Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông nhựa pinus merkusii jungh et de vries trong điều kiện in vitro

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHẠM CHÍ NHÂN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA HỌC ĐẾN TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII JUNGH ET DE VRIES) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHẠM CHÍ NHÂN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA HỌC ĐẾN TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII JUNGH ET DE VRIES) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số : 604230 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS VƯƠNG ĐÌNH TUẤN Thành phố Hồ Chí Minh - 2012 LỜI CẢM ƠN Xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn đến: TS Vương Đình Tuấn, người Thầy trực tiếp tận tình hướng dẫn, bảo, động viên đóng góp ý kiến quý báu, sâu sắc Chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo, cô, chú, anh chị Viện nghiên cứu khoa học lâm nghiệp Nam bộ, phịng thí nghiệm Công nghệ sinh học quan tâm, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi thời gian thực đề tài tốt nghiệp phân viện Xin chân thành cảm ơn: Ban giám hiệu Trường Đại học Sư phạm Tp Hồ Chí Minh, Phịng Sau đại học , Ban chủ nhiệm khoa Sinh học Quý Thầy, Cô tham gia giảng dạy, truyền đạt kiến thức quý báu tạo điều kiện thuận lợi trình thực đề tài Cảm ơn anh chị, bạn học viên cao học khóa 19 ln đồng hành trình học tập chia sẻ nhiều tài liệu học tập có giá trị Cảm ơn gia đình người thân ln bên cạnh, động viên, giúp đỡ lúc khó khăn Tất nguồn động viên, tiếp thêm nghị lực để tơi hồn thành chương trình học thực luận văn tốt nghiệp Một lần nữa, xin chân thành cảm ơn./ Tp Hồ Chí Minh, năm 2012 Phạm Chí Nhân MỤC LỤC MỞ ĐẦU .1 Đặt vấn đề Mục tiêu nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Thời gian thực Chương TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu thông nhựa 1.1.1 Vị trí phân loại: 1.1.2 Phân bố: 1.1.3 Đặc điểm 1.1.4 Giá trị kinh tế thông nhựa 1.2 Phơi vơ tính .7 1.2.1 Giới thiệu phơi vơ tính 1.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến q trình tạo phơi vơ tính 13 1.3 Tình hình nghiên cứu tạo phơi vơ tính 23 1.3.1 Tạo phôi vơ tính rừng .24 1.3.2 Tạo phơi vơ tính chi Thông 26 Chương PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 29 2.1 Nội dung phương pháp nghiên cứu 29 2.1.1 Nội dung nghiên cứu 29 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 29 2.2 Vật liệu, dụng cụ hóa chất 29 2.2.1 Vật liệu 29 2.2.2 Dụng cụ thí nghiệm 29 2.2.3 Hóa chất 30 2.3 Phương pháp tiến hành 30 2.3.1 Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phôi 30 2.3.2 Nghiên cứu thành thục hóa khối tiền phơi tạo phôi soma 33 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 39 3.1 Thí nghiệm 1: Nghiên cứu hiệu L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi 39 3.2 Thí nghiệm 2: Nghiên cứu hiệu NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi 44 3.3 Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng adenine sulfate đến thành thục hóa tiền phơi 48 3.4 Thí nghiệm 4: nghiên cứu ảnh hưởng ABA đến thành thục hóa tiền phơi .51 3.5 Thí nghiệm 5: Ảnh hưởng số nồng độ loại đường đến thành thục hóa tiền phôi 54 3.6 Thí nghiệm 6: Ảnh hưởng phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa tiền phơi 57 3.7 Thí nghiệm 7: Ảnh hưởng số nồng độ than hoạt tính đến thành thục hóa tiền phơi 59 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 62 4.1 Kết luận 62 4.2 Một số kiến nghị .62 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ABA: Abscisis acid BA: 6- benzyl adenine BAP : 6-benzylaminopurine BM: basal medium 2,4- D: 2,4- diclorophenoxyacetic LM: Lindemann(1970) LVM: Litvay medium (1985) MS: Murashige Skoog (1962) NAA: Naphthalene acid acetic PEG: polyethylene glycol TDZ: Thidiazuron (N-phenyl-N,-1,2,3-thiadiazol-5-ylurea) cs: cộng DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu L- glutamine đến tăng sinh khối tế bào tiền phơi 31 Bảng 2.2 Bố trí thí nghiệm nghiên cứu hiệu NAA, BA đến tăng sinh khối tế bào tiền phôi 32 Bảng 2.3 Nồng độ Adenine sulfate thí nghiệm nghiên cứu ảnh hưởng adenin sulfate đến thành thục hóa tiền phơi 34 Bảng 2.4 Nồng độ ABA dùng nghiên cứu ảnh hưởng ABA đến thành thục hóa tiền phơi 35 Bảng 2.5 Loại đường nồng độ đường dùng nghiên cứu ảnh hưởng số nồng độ loại đường đến thành thục hóa tiền phơi 35 Bảng 2.6 Nồng độ đường loại đường nghiên cứu ảnh hưởng phối hợp PEG với đường đến thành thục hóa tiền phơi 36 Bảng 2.7 Lượng than hoạt tính sử dụng nghiên cứu ảnh hưởng số nồng độ than hoạt tính đến thành thục hóa tiền phơi 37 Bảng 3.1 Sinh khối tăng trung bình dịng khảo sát hiệu L- glutamine 38 Bảng 3.2 Sinh khối tăng trung bình dịng 31 khảo sát hiệu L- glutamine 38 Bảng 3.3 Sinh khối tăng trung bình dịng 44 khảo sát hiệu L- glutamine 39 Bảng 3.4 Sinh khối tăng trung bình dịng 54 khảo sát hiệu L- glutamine 39 Bảng 3.5 Sinh khối tăng trung bình dịng khảo sát hiệu L- glutamine 40 Bảng 3.6 Sinh khối tăng trung bình dịng 29 khảo sát hiệu L- glutamine Bảng 3.7 Sinh khối tăng trung bình dòng khảo sát hiệu 40 BA NAA 43 Bảng 3.8 Sinh khối tăng trung bình dịng 31 khảo sát hiệu BA NAA 43 Bảng 3.9 Sinh khối tăng trung bình dịng 44 khảo sát hiệu BA NAA 44 Bảng 3.10 Sinh khối tăng trung bình dịng 54 khảo sát hiệu BA NAA 44 Bảng 3.11 Sinh khối tăng trung bình dịng khảo sát hiệu BA NAA 45 Bảng 3.12 Sinh khối tăng trung bình dịng 29 khảo sát hiệu BA NAA 45 Bảng 3.13 Số lượng phôi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ adenine sulfate 47 Bảng 3.14 Số lượng phôi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ adenine sulfate 47 Bảng 3.15 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ adenine sulfate 47 Bảng 3.16 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ ABA 50 Bảng 3.17 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ ABA 51 Bảng 3.18 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng nồng độ ABA 51 Bảng 3.19 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng loại đường nồng độ đường 53 Bảng 3.20 Số lượng phơi soma trung bình dịng ảnh hưởng loại đường nồng độ đường 53 Bảng 3.21 Số lượng phơi soma trung bình dòng 29 ảnh hưởng loại đường nồng độ đường 54 Bảng 3.22 Số lượng phôi soma trung bình dịng ảnh hưởng loại đường PEG 56 Bảng 3.23 Số lượng phôi soma trung bình dịng ảnh hưởng loại đường PEG 56 Bảng 3.24 Số lượng phôi soma trung bình dịng 29 ảnh hưởng loại đường PEG 57 Bảng 3.25 Số lượng phôi soma trung bình dịng ảnh hưởng than hoạt tính 59 DANH MỤC CÁC HÌNH ẢNH Trang Hình 1.1 Sơ đồ phân bố thông nhựa Việt Nam Hình 1.2 Thơng nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) Hình 1.3 Cành mang thơng nhựa Hình 1.4 Quả thông non xẻ đôi phôi non tách từ non để nuôi cấy tạo phát sinh phôi 10 Hình 1.5 Tiền phơi thơng nhựa 11 Hình 1.6 Hạt nhân tạo hạt nhân tạo nảy mầm địa lan Cymbidium spp 12 Hình 3.1 Tế bào tiền phôi tuần sau cấy ( với nồng độ L – glutamine 0, 10, 300, 500 700 mg/l) 42 Hình 3.2 Phơi soma mơi trường có maltose 90 g/l sucrose 90 g/l 55 Hình 3.3 Thành thục tạo phơi soma mơi trường LVM bổ sung than hoạt tính 10 g/l * 1.374 000 -12.50 -6.16 * 1.374 000 7.50 13.84 * 1.374 002 2.83 9.17 * 1.374 042 -6.50 -.16 * 1.374 000 10.83 17.17 * 1.374 000 6.16 12.50 * 1.374 042 16 6.50 -9.333 10.667 6.000 -3.333 14.000 9.333 3.333 * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Số phôi soma Nghiệm thức N Subset for alpha = 0.05 a Duncan 3 3 Sig 2.67 7.33 13.33 16.67 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 1.000 1.000 1.000 Phụ lục 28 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng (Maltose) Descriptives Số phơi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 3.00 1.000 577 52 5.48 5.33 2.082 1.202 16 10.50 3 7.67 577 333 6.23 9.10 7.67 1.155 667 4.80 10.54 12 