1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3.3. Vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation)
1.3.3.1. Sơ lược về phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng
Sau nhiều nghiên cứu trong suốt thập niên 80 về các đặc tính sinh lý và sinh trưởng của cây nuôi cấy in vitro, Kozai và các cộng sự của trường đại học Chiba, Nhật Bản, đã đặt nền móng cho một phương pháp vi nhân giống hoàn toàn mới, phương pháp vi nhân giống không đường hay còn gọi là vi nhân giống quang tự dưỡng (photoautotrophic micropropagation). Theo định nghĩa hẹp, quang tự dưỡng là hình thức dinh dưỡng của thực vật sống không dựa vào nguồn dinh dưỡng có carbon hữu cơ (Kozai và Kubota, 2005a). Khác với phương pháp vi nhân giống truyền thống hay quang dị dưỡng, thực vật nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng chỉ được cung cấp môi trường dinh dưỡng khoáng và sử dụng nguồn carbon vô cơ từ CO2 của không khí để tạo vật chất hữu cơ cho cơ thể thực vật. Theo Zobayed (2006), thuật ngữ “tự dưỡng” được định nghĩa là quá trình mà các cơ quan có chứa diệp lục tố chuyển đổi năng lượng ánh sáng thành năng lượng sử dụng được về mặt sinh học và tổng hợp các hợp chất chuyển hóa bằng cách sử dụng CO2 của không khí làm nguồn carbon duy nhất.
Năm 1987, Fujiwara và cs đã mô tả rằng có một sự thay đổi nồng độ CO2 diễn ra trong suốt 24 giờ trong các hộp nuôi cây theo phương pháp truyền thống chứa các cây
in vitro có diệp lục tố. Sự thay đổi này được mô tả bằng sự gia tăng nhanh chóng nồng
độ CO2 trong hộp suốt giai đoạn tối do thực vật hô hấp tạo ra. Tuy nhiên, lượng CO2
này giảm một cách nhanh chóng chỉ sau 2 giờ chiếu sáng đến nồng độ CO2 thấp nhất trong suốt thời gian chiếu sáng còn lại trong ngày. Sự giảm nồng độ CO2 cho thấy
những cây in vitro trong nuôi cấy truyền thống vẫn có khả năng quang hợp cao, nhưng nồng độ CO2 thấp trong hộp nuôi cây đã giới hạn khả năng quang hợp của cây, cây in
vitro vì thế phải chuyển sang hình thức dinh dưỡng kiểu quang dị dưỡng (sử dụng
đường là nguồn năng lượng và carbon chính). Bên cạnh đó, Kurata và Kozai (1992) cũng đã chứng minh rằng nồng độ CO2 trong các hộp chứa cây có diệp lục tố giảm một khoảng từ 3000 đến 9000 µmol mol-1 trong giai đoạn tối xuống thấp hơn 100 µmol mol-1 trong giai đoạn sáng trong điều kiện vi nhân giống quang dị dưỡng truyền thống. Các kết quả này khẳng định rằng cây nuôi cấy mô hoàn toàn có thể tự dưỡng được, nếu có thể làm tăng nồng độ CO2 trong hộp nuôi cây.
Vi nhân giống quang tự dưỡng được chia thành hai phương pháp chính: trao đổi khí tự nhiên (gắn màng lọc vô trùng trao đổi khí trên nắp hoặc thành của hộp nuôi cây) và bơm khí trực tiếp (dòng khí được đưa trực tiếp vào hộp nuôi cây qua máy bơm, do đó, hộp nuôi cây thường có dung tích lớn).
