl và cs (1991) trên cây
hoa hồng (Rosa multiflora L cv Montse) cũng cho thấy khả năng quang hợp và khả năng đáp ứng với ánh sáng của cây in vitro giảm rõ rệt khi nồng độ đường sucrose trong
môi trường nuôi cấy tăng Hình giải phẫu mô lá cho thấy có sự tích lũy các hạt tinh bộttrong lục lạp khi nồng độ đường cao đã làm giảm tỷ lệ tái tạo RuBP (Ribulose-1,5-bisphosphate) hoặc ức chế hoạt tính của men RuBisCO (Ribulose bisphosphatecarboxylase/oxygenase)
Trang 30Nồng độ CO2 trong hộp nuôi cấy thấp là một yếu tố quan trọng khác kiềm hãm
hoạt động quang hợp của cây in vitro Hộp nuôi cây in vitro truyền thống nhỏ và kín, vì
vậy, lượng CO2 trong hộp rất thấp và thiếu hụt cho hoạt động quang hợp của cây.Fujiwara và cs (1987) khi đo nồng độ CO2 trong hộp nuôi cây đã nhận thấy nồng độ
CO2 trong hộp kín chứa cây in vitro nuôi cấy theo phương pháp truyền thống giảm
xuống còn 70-80 µmol mol-1 sau 2 giờ chiếu sáng
Tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn ex vitro thấp
Thực vật trong vi nhân giống truyền thống, do sống phụ thuộc nhiều vào nguồn
carbon hữu cơ (đường và vitamin trong môi trường) nên khi chuyển ra điều kiện ex
vitro, không còn được cung cấp nguồn carbon hữu cơ trong khi bộ máy quang hợp chưa
hoạt động bình thường, thường tăng trưởng chậm cho đến khi cây thích nghi với cácđiều kiện môi trường ở vườn ươm và khả năng quang hợp của cây trở lại bình thường
Do bộ máy quang hợp hoạt động kém nên cây in vitro không chịu được ánh sáng cao
cũng như ẩm độ thấp và cần chăm sóc đặc biệt để hạn chế sự mất nước của cây(Hazarika, 2006)
Do khí khổng của cây trong vi nhân giống truyền thống lúc nào cũng mở trong
suốt giai đoạn nuôi cấy in vitro trong hộp nuôi cấy kín với ẩm độ cao, nên khi cây được đưa ra điều kiện ex vitro với độ ẩm thấp, khí khổng chưa hoạt động lại bình thường, vẫn tiếp tục mở nên cây in vitro nuôi cấy truyền thống bị mất nước nhanh chóng dẫn đến tỷ
lệ sống không cao như mong muốn của các nhà vi nhân giống (Hazarika, 2006)
Giá thành cây cấy mô cao
Một hệ quả của vấn đề tạp nhiễm là không thể sử dụng được các hệ thống nuôicây có kích thước lớn trong vi nhân giống truyền thống vì tính rủi ro cao Các hộp nuôicây trong vi nhân giống truyền thống thường nhỏ và kín để hạn chế sự xâm nhập của visinh vật Điều này khiến cho các thao tác nuôi cấy và vệ sinh dụng cụ trở nên khó khăn,hao tốn nhân công, và chi phí cao để đầu tư cho một số lượng lớn hộp nuôi cây trong sảnxuất (Kubota, 2002)
Trang 31Để đạt được tỷ lệ sống cây in vitro cao khi đưa ra vườn ươm, quy trình sản xuất phải có một giai đoạn thuần hóa giúp cây con in vitro thích nghi với điều kiện ex vitro, dẫn đến việc tăng giá thành cây in vitro Bên cạnh đó, các CĐHSTTV cũng được sử dụng thường xuyên theo từng giai đoạn phát sinh hình thái để tạo cây in vitro hoàn
chỉnh khi sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống đã làm tăng chi phí sản xuất(Hazarika, 2006)
1.3.3 Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation)
1.3.3.1 Sơ lược về phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng
Sau nhiều nghiên cứu trong suốt thập niên 80 về các đặc tính sinh lý và sinh
trưởng của cây nuôi cấy in vitro, Kozai và các cộng sự của trường đại học Chiba, Nhật
Bản, đã đặt nền móng cho một phương pháp vi nhân giống hoàn toàn mới, phương pháp
