3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.4. Ảnh hưởng của thời gian chiếu sáng và cường độ ánh sáng lên sự tăng
trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng
Trong vi nhân giống thực vật, cả quang dị dưỡng và quang tự dưỡng, cây đều phải sử dụng năng lượng từ ánh sáng để tổng hợp chất hữu cơ từ nguồn carbon vô cơ trong môi trường. Do đó, ánh sáng bao gồm cường độ ánh sáng (CĐAS) và thời gian chiếu sáng (TGCS) là những yếu tố vật lý sẽ tác động trực tiếp lên sự tăng trưởng của thực vật thông qua quá trình quang hợp. Để làm rõ vai trò của ánh sáng lên sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản in vitro, thí nghiệm này được thiết kế nhằm khảo sát ảnh hưởng của CĐAS và TGCS khi cây đương quy Nhật Bản được nuôi cấy trong điều kiện QTD thay vì trong điều kiện nuôi cấy truyền thống.
Dưới điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng, bộ lá của cây đóng một vai trò vô cùng quan trọng đối với sự tăng trưởng liên tục của cây, bởi vì lá sản xuất carbohydrate nhờ vào quá trình quang hợp. Do đó, sự khác biệt từ ban đầu trong hoạt động của bộ lá sẽ
ảnh hưởng lên tốc độ tăng trưởng và những biến đổi khác của cây. Việc đặt các chồi đương quy Nhật Bản ngay từ đầu dưới điều kiện TGCS dài, 16 giờ, có lẽ đã giúp cây quang hợp tốt hơn ngay từ đầu và tạo ra nhiều vật chất hơn. Nguồn vật chất này sau đó được sử dụng để phát triển các bộ phận của cây như rễ và bộ lá. Những bộ phận này lại giúp cho chồi hấp thu dinh dưỡng, quang hợp tốt hơn, và tăng trưởng thành cây hoàn chỉnh.
Sự tăng trưởng và phát triển của bộ rễ cũng như của toàn bộ cơ thể thực vật liên quan trực tiếp đến sự tăng trưởng và khả năng hoạt động tốt của bộ lá. Lá là cơ quan đảm nhận vai trò tiếp nhận năng lượng ánh sáng, thực hiện quang hợp, hấp thu và cố định CO2 không khí để tạo ra nguồn vật chất hữu cơ cho cây. Theo một số kết quả nghiên cứu của Kozai và cs (1995) cũng như Kitaya và cs (1995) trên cây khoai tây, các tác giả ghi nhận sự phát triển của bộ lá (thể hiện qua số lá và diện tích lá/cây) tăng dần khi tăng CĐAS và TGCS. Trong thí nghiệm này, các chỉ tiêu đo được ở ngày kết thúc thí nghiệm trên cây đương quy Nhật Bản in vitro cũng cho một kết quả tương tự. Cùng với sự phát triển mạnh của bộ lá, cây quang hợp tốt hơn, tạo ra nhiều vật chất hơn cho sự tăng trưởng của cây và các bộ phận khác. Theo Hussein (2008), hàm lượng auxin nội sinh là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng ra rễ của cây
Beaumontia grandiflora Wallich khi cắt đốt. Hoạt tính auxin nội sinh đo được bằng
phương pháp sinh trắc nghiệm của các chồi đương quy Nhật Bản ở ngày đầu tiên nuôi cấy cao hơn các cây in vitro đo ở ngày kết thúc thí nghiệm ở tất cả các nghiệm thức. Khi đặt mẫu chồi đương quy trong các hộp nuôi cây, lượng auxin nội sinh này có thể đã di chuyển hữu cực xuống gốc giúp cho sự hình thành rễ bất định. Auxin trong cơ thể thực vật chủ yếu được tạo ra từ lá non. Chính vì vậy, sự tăng trưởng tốt hơn của bộ lá trong điều kiện TGCS 16 giờ đã giúp cây tạo ra nhiều auxin nội sinh hơn (Bảng