5.92 2.314 668 4.45 7.39 1.323 382 5.04 6.80 1.117 2.36 9.47 Total Fixed Effects Model Random Effects 4.407 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nghiệm thức (J) Nghiệm thức Mean Difference (I-J) Std Error Sig 95% Confidence Interval Lower Bound LSD Upper Bound -2.333 1.080 063 -4.82 16 -4.667 * 1.080 003 -7.16 -2.18 * 1.080 003 -7.16 -2.18 -4.667 2.333 1.080 063 -.16 4.82 -2.333 1.080 063 -4.82 16 -2.333 1.080 063 -4.82 16 4.667 * 1.080 003 2.18 7.16 2.333 1.080 063 -.16 4.82 000 1.080 1.000 -2.49 2.49 * 4.667 1.080 003 2.18 7.16 2.333 1.080 063 -.16 4.82 000 1.080 1.000 -2.49 2.49 * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Số phôi soma Nghiệm thức N Subset for alpha = 0.05 a Duncan 3.00 5.33 3 7.67 7.67 Sig .063 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 5.33 072 Phụ lục 29 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng (Sucrose) Descriptives Số phôi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 2.00 1.000 577 -.48 4.48 3 4.67 577 333 3.23 6.10 3 6.33 1.155 667 3.46 9.20 8.33 1.528 882 4.54 12.13 10 12 5.33 2.605 752 3.68 6.99 10 1.118 323 4.59 6.08 1.340 1.07 9.60 Total Fixed Effects Model Random Effects 6.769 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nghiệm thức (J) Nghiệm thức Mean Difference (I-J) Std Error Sig 95% Confidence Interval Lower Bound 2 * 913 019 -4.77 -.56 * 913 001 -6.44 -2.23 * 913 000 -8.44 -4.23 * 913 019 56 4.77 -2.667 -4.333 -6.333 LSD Upper Bound 2.667 -1.667 913 105 -3.77 44 -3.667 * 913 004 -5.77 -1.56 * 4.333 913 001 2.23 6.44 1.667 913 105 -.44 3.77 -2.000 913 060 -4.11 11 6.333 * 913 000 4.23 8.44 * 3.667 913 004 1.56 5.77 2.000 913 060 -.11 4.11 * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Số phôi soma Nghiệm thức N Subset for alpha = 0.05 a Duncan 3 4.67 3 6.33 Sig 2.00 8.33 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 6.33 105 060 Phụ lục 30 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng 29 (Maltose) Descriptives Số phôi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 2.67 577 333 1.23 4.10 3 6.00 2.000 1.155 1.03 10.97 3 6.33 1.155 667 3.46 9.20 6.67 1.528 882 2.87 10.46 12 5.42 2.065 596 4.10 6.73 1.414 408 4.48 6.36 927 2.47 8.37 Total Fixed Effects Model Random Effects 2.769 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nghiệm thức (J) Nghiệm thức Mean Difference (I-J) Std Error Sig 95% Confidence Interval Lower Bound LSD 1.155 020 -6.00 -.67 * 1.155 013 -6.33 -1.00 * 1.155 009 -6.66 -1.34 -3.333 -3.667 Upper Bound * -4.000 3.333 * 1.155 020 67 6.00 -.333 1.155 780 -3.00 2.33 -.667 1.155 580 -3.33 2.00 3.667 * 1.155 013 1.00 6.33 333 1.155 780 -2.33 3.00 -.333 1.155 780 -3.00 2.33 * 4.000 1.155 009 1.34 6.66 667 1.155 580 -2.00 3.33 333 1.155 780 -2.33 3.00 * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Số phôi soma Nghiệm thức N Subset for alpha = 0.05 a Duncan 3 6.00 3 6.33 6.67 Sig 2.67 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .595 Phụ lục 31 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng 29 (Sucrose) Descriptives Số phơi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Lower Bound Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 1.33 577 333 -.10 2.77 2 5.67 577 333 4.23 7.10 3 5.33 577 333 3.90 6.77 7.67 577 333 6.23 9.10 12 5.00 2.449 707 3.44 6.56 577 167 4.62 5.38 1.326 78 9.22 Total Fixed Effects Model Random Effects 6.926 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nghiệm thức (J) Nghiệm thức Mean Difference (I-J) Std Error Sig 95% Confidence Interval Lower Bound LSD Upper Bound * 471 000 -5.42 -3.25 * 471 000 -5.09 -2.91 * 471 000 -7.42 -5.25 -4.333 -4.000 -6.333 4.333 * 471 000 3.25 5.42 333 471 500 -.75 1.42 * 471 003 -3.09 -.91 4.000 * 471 000 2.91 5.09 -.333 471 500 -1.42 75 -2.333 * 471 001 -3.42 -1.25 * 471 000 5.25 7.42 * 471 003 91 3.09 * 471 001 1.25 3.42 -2.000 1 6.333 2.000 2.333 * The mean