vi nhân giống không đường hay còn gọi là vi nhân giống quang tự dưỡng(photoautotrophic micropropagation) Theo định nghĩa hẹp, quang tự dưỡng là hìnhthức dinh dưỡng của thực vật sống không dựa vào nguồn dinh dưỡng có carbon hữu cơ(Kozai và Kubota, 2005a) Khác với phương pháp vi nhân giống truyền thống hay
quang dị dưỡng, thực vật nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng chỉ được cung cấp môi
trường dinh dưỡng khoáng và sử dụng nguồn carbon vô cơ từ CO2 của không khí để tạovật chất hữu cơ cho cơ thể thực vật Theo Zobayed (2006), thuật ngữ “tự dưỡng” đượcđịnh nghĩa là quá trình mà các cơ quan có chứa diệp lục tố chuyển đổi năng lượng ánhsáng thành năng lượng sử dụng được về mặt sinh học và tổng hợp các hợp chất chuyểnhóa bằng cách sử dụng CO2 của không khí làm nguồn carbon duy nhất
Năm 1987, Fujiwara và cs đã mô tả rằng có một sự thay đổi nồng độ CO2 diễn ratrong suốt 24 giờ trong các hộp nuôi cây theo phương pháp truyền thống chứa các cây
in vitro có diệp lục tố Sự thay đổi này được mô tả bằng sự gia tăng nhanh chóng nồng
độ CO2 trong hộp suốt giai đoạn tối do thực vật hô hấp tạo ra Tuy nhiên, lượng CO2này giảm một cách nhanh chóng chỉ sau 2 giờ chiếu sáng đến nồng độ CO2 thấp nhấttrong suốt thời gian chiếu sáng còn lại trong ngày Sự giảm nồng độ CO2 cho thấy
Trang 32những cây in vitro trong nuôi cấy truyền thống vẫn có khả năng quang hợp cao, nhưng
nồng độ CO2 thấp trong hộp nuôi cây đã giới hạn khả năng quang hợp của cây, cây in
vitro vì thế phải chuyển sang hình thức dinh dưỡng kiểu quang dị dưỡng (sử dụng
đường là nguồn năng lượng và carbon chính) Bên cạnh đó, Kurata và Kozai (1992)cũng đã chứng minh rằng nồng độ CO2 trong các hộp chứa cây có diệp lục tố giảm mộtkhoảng từ 3000 đến 9000 µmol mol-1 trong giai đoạn tối xuống thấp hơn 100 µmolmol-1 trong giai đoạn sáng trong điều kiện vi nhân giống quang dị dưỡng truyền thống.Các kết quả này khẳng định rằng cây nuôi cấy mô hoàn toàn có thể tự dưỡng được, nếu
có thể làm tăng nồng độ CO2 trong hộp nuôi cây
Vi nhân giống quang tự dưỡng được chia thành hai phương pháp chính: trao đổikhí tự nhiên (gắn màng lọc vô trùng trao đổi khí trên nắp hoặc thành của hộp nuôi cây)
và bơm khí trực tiếp (dòng khí được đưa trực tiếp vào hộp nuôi cây qua máy bơm, do
đó, hộp nuôi cây thường có dung tích lớn)
Phương pháp trao đổi khí tự nhiên
Trao đổi khí tự nhiên là một tiến trình tiết kiệm năng lượng bằng việc mang khôngkhí sạch từ bên ngoài vào bên trong hộp nuôi cây và rút ra một lượng không khí tươngđương (Zobayed, 2005) Phương pháp trao đổi khí tự nhiên là phương pháp nhằm làmtăng khả năng lưu thông tự nhiên của không khí bên trong ra bên ngoài hộp nuôi cây vàngược lại Ngoại trừ các loại hộp đặc biệt được thiết kế để ngăn chặn hoàn toàn sự lưuthông khí, hầu hết các loại hộp nuôi cây thông thường đều cho phép khí lưu thông ravào ít nhiều Dòng lưu thông này được tạo ra do sự chênh lệch về áp suất khí giữa bêntrong và bên ngoài hộp, bắt nguồn từ sự chênh lệch về nhiệt độ của không khí trong vàngoài, hoặc từ dòng không khí lưu thông bên ngoài hộp Do đó, hình dạng hộp nuôi cây,
vị trí của nắp và các lỗ thông hơi, dòng khí và môi trường xung quanh hộp sẽ ảnhhưởng đến số lần trao đổi khí của các hộp trao đổi khí tự nhiên (Kozai và Kubota,
2001) Việc gia tăng sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngoài có thể được thực hiệnthông qua việc gia tăng sự lưu thông không khí bên ngoài hộp nuôi cây (như dùng quạt