Phương pháp trao đổi khí tự nhiên
Trao đổi khí tự nhiên là một tiến trình tiết kiệm năng lượng bằng việc mang không khí sạch từ bên ngoài vào bên trong hộp nuôi cây và rút ra một lượng không khí tương đương (Zobayed, 2005). Phương pháp trao đổi khí tự nhiên là phương pháp nhằm làm tăng khả năng lưu thông tự nhiên của không khí bên trong ra bên ngoài hộp nuôi cây và ngược lại. Ngoại trừ các loại hộp đặc biệt được thiết kế để ngăn chặn hoàn toàn sự lưu thông khí, hầu hết các loại hộp nuôi cây thông thường đều cho phép khí lưu thông ra vào ít nhiều. Dòng lưu thông này được tạo ra do sự chênh lệch về áp suất khí giữa bên trong và bên ngoài hộp, bắt nguồn từ sự chênh lệch về nhiệt độ của không khí trong và ngoài, hoặc từ dòng không khí lưu thông bên ngoài hộp. Do đó, hình dạng hộp nuôi cây, vị trí của nắp và các lỗ thông hơi, dòng khí và môi trường xung quanh hộp sẽ ảnh hưởng đến số lần trao đổi khí của các hộp trao đổi khí tự nhiên (Kozai và Kubota, 2001). Việc gia tăng sự trao đổi khí giữa bên trong và bên ngoài có thể được thực hiện thông qua việc gia tăng sự lưu thông không khí bên ngoài hộp nuôi cây (như dùng quạt
để tạo gió), hay dùng các loại hộp có độ trao đổi khí lớn hơn. Một số nghiên cứu đã thử nghiệm với các hộp có nắp đậy lỏng lẻo, tuy nhiên cách này làm tăng nguy cơ nhiễm nấm, khuẩn. Một phương pháp thông dụng hiện nay là dùng các loại hộp có các lỗ thông khí, được gắn những màng lọc vô trùng có khả năng ngăn cản các vi sinh vật nhưng vẫn cho không khí lưu thông qua lại (Hình 1.4). Hiện nay đã có nhiều loại màng được thương mại hóa trên thị trường: màng MilliSeal (Nihon Millipore Ltd., Nhật Bản), MilliWrap (Millipore Corporation, Mỹ), đĩa polypropylene trong suốt (Bridgewater, Anh), màng Teflon (Flora Laboratories, Úc), v.v., và có cả các loại hộp có nắp hộp gắn sẵn màng lọc (Zobayed, 2005). Khả năng luân chuyển của không khí ra vào hộp tùy thuộc vào từng loại màng có cấu tạo khác nhau, số lỗ thông khí và hình dạng của hộp. Để biết được khả năng trao đổi khí của hộp nuôi cây, người ta thường sử dụng phương pháp đo số lần trao đổi khí/giờ (Kozai và cs, 1986).
Hình 1.4. Các loại nắp hộp nuôi cây làm tăng khả năng trao đổi khí
Ghi chú: A: Các loại nắp hộp khác nhau giúp tăng cường sự trao đổi khí theo Kozai và Kubota (2005a). B: Các loại hộp nuôi có màng thông khí phổ biến tại Việt Nam.
Phương pháp trao đổi khí tự nhiên có lợi điểm là đơn giản, dễ thực hiện và không tốn năng lượng. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn có một số nhược điểm: (1) tốc độ trao đổi khí thấp, đặc biệt là ở các hộp nuôi cây có thể tích lớn, (2) tốc độ trao đổi khí cố định, khó hoặc không thể thay đổi được theo ý muốn, do đó khi cây lớn, cần nhiều
CO2 hơn thì lượng CO2 trong hộp mang lại do quá trình trao đổi khí không đủ để cung cấp cho quá trình quang hợp.
Thêm vào đó, do giá thành hộp nuôi cây có màng millipore rất cao dẫn đến việc hạn chế trong việc áp dụng phương pháp nuôi cấy quang tự dưỡng ở Việt Nam. Chính vì thế, một số màng thông khí khác đã được sử dụng. Tại Viện Sinh học Nhiệt đới, Nguyễn Thị Quỳnh đã sử dụng giấy mỏng để thay thế cho nút cao su dùng để đậy hộp tam giác hoặc các chai thủy tinh có màng thông khí trên nắp để nuôi cấy quang tự dưỡng nhiều loại thực vật như cây paulownia, cây lõi thọ, cây hoa đồng tiền, cây dâu tây, v.v. Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2010a) đã nghiên cứu sử dụng các bao nylon có gắn giấy lọc ở thành bao với giá thành thấp để thay thế cho màng millipore đem đến khả năng ứng dụng cao cho vi nhân giống quang tự dưỡng tại Việt Nam (Hình 1.4).
Phương pháp bơm khí trực tiếp
Khác với phương pháp trao đổi khí tự nhiên tiết kiệm năng lượng nhờ vào sự chênh lệch nhiệt độ và áp suất, phương pháp bơm khí trực tiếp sử dụng các hệ thống cơ khí (bơm, khí nén, v.v.) để tạo áp suất đưa không khí từ bên ngoài vào bên trong hộp nuôi cây. Hệ thống bơm khí trực tiếp đơn giản bao gồm hộp nuôi cây có một đầu gắn với đường ống dẫn khí vào thông qua màng lọc vô trùng, đầu đối diện của hộp là đường dẫn khí trong hộp thoát ra. Khí đưa vào có thể được lấy từ không khí, hoặc có thể từ không khí được pha trộn thêm khí CO2 ở nồng độ cao để có được nồng độ khí CO2
mong muốn. Đây được xem là một trong những phương pháp trao đổi khí hiệu quả nhất (Zobayed, 2005), không chỉ cho phép đạt được tốc độ trao đổi khí cao mà trao đổi khí tự nhiên không thể làm được, mà còn cho phép điều khiển chính xác độ ẩm, nồng độ CO2, nồng độ ethylene hay bất kỳ loại khí nào khác trong quá trình nuôi cấy. Hệ thống bơm khí trực tiếp cũng cho phép thiết kế các hộp nuôi cấy lớn mà phương pháp thông khí tự nhiên không thể áp dụng, làm tăng hiệu quả, tính kinh tế, và mở ra khả năng cơ khí hóa, tự động hóa trong vi nhân giống.