3.18) và hiện diện trong rễ ở hàm lượng ngày càng cao. Sự kiện này giải thích vì sao rễ kéo dài trước (nồng độ auxin thấp), sau đó xuất hiện nhiều rễ con (nồng độ auxin cao) (Bùi Trang Việt, 2000). Lượng auxin nội sinh được tạo ra nhiều hơn trong các nghiệm
thức TGCS 16 giờ đã giúp cho bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức này luôn tăng trưởng hơn so với các nghiệm thức TGCS 8 giờ. Kết quả này tương tự với kết quả nghiên cứu của YongKweon và KiSun (1996) trên cây Abeliophyllum
distichum Nakai cũng như kết quả của Hussein (2003) trên cây Beaumontia
grandiflora. Theo các công bố này, những đốt cắt sẽ ra rễ tốt hơn khi có hàm lượng
auxin nội sinh cao hơn. Khả năng ra rễ của cây còn liên quan đến hàm lượng carbohydrate trong cây. Hussein (2008) nhận thấy rằng hàm lượng carbohydrate cao ở các đốt cắt đã làm tăng tỷ lệ đốt cắt hình thành rễ. TGCS dài và CĐAS cao còn làm gia tăng hiệu suất quang hợp của cây đương quy Nhật Bản in vitro và đã tạo ra một lượng carbohydrate nhiều hơn trong các nghiệm thức TGCS 16 giờ so với các nghiệm thức TGCS 8 giờ (Bảng 3.17), dẫn đến bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản trong các nghiệm thức TGCS 16 giờ tăng trưởng mạnh hơn.
Sự tăng trưởng của thực vật được đánh giá là tốt khi có sự phát triển đồng bộ ở tất cả các cơ quan. Bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức CĐAS thấp và TGCS ngắn đã phát triển rất kém. Đây là hệ quả của hoạt động quang hợp yếu kém khi chồi đương quy được đặt trong những điều kiện nuôi cấy này khiến sự tăng trưởng của chồi theo thời gian không tạo đủ vật chất để bộ rễ tăng trưởng tốt. Tỷ lệ TLK thân lá/rễ cũng cho thấy ở tình trạng thiếu ánh sáng và tích lũy được ít vật chất, cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy ở TGCS ngắn và CĐAS thấp có khuynh hướng tập trung vật chất vào phát triển thân lá mà ít phát triển bộ rễ, khiến cho tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ rất cao, trong khi ở CĐAS cao và TGCS dài hơn, bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản đã phát triển tương xứng và cân bằng hơn với thân lá (Bảng 3.14). Nghiên cứu của Kitaya và cs (1995) trên cây khoai tây nuôi cấy quang tự dưỡng cũng cho thấy tỷ lệ trọng lượng khô thân lá/rễ giảm dần khi CĐAS tăng từ 30 µmol m-2 s-1 lên 90 µmol m-2 s-1. Chính bộ rễ phát triển mạnh đã giúp cho cây hấp thu nước và muối khoáng từ môi trường nuôi cấy tốt hơn, tạo điều kiện cho sản phẩm quang hợp của cây tích lũy tốt hơn. Bộ rễ tăng trưởng tốt hơn còn giúp cho sự tổng hợp cytokinin nội sinh trong các
nghiệm thức TGCS 16 giờ tốt hơn so với ở các nghiệm thức TGCS 8 giờ. Cytokinin được tạo ra từ rễ, sau đó được dẫn xuất lên thân lá trong hệ thống mạch mộc. Tại đây, cytokinin kích thích sự gia tăng kích thước tế bào lá trưởng thành (Bùi Trang Việt, 2000). Chính vì vậy, hàm lượng cytokinin nội sinh cao hơn trong cây đương quy Nhật Bản ở các nghiệm thức TGCS 16 giờ đã giúp giải thích sự khác biệt về diện tích lá của cây trong các nghiệm thức này so với các nghiệm thức TGCS 8 giờ (Bảng 3.15).