Trang 33để tạo gió), hay dùng các loại hộp có độ trao đổi khí lớn hơn Một số nghiên cứu đã thử nghiệm với các hộp có nắp đậy lỏng lẻo, tuy nhiên cách này làm tăng nguy cơ nhiễm nấm, khuẩn Một phương pháp thông dụng hiện nay là dùng các loại hộp có các lỗ thôngkhí, được gắn những màng lọc vô trùng có khả năng ngăn cản các vi sinh vật nhưng vẫn cho không khí lưu thông qua lại (Hình 1.4) Hiện nay đã có nhiều loại màng được thương mại hóa trên thị trường: màng MilliSeal (Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản), MilliWrap (Millipore Corporation, Mỹ), đĩa polypropylene trong suốt (Bridgewater, Anh), màng Teflon (Flora Laboratories, Úc), v.v., và có cả các loại hộp có nắp hộp gắn sẵn màng lọc (Zobayed, 2005) Khả năng luân chuyển của không khí ra vào hộp tùy thuộc vào từng loại màng có cấu tạo khác nhau, số lỗ thông khí và hình dạng của hộp
Để biết được khả năng trao đổi khí của hộp nuôi cây, người ta thường sử dụng phương pháp đo số lần trao đổi khí/giờ (Kozai và cs, 1986)
Hình 1.4 Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí
Ghi chú: A: Các loại nắp hộp khác nhau giúp tăng cường sự trao đổi khí theo Kozai và Kubota (2005a).
B: Các loại hộp nuôi có màng thông khí phổ biến tại Việt Nam.
Phương pháp trao đổi khí tự nhiên có lợi điểm là đơn giản, dễ thực hiện và khôngtốn năng lượng Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có một số nhược điểm: (1) tốc độ traođổi khí thấp, đặc biệt là ở các hộp nuôi cây có thể tích lớn, (2) tốc độ trao đổi khí cốđịnh, khó hoặc không thể thay đổi được theo ý muốn, do đó khi cây lớn, cần nhiều
Trang 34CO2 hơn thì lượng CO2 trong hộp mang lại do quá trình trao đổi khí không đủ để cung cấp cho quá trình quang hợp.
Thêm vào đó, do giá thành hộp nuôi cây có màng millipore rất cao dẫn đến việchạn chế trong việc áp dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng ở Việt Nam Chính
vì thế, một số màng thông khí khác đã được sử dụng Tại Viện Sinh học Nhiệt đới,Nguyễn Thị Quỳnh đã sử dụng giấy mỏng để thay thế cho nút cao su dùng để đậy hộptam giác hoặc các chai thủy tinh có màng thông khí trên nắp để nuôi cấy quang tựdưỡng nhiều loại thực vật như cây paulownia, cây lõi thọ, cây hoa đồng tiền, cây dâutây, v.v Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2010a) đã nghiên cứu sử dụng các bao nylon có gắngiấy lọc ở thành bao với giá thành thấp để thay thế cho màng millipore đem đến khảnăng ứng dụng cao cho vi nhân giống quang tự dưỡng tại Việt Nam (Hình 1.4)
Phương pháp bơm khí trực tiếp
Khác với phương pháp trao đổi khí tự nhiên tiết kiệm năng lượng nhờ vào sựchênh lệch nhiệt độ và áp suất, phương pháp bơm khí trực tiếp sử dụng các hệ thống cơkhí (bơm, khí nén, v.v.) để tạo áp suất đưa không khí từ bên ngoài vào bên trong hộpnuôi cây Hệ thống bơm khí trực tiếp đơn giản bao gồm hộp nuôi cây có một đầu gắnvới đường ống dẫn khí vào thông qua màng lọc vô trùng, đầu đối diện của hộp là đườngdẫn khí trong hộp thoát ra Khí đưa vào có thể được lấy từ không khí, hoặc có thể từkhông khí được pha trộn thêm khí CO2 ở nồng độ cao để có được nồng độ khí CO2mong muốn Đây được xem là một trong những phương pháp trao đổi khí hiệu quả nhất(Zobayed, 2005), không chỉ cho phép đạt được tốc độ trao đổi khí cao mà trao đổi khí
tự nhiên không thể làm được, mà còn cho phép điều khiển chính xác độ ẩm, nồng độ