Phương pháp bơm khí trực tiếp được nghiên cứu từ cuối thập niên 80 của thế kỷ XX. Năm 1988, Fujiwara và cs đã sử dụng hộp nuôi cây bằng acrylic với dung tích là 17,8 l để nhân giống quang tự dưỡng cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch.) (1348 cây/m2). Trong nghiên cứu này hệ thống nuôi cấy được bơm khí trực tiếp ở nồng độ CO2
cao. Từ đó đến nay hệ thống này vẫn được các nhà nuôi cấy mô tiếp tục nghiên cứu và hoàn thiện. Heo và Kozai (1999), đã thiết lập một hệ thống nhân giống bơm khí trực tiếp với hộp có thể tích là 12 l. Cây khoai lang được cấy vào vỉ nuôi cấy có nhiều ô, giá thể là florialite, một hỗn hợp giữa vermiculite và cellulose. Tốc độ phát triển của cây khoai lang trong trường hợp này lớn gấp nhiều lần so với cây nuôi cấy trong hộp Magenta, môi trường có đường (30 g/l) và trao đổi khí tự nhiên. Nguyễn Thị Quỳnh và cs (2009, 2010b) cũng đã thiết kế các hộp nuôi bơm khí trực tiếp có thể tích thay đổi từ
7 l, 17 l đến 60 l áp dụng trong nhân giống cây hông và cây lan Dendrobium.
1.3.3.2. Các giai đoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng
Như đã mô tả ở trên, các giai đoạn phát triển và hoạt động trong vi nhân giống truyền thống được chia làm 4 giai đoạn chính. Theo Kozai và Kubota (2005a), các giai đoạn trong vi nhân giống quang tự dưỡng ít hơn so với vi nhân giống truyền thống, vì các giai đoạn nhân chồi và tạo rễ thường kết hợp vào một giai đoạn. Trên lý thuyết thì chỉ giai đoạn ban đầu là cần điều kiện dị dưỡng hay quang dị dưỡng để tạo chồi sạch bệnh bằng nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, chồi ngọn, phôi soma, v.v. Khi mẫu cấy đã xuất hiện cơ quan có diệp lục tố (lá) thì có thể chuyển mẫu sang nuôi cấy quang tự dưỡng. Giai đoạn thuần hoá cây in vitro trước khi ra vườn ươm thường không cần thiết khi cây tăng trưởng tốt trong điều kiện quang tự dưỡng (Hình 1.5).
Hình 1.5. Các giai đoạn nuôi cấy trong vi nhân giống quang dị dưỡng và quang tự dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a).
1.3.3.3. Ưu và nhược điểm của phương pháp vi nhân giống quang tự dưỡng
Ưu điểm
Theo Kozai và Kubota (2005a), vi nhân giống quang tự dưỡng có nhiều ưu điểm cả về mặt cải thiện sinh lý của cây con (khía cạnh sinh học) lẫn thực tiễn sản xuất (khía cạnh kỹ thuật).
Về khía cạnh sinh học:
- Kích thích sự tăng trưởng và quang hợp của cây in vitro: Cây con nhân giống in
vitro bằng quang tự dưỡng có hiệu suất quang hợp thuần cao hơn, do đó tốc độ
phát triển cũng lớn hơn so với trong vi nhân giống truyền thống. Điều này đạt được là do những điều kiện vi môi trường trong nuôi cấy quang tự dưỡng đã được điều chỉnh để tối ưu hóa cho sự quang hợp của cây.
- Tỷ lệ sống cao khi đưa ra điều kiện ex vitro: Cây nhân giống in vitro quang tự dưỡng sống trong điều kiện môi trường khá giống với điều kiện tự nhiên bên
ngoài. Điều này cho phép thực vật phát triển bình thường về mặt sinh lý. Khả năng quang hợp tăng, khí khổng hoạt động bình thường giúp cho cây con thích nghi dễ dàng với điều kiện sống tự nhiên, và có tỷ lệ sống cao hơn khi chuyển từ
in vitro ra ex vitro.
- Loại bỏ các bất thường về hình thái và sinh lý: Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, độ ẩm và nồng độ khí ethylene được giảm thấp sẽ giúp tránh được các hiện tượng bất thường trong hình thái và rối loạn về sinh lý, ví dụ như hiện tượng hóa thủy tinh thể.