Với TGCS 16 giờ, mức năng lượng ánh sáng (LAS) cung cấp cho chồi đương quy Nhật Bản trong một ngày sẽ nhiều hơn so với mức ở TGCS 8 giờ khi cùng CĐAS. Tuy hai nghiệm thức 8-100 và 16-50 có cùng LAS, sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản ở nghiệm thức 16-50 cao hơn so với cây ở nghiệm thức 8-100. Ngoài ra, nghiệm thức 8-150 có LAS lớn hơn ở nghiệm thức 16-50 nhưng cây ở nghiệm thức này có GTTLT và GTTLK thấp hơn so với nghiệm thức 16-50. Như vậy, TGCS dài hơn giúp chồi đương quy Nhật Bản hấp thu ánh sáng hiệu quả hơn, dẫn đến mức năng lượng mà chồi thực sự thu nhận được cao hơn. Kết quả này tương tự như kết quả mà Kozai và cs (1995) trên cây khoai tây. Các tác giả này ghi nhận rằng khi nuôi cấy ở cùng một mức LAS thì cây khoai tây nuôi cấy in vitro QTD ở TGCS dài hơn (16 giờ) và CĐAS thấp hơn (70 µmol m-2 s-1) cho trọng lượng tươi và trọng lượng khô của cây lớn hơn so với ở TGCS ngắn (8 giờ) và CĐAS cao (140 µmol m-2 s-1).
Chiều cao tán của cây thể hiện khả năng vươn của lá trong hộp nuôi cây. CCT cao hơn đồng nghĩa với việc các lá mới hình thành vươn đến những khoảng xa hơn và tránh sự chồng chéo lên nhau của bộ lá. Sự phân phối hợp lý về mặt kết cấu của bộ lá trong hộp nuôi cây giúp cây hấp thụ tối đa lượng ánh sáng chiếu đến cây. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Kozai và cs (1995) trên cây khoai tây dưới điều kiện TGCS và CĐAS khác nhau. Các tác giả này chứng minh rằng cây nuôi cấy với TGCS 16 giờ/ngày sẽ có chiều cao lớn hơn cây tăng trưởng trong TGCS 8 giờ/ngày đồng thời số lá mở trên cây cũng tăng tương ứng với chiều cao cây.
Trong phương pháp nuôi cấy mô QTD, tổng lượng carbohydrate trong cơ thể thực vật là do chính thực vật tạo ra nhờ vào quang hợp mà không có sự bổ sung nào từ đường hay vật chất hữu cơ trong môi trường nuôi cấy. Nói cách khác, lượng carbohydrate mà thực vật tạo ra cũng là những chỉ tiêu quan trọng cho thấy khả năng quang hợp và đồng hóa vật chất của thực vật. NAR (hiệu suất đồng hóa thuần) được dùng để đo lường lượng vật chất tạo ra do quang hợp còn lại sau khi trừ đi những vật chất mất đi do hô hấp (Hussain và cs, 2010). Điều này có nghĩa NAR càng lớn, lượng vật chất còn lại trong cây càng cao. TGCS 16 giờ làm gia tăng NAR so với TGCS 8 giờ, vì vậy mà hàm lượng đường tổng số và hàm lượng tinh bột đo được ở các nghiệm thức TGCS 16 giờ đều cao hơn các nghiệm thức TGCS 8 giờ (Bảng 3.17). Theo Preiss (1982), điều kiện ngày dài thích hợp cho hoạt động quang hợp và cho sự vận chuyển và sự phân phối carbohydrate trong thực vật. Vì vậy, ngày dài làm gia tăng cả sự tích lũy tinh bột trong lục lạp và sự dự trữ tinh bột trong bột lạp của các tế bào không quang hợp. Sự gia tăng quang hợp còn do sự hấp thu CO2 gia tăng. Jo và cs (2008) khi nghiên
cứu trên cây Alocasia amazonica nhận thấy rằng khi CĐAS tăng từ 15 µmol m-2 s-1 lên 90 µmol m-2 s-1 thì chiều dài, chiều rộng và mật độ khí khổng của cây tăng. Trong thí nghiệm này, các kết quả ghi nhận về chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng của cây đương quy Nhật Bản khi CĐAS tăng cũng tăng và đã giúp cho hiệu suất quang hợp thuần của cây tăng. Vì vậy, khi CĐAS tăng từ 50 µmol m-2 s-1 lên 100 µmol m-2 s-1, hàm lượng đường tổng số và tinh bột tăng theo. Tuy nhiên, ở TGCS 16 giờ, hàm lượng tinh bột và đường tổng số ở ngày thứ 42 không thay đổi dù CĐAS tiếp tục nâng lên 150 µmol m-2 s-1. Điều này có thể là do hiệu suất quang hợp thuần của cây ở nghiệm thức 16-150 giảm từ ngày nuôi cấy thứ 35 đến ngày 42 bởi vì khi quang hợp giảm sự tổng hợp đường và tinh bột cũng sẽ giảm.