CO2, nồng độ ethylene hay bất kỳ loại khí nào khác trong quá trình nuôi cấy Hệ thốngbơm khí trực tiếp cũng cho phép thiết kế các hộp nuôi cấy lớn mà phương pháp thôngkhí tự nhiên không thể áp dụng, làm tăng hiệu quả, tính kinh tế, và mở ra khả năng cơkhí hóa, tự động hóa trong vi nhân giống
Trang 35Phương pháp bơm khí trực tiếp được nghiên cứu từ cuối thập niên 80 của thế kỷ
XX Năm 1988, Fujiwara và cs đã sử dụng hộp nuôi cây bằng acrylic với dung tích là
17,8 l để nhân giống quang tự dưỡng cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch.) (1348
cây/m2) Trong nghiên cứu này hệ thống nuôi cấy được bơm khí trực tiếp ở nồng độ CO2cao Từ đó đến nay hệ thống này vẫn được các nhà nuôi cấy mô tiếp tục nghiên cứu vàhoàn thiện Heo và Kozai (1999), đã thiết lập một hệ thống nhân giống bơm khí trực tiếpvới hộp có thể tích là 12 l Cây khoai lang được cấy vào vỉ nuôi cấy có nhiều ô, giá thể
là florialite, một hỗn hợp giữa vermiculite và cellulose Tốc độ phát triển của cây khoailang trong trường hợp này lớn gấp nhiều lần so với cây nuôi cấy trong hộp Magenta, môitrường có đường (30 g/l) và trao đổi khí tự nhiên Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2009,2010b) cũng đã thiết kế các hộp nuôi bơm khí trực tiếp có thể tích thay đổi từ
7 l, 17 l đến 60 l áp dụng trong nhân giống cây hông và cây lan Dendrobium.
1.3.3.2 Các giai đoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng
Như đã mô tả ở trên, các giai đoạn phát triển và hoạt động trong vi nhân giốngtruyền thống được chia làm 4 giai đoạn chính Theo Kozai và Kubota (2005a), các giaiđoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng ít hơn so với vi nhân giống truyền thống, vìcác giai đoạn nhân chồi và tạo rễ thường kết hợp vào một giai đoạn Trên lý thuyết thìchỉ giai đoạn ban đầu là cần điều kiện dị dưỡng hay quang dị dưỡng để tạo chồi sạchbệnh bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, phôi soma, v.v Khi mẫu cấy đã xuấthiện cơ quan có diệp lục tố (lá) thì có thể chuyển mẫu sang nuôi cấy quang tự dưỡng
Giai đoạn thuần hoá cây in vitro trước khi ra vườn ươm thường không cần thiết khi cây
tăng trưởng tốt trong điều kiện quang tự dưỡng (Hình 1.5)
Trang 36Hình 1.5 Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự
dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a)
1.3.3.3 Ưu và nhược điểm của phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng
Ưu điểm
Theo Kozai và Kubota (2005a), vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm
cả về mặt cải thiện sinh lý của cây con (khía cạnh sinh học) lẫn thực tiễn sản xuất (khíacạnh kỹ thuật)
Về khía cạnh sinh học:
- Kích thích sự tăng trưởng và quang hợp của cây in vitro: Cây con nhân giống in
vitro bằng quang tự dưỡng có hiệu suất quang hợp thuần cao hơn, do đó tốc độ
phát triển cũng lớn hơn so với trong vi nhân giống truyền thống Điều này đạtđược là do những điều kiện vi môi trường trong nuôi cấy quang tự dưỡng đãđược điều chỉnh để tối ưu hóa cho sự quang hợp của cây
- Tỷ lệ sống cao khi đưa ra điều kiện ex vitro: Cây nhân giống in vitro quang tự
dưỡng sống trong điều kiện môi trường khá giống với điều kiện tự nhiên bên
Trang 37ngoài Điều này cho phép thực vật phát triển bình thường về mặt sinh lý Khảnăng quang hợp tăng, khí khổng hoạt động bình thường giúp cho cây con thíchnghi dễ dàng với điều kiện sống tự nhiên, và có tỷ lệ sống cao hơn khi chuyển từ
in vitro ra ex vitro.