- Giảm tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn: Một lợi điểm lớn của việc loại bỏ đường và chất hữu cơ trong môi trường là hạn chế được sự phát triển của vi sinh vật. Thậm chí nếu không phải là vi sinh vật gây bệnh cho cây, thì tạp nhiễm trong vi nhân giống quang tự dưỡng vẫn có thể được chấp nhận ở một mức độ nào đó. Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, vì môi trường không chứa đường và các chất hữu cơ nên tốc độ phát triển của vi sinh vật khá chậm, ít khi lấn át cây con và cũng không tạo ra các hợp chất gây độc cho cây.
Về khía cạnh kỹ thuật:
- Dễ dàng thiết kế các dạng hộp nuôi cây lớn: Trong vi nhân giống quang tự dưỡng, việc lựa chọn kích thước và chất liệu của hộp nuôi cây khá dễ dàng, không bị giới hạn bởi vấn đề tạp nhiễm. Việc khử trùng hộp nuôi cây cũng đơn giản và ít tốn kém hơn.
- Có thể tự động hóa: Khi kích thước của hộp và hộp nuôi cây không bị giới hạn, việc tự động hóa có thể được đưa vào trong vi nhân giống quang tự dưỡng. Có thể thiết kế các hệ thống tự động nuôi cấy, chăm sóc và điều chỉnh điều kiện tối ưu cho sinh trưởng của cây để sử dụng cho những hộp nuôi cây kích thước lớn với số lượng hàng trăm cây.
- Đơn giản hóa hệ thống vi nhân giống: Nhờ vào khả năng hạn chế tạp nhiễm của phương pháp quang tự dưỡng, hệ thống vi nhân giống có thể được đơn giản hóa,
đặc biệt là những hệ thống sử dụng hộp nuôi cây lớn. Bên cạnh đó, các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống cũng có thể được rút ngắn lại.
Nhược điểm
Một số yếu tố sau đây có thể được xem là nhược điểm của vi nhân giống quang tự dưỡng (Kozai và Kubota, 2005a):
- Yêu cầu kỹ thuật cao và kiến thức khá phức tạp để điều chỉnh môi trường vi nhân giống: mặc dù đã được nghiên cứu và thử nghiệm thành công trên nhiều loại cây, nhưng ứng dụng của phương pháp quang tự dưỡng vẫn còn khá hạn chế. Một trong những nguyên nhân chính là tính phức tạp trong việc kiểm soát môi trường vật lý in vitro. Cần có một kiến thức đầy đủ về sinh lý của cây con, môi trường vật lý in vitro và ex vitro, các đặc tính vật lý và cấu trúc của hộp chứa để tối ưu hóa hệ thống vi nhân giống quang tự dưỡng, sự phát triển của cây con trong khi phải tối thiểu chi phí cho nguyên liệu và năng lượng. Tính phức tạp này đôi khi góp phần vào sự không thành công trong quá trình áp dụng vi nhân giống quang tự dưỡng.
- Chi phí cho chiếu sáng, tăng cường CO2 và làm lạnh: Phương pháp quang tự dưỡng thường yêu cầu chiếu sáng mạnh và nồng độ CO2 cao cho sự phát triển tối ưu của cây, kéo theo đó là tăng cường làm lạnh để duy trì nhiệt độ thích hợp. Các yếu tố này có thể làm tiêu tốn chi phí lớn cho năng lượng để thắp sáng, làm lạnh và cho hệ thống cung cấp không khí và CO2. Tuy nhiên chi phí này có thể được giảm bớt phần nào bởi nhiều cách khác nhau, như sử dụng các tấm phản chiếu để tăng cường hiệu suất thu nhận ánh sáng của cây, sử dụng các máy lạnh có chỉ số tiêu thụ điện năng thấp, phòng nuôi cây thật kín để tránh sự trao đổi CO2 và nhiệt với môi trường bên ngoài phòng nuôi cây.
- Khó áp dụng cho các hệ thống vi nhân giống sử dụng cụm chồi: Trong vi nhân giống truyền thống, người ta có thể dùng cách tạo cụm chồi để nhân số lượng cây con ở giai đoạn 2 (giai đoạn nhân giống). Sự hình thành cụm chồi chủ yếu
được kích thích bởi các chất điều hòa sinh trưởng. Cho đến nay phương pháp quang tự dưỡng vẫn chưa tạo được các cụm chồi có số lượng chồi lớn như phương pháp truyền thống kể cả khi chỉ loại bỏ đường và vẫn sử dụng chất điều hòa sinh trưởng. Đây thường được xem là hạn chế khi ứng dụng quang tự dưỡng vào các quy trình nhân giống sử dụng cụm chồi. Tuy nhiên, cụm chồi tạo ra trong phương pháp truyền thống thường có chất lượng kém (chồi có kích thước quá nhỏ, mọng nước, v.v.), trong khi phương pháp quang tự dưỡng cho số lượng