difference is significant at the 0.05 level Homogeneous Subsets Số phôi soma Nghiệm thức N Subset for alpha = 0.05 a Duncan 3 3 5.33 5.67 Sig 1.33 7.67 1.000 Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .500 1.000 Phụ lục 32 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng Descriptives Số phơi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 12.33 1.528 882 8.54 16.13 11 14 10 15.67 1.528 882 11.87 19.46 14 17 20 15.00 2.000 1.155 10.03 19.97 13 17 Total 14.33 2.121 707 12.70 15.96 11 17 1.700 567 12.95 15.72 1.018 9.95 18.71 Fixed Effects Model Random Effects 2.148 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nồng độ than hoạt tính (g/l) (J) Nồng độ than hoạt tính (g/l) Mean Difference Std Error Sig 95% Confidence Interval (I-J) Lower Bound Upper Bound 10 -3.333 1.388 053 -6.73 06 20 -2.667 1.388 103 -6.06 73 3.333 1.388 053 -.06 6.73 20 667 1.388 648 -2.73 4.06 2.667 1.388 103 -.73 6.06 10 -.667 1.388 648 -4.06 2.73 LSD 10 20 Homogeneous Subsets Số phôi soma Nồng độ than hoạt tính (g/l) N Subset for alpha = 0.05 a 12.33 20 15.00 10 15.67 Duncan Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .060 Phụ lục 33 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng Descriptives Số phơi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Lower Bound Minimum Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 6.67 577 333 5.23 8.10 10 8.00 1.000 577 5.52 10.48 20 6.33 1.528 882 2.54 10.13 Total 7.00 1.225 408 6.06 7.94 1.106 369 6.10 7.90 509 4.81 9.19 Fixed Effects Model Random Effects 370 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nồng độ than hoạt tính (g/l) (J) Nồng độ than hoạt tính (g/l) Mean Difference Std Error Sig 95% Confidence Interval (I-J) Lower Bound Upper Bound 10 -1.333 903 190 -3.54 88 20 333 903 725 -1.88 2.54 1.333 903 190 -.88 3.54 20 1.667 903 114 -.54 3.88 -.333 903 725 -2.54 1.88 10 -1.667 903 114 -3.88 54 LSD 10 20 Homogeneous Subsets Số phôi soma Nồng độ than hoạt tính (g/l) N Subset for alpha = 0.05 a 20 6.33 6.67 10 8.00 Duncan Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .125 Phụ lục 34 Thống kê kết thí nghiệm - Dịng 29 Descriptives Số phơi soma N Mean Std Deviation Std Error 95% Confidence Interval for Mean Minimum Lower Bound Maximum BetweenComponent Upper Bound Variance 5.33 577 333 3.90 6.77 10 6.00 2.000 1.155 1.03 10.97 20 6.00 1.732 1.000 1.70 10.30 Total 5.78 1.394 465 4.71 6.85 1.563 521 4.50 7.05 a a Fixed Effects Model Random Effects 521 3.54 a 8.02 a Warning: Between-component variance is negative It was replaced by 0.0 in computing this random effects measure -.667 Post Hoc Tests Multiple Comparisons Dependent Variable: Số phôi soma (I) Nồng độ than hoạt tính (g/l) (J) Nồng độ than hoạt tính (g/l) Mean Difference Std Error Sig 95% Confidence Interval (I-J) Lower Bound Upper Bound 10 -.667 1.277 620 -3.79 2.46 20 -.667 1.277 620 -3.79 2.46 667 1.277 620 -2.46 3.79 20 000 1.277 1.000 -3.12 3.12 667 1.277 620 -2.46 3.79 10 000 1.277 1.000 -3.12 3.12 LSD 10 20 Homogeneous Subsets Số phôi soma Nồng độ than hoạt tính (g/l) N Subset for alpha = 0.05 a 5.33 10 6.00 20 6.00 Duncan Sig Means for groups in homogeneous subsets are displayed a Uses Harmonic Mean Sample Size = 3.000 .631 ... ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM TP HỒ CHÍ MINH PHẠM CHÍ NHÂN NGHIÊN CỨU ẢNH HƯỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HÓA HỌC ĐẾN TẠO PHÔI SOMA THÔNG NHỰA (PINUS MERKUSII JUNGH ET DE VRIES) TRONG ĐIỀU KIỆN IN VITRO. .. cứu ảnh hưởng số yếu tố hóa học đến tạo phôi soma thông nhựa (Pinus merkusii jungh et de Vries) điều kiện in vitro? ?? thực nhằm mục đích xây dựng kỹ thuật nhân giống thơng nhựa thơng qua phơi soma. .. nghiên cứu Tìm số yếu tố hóa học có hiệu tốt tạo phơi vơ tính gia đình thơng nhựa điều kiện in vitro Nội dung nghiên cứu - Nghiên cứu tăng sinh khối tế bào tiền phơi - Nghiên cứu thành thục hóa