- Loại bỏ các bất thường về hình thái và sinh lý: Trong vi nhân giống quang tựdưỡng, độ ẩm và nồng độ khí ethylene được giảm thấp sẽ giúp tránh được cáchiện tượng bất thường trong hình thái và rối loạn về sinh lý, ví dụ như hiệntượng hóa thủy tinh thể
- Giảm tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn: Một lợi điểm lớn của việc loại bỏ đường và chấthữu cơ trong môi trường là hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật Thậm chínếu không phải là vi sinh vật gây bệnh cho cây, thì tạp nhiễm trong vi nhângiống quang tự dưỡng vẫn có thể được chấp nhận ở một mức độ nào đó Trong
vi nhân giống quang tự dưỡng, vì môi trường không chứa đường và các chất hữu
cơ nên tốc độ phát triển của vi sinh vật khá chậm, ít khi lấn át cây con và cũngkhông tạo ra các hợp chất gây độc cho cây
Về khía cạnh kỹ thuật:
- Dễ dàng thiết kế các dạng hộp nuôi cây lớn: Trong vi nhân giống quang tựdưỡng, việc lựa chọn kích thước và chất liệu của hộp nuôi cây khá dễ dàng,không bị giới hạn bởi vấn đề tạp nhiễm Việc khử trùng hộp nuôi cây cũng đơngiản và ít tốn kém hơn
- Có thể tự động hóa: Khi kích thước của hộp và hộp nuôi cây không bị giới hạn,việc tự động hóa có thể được đưa vào trong vi nhân giống quang tự dưỡng Cóthể thiết kế các hệ thống tự động nuôi cấy, chăm sóc và điều chỉnh điều kiện tối
ưu cho sinh trưởng của cây để sử dụng cho những hộp nuôi cây kích thước lớnvới số lượng hàng trăm cây
- Đơn giản hóa hệ thống vi nhân giống: Nhờ vào khả năng hạn chế tạp nhiễm củaphương pháp quang tự dưỡng, hệ thống vi nhân giống có thể được đơn giản hóa,
Trang 38đặc biệt là những hệ thống sử dụng hộp nuôi cây lớn Bên cạnh đó, các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống cũng có thể được rút ngắn lại.
vật lý in vitro Cần có một kiến thức đầy đủ về sinh lý của cây con, môi trường vật lý in vitro và ex vitro, các đặc tính vật lý và cấu trúc của hộp chứa để tối ưu
hóa hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng, sự phát triển của cây con trong khiphải tối thiểu chi phí cho nguyên liệu và năng lượng Tính phức tạp này đôi khigóp phần vào sự không thành công trong quá trình áp dụng vi nhân giống quang
- Khó áp dụng cho các hệ thống vi nhân giống sử dụng cụm chồi: Trong vi nhângiống truyền thống, người ta có thể dùng cách tạo cụm chồi để nhân số lượng cây con ở giai đoạn 2 (giai đoạn nhân giống) Sự hình thành cụm chồi chủ yếu
Trang 39được kích thích bởi các chất điều hòa sinh trưởng Cho đến nay phương phápquang tự dưỡng vẫn chưa tạo được các cụm chồi có số lượng chồi lớn nhưphương pháp truyền thống kể cả khi chỉ loại bỏ đường và vẫn sử dụng chất điềuhòa sinh trưởng Đây thường được xem là hạn chế khi ứng dụng quang tự dưỡngvào các quy trình nhân giống sử dụng cụm chồi Tuy nhiên, cụm chồi tạo ratrong phương pháp truyền thống thường có chất lượng kém (chồi có kích thướcquá nhỏ, mọng nước, v.v.), trong khi phương pháp quang tự dưỡng cho số lượngchồi thấp hơn, nhưng chất lượng tốt hơn (Kozai và Kubota, 2005a).
