1. CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.3.2. Vi nhân giống truyền thống (conventional micropropagation)
1.3.2.1. Sơ lược về phương pháp vi nhân giống truyền thống
Vi nhân giống truyền thống là hình thức nhân giống in vitro mà môi trường nuôi cấy có sự hiện diện của đường, vitamin hoặc một số chất hữu cơ như CĐHSTTV, dịch chiết nấm men. Theo định nghĩa của Kozai và Kubota (2005a), nuôi cấy in vitro thông thường hay còn gọi là nuôi cấy truyền thống bao gồm nuôi cấy dị dưỡng (heterotrophy) và nuôi cấy quang dị dưỡng. Trong đó, dị dưỡng là hình thức nuôi cấy mà nguồn carbon hữu cơ trong môi trường dinh dưỡng là nguồn năng lượng duy nhất. Ở hình thức này, mẫu cây hoặc mô thực vật hoàn toàn không có chức năng quang hợp, không có các cơ quan chuyên biệt (lục lạp) để thực hiện quang hợp, và sống hoàn toàn dựa vào nguồn carbon hữu cơ từ các hợp chất hữu cơ trong môi trường nuôi cấy. Đây là trường hợp nuôi cấy các mô sẹo đặt trong tối. Còn quang dị dưỡng (photomixotrophy) là hình thức nuôi cấy mà mẫu cây hoặc mô thực vật sử dụng cả hai nguồn là carbon vô cơ từ CO2
trong không khí và nguồn carbon hữu cơ có được từ các chất hữu cơ trong môi trường làm nguồn năng lượng. Tất cả các dạng tế bào, mô, cơ quan hay cây con đã hình thành lục lạp được nuôi cấy trên môi trường có đường đặt dưới một điều kiện ánh sáng nào đó đều thuộc hình thức nuôi cấy này.
Đặc điểm chung của vi nhân giống truyền thống (vi nhân giống quang dị dưỡng) là nuôi cấy kín (nhằm ngăn cản sự xâm nhập của vi sinh vật), sử dụng đường và một số hợp chất có chứa carbon hữu cơ khác (vitamin, CĐHSTTV, nước dừa, v.v.) như một thành phần thiết yếu trong môi trường dinh dưỡng, trong đó đường được xem như
nguồn cung cấp năng lượng duy nhất hoặc chủ yếu cho cây. Hình thức này gây ra không ít ảnh hưởng không tốt đến sự sinh trưởng, hình thái và đặc biệt là tỷ lệ sống của
cây in vitro khi đem ra điều kiện ex vitro. Do đó để tăng tỷ lệ sống sót của cây in vitro,
người ta bắt buộc phải thực hiện nhân giống in vitro qua nhiều giai đoạn khác nhau để tạo được cây con có khả năng sống cao và từng bước thích nghi với điều kiện khắc nghiệt bên ngoài.
1.3.2.2. Các giai đoạn trong vi nhân giống truyền thống
Theo Sahay và Verma (2000) nhân giống in vitro truyền thống (vi nhân giống quang dị dưỡng) bao gồm bốn giai đoạn:
Giai đoạn 1: Thiết lập hệ thống nuôi cấy vô trùng Giai đoạn 2: Nhân chồi
Giai đoạn 3: Tạo rễ và chuẩn bị cho sự phát triển trong điều kiện tự nhiên Giai đoạn 4: Thuần hóa ex vitro
1.3.2.3. Nhược điểm của phương pháp vi nhân giống truyền thống
Mặc dù vi nhân giống theo lối truyền thống đã được nghiên cứu và ứng dụng qua vài thập kỷ, được cải tiến khá nhiều để tăng hệ số nhân, giảm chi phí và phù hợp với nhiều loài cây khác nhau, nhưng những nghiên cứu cải tiến này phần lớn vẫn tập trung vào vấn đề cải thiện các thành phần của môi trường hóa học (thành phần và nồng độ khoáng, loại và nồng độ đường, pH, v.v.) hay các biện pháp kiểm soát phát sinh hình thái của thực vật nuôi cấy in vitro (loại và nồng độ của CĐHSTTV, loại vật liệu mẫu và phương pháp xử lý với từng vật liệu mẫu khác nhau như đỉnh sinh trưởng, mô sẹo, tế bào đơn, lớp tế bào mỏng, v.v.). Trong khi đó, nhiều yếu tố vật lý ảnh hưởng đến sinh lý thực vật như ánh sáng, nồng độ CO2, độ ẩm không khí, nhiệt độ môi trường, giá thể, v.v. lại ít được quan tâm, và thực tế thì, nếu áp dụng vi nhân giống truyền thống, cũng khó có thể cải thiện được. Chính điều này đã làm cho phương pháp này còn mang một số nhược điểm như:
Trong nuôi cấy in vitro, những mẫu thực vật được đặt vào một vi môi trường với điều kiện tối ưu nhất sự phát triển của cây (Hazarika, 2006). Các thực vật in vitro
thường được phát triển trong hộp nuôi cây kín vô trùng dưới cường độ ánh sáng thấp, trên môi trường nhiều thành phần khoáng và các hợp chất carbon hữu cơ cho phép sự phát triển cả tự dưỡng và dị dưỡng, cùng với không khí có độ ẩm tương đối cao. Những điều kiện đặc biệt trong suốt giai đoạn nuôi cấy in vitro dẫn đến kết quả là một số thực vật có sự phát triển bất thường về sinh lý và hình thái. Thực vật in vitro trong nuôi cấy truyền thống thường được mô tả với khả năng quang hợp yếu, sự bất thường trong chức năng khí khổng và sự giảm lớp sáp bề mặt (Hazarika, 2006). Nhiều nghiên cứu cho thấy khí khổng của cây in vitro mất khả năng đóng khi cây được chuyển ra khỏi điều kiện nuôi cấy in vitro (Brainerd và Fuchigami, 1982; Wardle và Short, 1983). Cấu trúc khí khổng và hoạt động của khí khổng bị bất thường là những yếu tố gây nên sự mất nước nhanh chóng của cây nuôi cấy in vitro. Hiện tượng thủy tinh thể cũng là một sự rối loạn về hình thái và sinh lý của những cây được nhân giống theo kiểu truyền thống Ziv (1991). Mohamed-Yasseen và cs (1992) nhận thấy rằng ở các lá bị thủy tinh thể mật độ khí khổng thấp hơn so với các lá không bị thủy tinh thể. Khí khổng bị biến dạng, đóng chặt và bít, tế bào nhu mô bề mặt bị kéo dài ra và rữa nát ở các lá bị thủy tinh thể. Sự thay đổi của khí khổng và bề mặt lá khiến cho sự mất nước nhờ vào sự bốc thoát hơi nước giảm kéo theo đó là sự gia tăng tích lũy nước trong các khoang và cuối cùng dẫn đến hiện tượng thủy tinh thể. Kataeva và cs (1991) đã chứng minh rằng thủy tinh thể phụ thuộc vào lượng nước, hàm lượng vi lượng và sự cân bằng hormon trong môi trường. Tuy nhiên, vi môi trường và sự tích lũy ethylene bên trong hộp nuôi cây cũng là những yếu tố ảnh hưởng đến hiện tượng thủy tinh thể.
Tỷ lệ nhiễm nấm khuẩn cao
Việc sử dụng đường và các chất hữu cơ trong môi trường nuôi cấy của vi nhân giống truyền thống tạo nên điều kiện rất thuận lợi cho sự phát triển của vi sinh vật. Chính vì vậy trong vi nhân giống truyền thống, tạp nhiễm thực sự là một vấn đề lớn.
Các hộp chứa cây bị nhiễm thường phải bị loại bỏ do vi sinh vật phát triển quá mạnh, lấn át chồi in vitro và phân giải các chất hữu cơ trong môi trường tạo nên nhiều chất độc gây chết chồi cây nhanh chóng. Tạp nhiễm làm hao hụt một lượng không nhỏ cây con và góp phần làm tăng giá thành cây có nguồn gốc từ vi nhân giống.
Tăng trưởng kém do hoạt động của bộ máy quang hợp yếu
Khả năng quang hợp của thực vật trong điều kiện vi nhân giống truyền thống bị ức chế bởi nhiều yếu tố, trong đó quan trọng nhất là nồng độ đường và nồng độ CO2
(Kubota, 2002).