1.4. Những đặc điểm của một số yếu tố hóa học và vật lý in vitro và ảnh hưởng
của chúng đối với sinh trưởng của cây
1.4.1 Yếu tố hóa học
1.4.1.1 Đường
Trong nuôi cấy dị dưỡng hoặc quang dị dưỡng để tạo cơ quan như chồi hoặc rễ thì
sự hiện diện của đường trong môi trường nuôi cấy là bắt buộc Bởi vì lúc này mẫu thựcvật là những cơ quan rất nhỏ, đã được tách rời hoàn toàn khỏi mối tương quan với cơthể ban đầu và hoàn toàn không có khả năng tự dưỡng Thêm vào đó, sự tạo cơ quan làmột tiến trình phá huỷ năng lượng, vì vậy, các mô thực vật cần được bổ sungcarbohydrate Các dạng carbohydrate được dùng trong suốt quá trình tạo cơ quan cùngvới việc xử lý các CĐHSTTV là những yếu tố cần thiết cho sự thành công trong việctạo cơ quan Hầu hết các loại thực vật đều thích hợp với việc bổ sung từ 20-30 g/lđường sucrose vào môi trường (George, 1996)
Tuy nhiên, khi mẫu thực vật có chứa diệp lục tố và có khả năng quang hợp thì
nồng độ đường cao trong môi trường nuôi cấy lại ức chế sự quang hợp của cây in vitro
(Hdider và Desjardins, 1994)
1.4.1.2 Chất điều hòa sinh trưởng thực vật (CĐHSTTV)
Trong vi nhân giống truyền thống, các CĐHSTTV thường được bổ sung vào môitrường nuôi cấy nhằm làm tăng số chồi và sự tăng trưởng chồi, làm tăng sự tạo rễ Do
Trang 40đó, thành phần môi trường và thành phần các CĐHSTTV được xem là yếu tố quyếtđịnh đối với sự thành công của một quy trình nhân giống CĐHSTTV bao gồm kíchthích tố thực vật và các hợp chất hữu cơ do con người hoặc vi sinh vật tổng hợp có tácdụng điều hoà sự sinh trưởng ở thực vật Kích thích tố thực vật là những hợp chất hữu
cơ do thực vật sản xuất, di chuyển từ nơi tổng hợp đến nơi tác dụng, điều khiển sự sinhtrưởng hay một quá trình sinh lý của thực vật với một liều lượng rất nhỏ CácCĐHSTTV không phải là chất dinh dưỡng, các vitamin hay những nguyên tố thiết yếucho thực vật (Bùi Trang Việt, 2000) Hiện nay các CĐHSTTV được chia thành 5 nhómchính: auxin, cytokinin, gibberellin, acid abscisic và ethylene Trong kỹ thuật nuôi cấy
mô tế bào thì việc ứng dụng các CĐHSTTV là hết sức quan trọng Hai nhóm chất được
sử dụng nhiều nhất là auxin và cytokinin
Auxin
Auxin chủ yếu được tổng hợp trong ngọn thân, trong mô phân sinh (ngọn và lóng)
và lá non (tức các nơi có sự phân chia tế bào nhanh), từ tryptophan được tổng hợp trong
lá trưởng thành dưới ánh sáng Sau đó auxin di chuyển hữu cực trong mô libe tới rễ vàtích tụ trong rễ (Bùi Trang Việt, 2000)
Auxin có tác dụng kéo dài tế bào, kích thích sự phân chia tế bào tượng tầng vàhình thành rễ bất định, giúp sự phân hoá các mô dẫn (libe và mộc), cảm ứng sinh phôithể hệ trong nuôi cấy dịch treo Auxin (phối hợp với cytokinin) giúp sự tăng trưởng chồinon và khởi phát sự tạo mới mô phân sinh ngọn chồi từ nhu mô Tuy nhiên, ở nồng độcao, auxin cản sự phát triển của phát thể chồi vừa được thành lập hay của chồi nách(Bùi Trang Việt, 2000)
Việc xử lý bằng auxin ngoại sinh chỉ có tác dụng kích thích sinh trưởng của thựcvật khi nồng độ của auxin bằng nồng độ tối thích thường hiện diện trong bản thân cơthể thực vật Nồng độ auxin ngoại sinh cao trái lại ức chế sinh trưởng của thực vật vàtrong nhiều trường hợp có thể thành độc tố Điều này cũng có nghĩa là mỗi loại cơ