Trong vi nhân giống truyền thống, đường được sử dụng như là nguồn carbon chính cung cấp năng lượng chủ yếu cho cây. Việc bổ sung đường sucrose hay các loại đường khác cũng như một số thành phần hữu cơ như nước dừa, chuối, vitamin, dịch chiết nấm men, v.v., vào môi trường đã giúp thực vật in vitro phát triển tốt. Một số trong các thành phần này sau đó đã được sử dụng một cách rộng rãi và phổ biến, thậm chí gần như trở thành thiết yếu trong các môi trường nuôi cấy mô trong nhiều thập kỷ. Tuy nhiên, trong những năm gần đây, đã có rất nhiều nghiên cứu thực hiện trên nhiều loài cây khác nhau khẳng định ảnh hưởng không tốt của việc bổ sung đường vào môi trường nuôi cấy lên khả năng quang hợp của thực vật in vitro. Nghiên cứu của Hdider và Desjardins (1994) trên cây dâu tây (Fragaria x ananassa Duch. cv Kent) đã cho thấy với nồng độ đường sucrose thấp (0 – 10 g/l), cây con có khả năng quang hợp tốt hơn, hiệu suất quang hợp cao hơn và điểm bù ánh sáng cũng thấp hơn một cách rõ rệt so với ở nồng độ đường cao (30 – 50 g/l). Nghiên cứu của Capelladesl và cs (1991) trên cây hoa hồng (Rosa multiflora L. cv. Montse) cũng cho thấy khả năng quang hợp và khả năng đáp ứng với ánh sáng của cây in vitro giảm rõ rệt khi nồng độ đường sucrose trong môi trường nuôi cấy tăng. Hình giải phẫu mô lá cho thấy có sự tích lũy các hạt tinh bột trong lục lạp khi nồng độ đường cao đã làm giảm tỷ lệ tái tạo RuBP (Ribulose-1,5- bisphosphate) hoặc ức chế hoạt tính của men RuBisCO (Ribulose bisphosphate carboxylase/oxygenase).
Nồng độ CO2 trong hộp nuôi cấy thấp là một yếu tố quan trọng khác kiềm hãm hoạt động quang hợp của cây in vitro. Hộp nuôi cây in vitro truyền thống nhỏ và kín, vì vậy, lượng CO2 trong hộp rất thấp và thiếu hụt cho hoạt động quang hợp của cây. Fujiwara và cs (1987) khi đo nồng độ CO2 trong hộp nuôi cây đã nhận thấy nồng độ CO2 trong hộp kín chứa cây in vitro nuôi cấy theo phương pháp truyền thống giảm xuống còn 70-80 µmol mol-1 sau 2 giờ chiếu sáng.
Tỷ lệ sống của cây in vitro ở giai đoạn ex vitro thấp
Thực vật trong vi nhân giống truyền thống, do sống phụ thuộc nhiều vào nguồn carbon hữu cơ (đường và vitamin trong môi trường) nên khi chuyển ra điều kiện ex
vitro, không còn được cung cấp nguồn carbon hữu cơ trong khi bộ máy quang hợp chưa
hoạt động bình thường, thường tăng trưởng chậm cho đến khi cây thích nghi với các điều kiện môi trường ở vườn ươm và khả năng quang hợp của cây trở lại bình thường. Do bộ máy quang hợp hoạt động kém nên cây in vitro không chịu được ánh sáng cao cũng như ẩm độ thấp và cần chăm sóc đặc biệt để hạn chế sự mất nước của cây (Hazarika, 2006).
Do khí khổng của cây trong vi nhân giống truyền thống lúc nào cũng mở trong suốt giai đoạn nuôi cấy in vitro trong hộp nuôi cấy kín với ẩm độ cao, nên khi cây được đưa ra điều kiện ex vitro với độ ẩm thấp, khí khổng chưa hoạt động lại bình thường, vẫn tiếp tục mở nên cây in vitro nuôi cấy truyền thống bị mất nước nhanh chóng dẫn đến tỷ lệ sống không cao như mong muốn của các nhà vi nhân giống (Hazarika, 2006).
Giá thành cây cấy mô cao
Một hệ quả của vấn đề tạp nhiễm là không thể sử dụng được các hệ thống nuôi cây có kích thước lớn trong vi nhân giống truyền thống vì tính rủi ro cao. Các hộp nuôi cây trong vi nhân giống truyền thống thường nhỏ và kín để hạn chế sự xâm nhập của vi sinh vật. Điều này khiến cho các thao tác nuôi cấy và vệ sinh dụng cụ trở nên khó khăn, hao tốn nhân công, và chi phí cao để đầu tư cho một số lượng lớn hộp nuôi cây trong sản xuất (Kubota, 2002).
Để đạt được tỷ lệ sống cây in vitro cao khi đưa ra vườn ươm, quy trình sản xuất phải có một giai đoạn thuần hóa giúp cây con in vitro thích nghi với điều kiện ex vitro, dẫn đến việc tăng giá thành cây in vitro. Bên cạnh đó, các CĐHSTTV cũng được sử dụng thường xuyên theo từng giai đoạn phát sinh hình thái để tạo cây in vitro hoàn chỉnh khi sử dụng phương pháp nuôi cấy truyền thống đã làm tăng chi phí sản xuất (Hazarika, 2006).