Việc giảm hiệu suất quang hợp thuần (Pn) của cây đương quy Nhật Bản ở nghiệm thức 16-150 vào ngày thứ 42 có thể được giải thích như sau: Từ ngày nuôi cấy thứ 21 cho đến ngày thứ 35, tất cả các nghiệm thức đều cho thấy sự gia tăng hiệu suất quang
hợp thuần. Trong nhiều nghiên cứu nuôi cấy mô QTD, đây là giai đoạn tăng trưởng nhanh của hầu hết thực vật sau một thời gian từ 15 – 20 ngày ban đầu để thực vật điều chỉnh hoạt động của bộ máy quang hợp thích nghi với điều kiện nuôi cấy không đường và không vitamin. Tuy nhiên, từ ngày 35 đến ngày 42, trong khi tất cả các nghiệm thức còn lại đều tiếp tục gia tăng Pn thì ở nghiệm thức 16-150, Pn của cây bị giảm (Hình 3.21). Trong nuôi cấy QTD phụ thuộc vào sự hiện diện của nguồn carbon vô cơ, việc sử dụng hộp nuôi cây có màng trao đổi khí với bên ngoài là điều bắt buộc. Điều này cũng đồng nghĩa với việc gia tăng tốc độ thoát hơi nước của cây và tốc độ bốc hơi của môi trường nuôi cây. Tốc độ bốc thoát hơi nước của cây còn phụ thuộc vào nhiệt độ của không khí trong hộp nuôi cây. Nghiệm thức 16-150 với TGCS dài và CĐAS cao hơn đã tạo nên một nhiệt độ lớn hơn trong các hộp nuôi cây so với các nghiệm thức khác. Kết quả là sự thoát hơi nước của cây và bốc hơi của môi trường diễn ra mạnh hơn. Bên cạnh đó, chiều dài, chiều rộng và số lượng khí khổng ở nghiệm thức 16-150 cao hơn các nghiệm thức còn lại cũng khiến tốc độ bốc thoát hơi nước diễn ra nhanh hơn. Độ ẩm tương đối của môi trường nuôi cấy ở nghiệm thức 16-150 thấp cũng có thể là nguyên nhân khiến cho hiệu suất quang hợp thuần của cây đương quy Nhật Bản giảm ở nghiệm thức này vào ngày 42. Thực vật in vitro khi được nuôi cấy QTD không có nguồn carbon hữu cơ trong một thời gian có thể đã trở lại với những chức năng sinh lý tương đối bình thường như ở điều kiện tự nhiên. Vì vậy, bản thân thực vật in vitro có thể đã có trở lại một cơ chế điều hòa sự đóng mở khí khổng phù hợp với môi trường sống. Trong tự nhiên, khi cần thiết, thực vật có thể đóng tạm thời các khí khổng để tránh sự thiếu hụt nước trong cơ thể (Bùi Trang Việt, 2002). Trong trường hợp này, rất có thể cây đương quy Nhật Bản trong điều kiện nuôi cấy QTD đã có khả năng tự điều hòa việc đóng các khí khổng để hạn chế sự mất nước khi môi trường khô hạn, đồng nghĩa với việc giảm hấp thu CO2 khiến hiệu suất quang hợp thuần cũng giảm. Nồng độ CO2 đo được vào ngày thứ 42 trong hộp nuôi cây ở nghiệm thức 16-150 cao hơn so với nồng độ đo được vào ngày thứ 35, chứng tỏ khả năng thu nhận CO2 của cây đã giảm
mà nguyên nhân có thể do sự hạn chế mở của khí khổng. Kitaya và cs (2005) cũng đã chứng minh tốc độ dòng khí trong hộp nuôi cây chứa một mẫu thực vật cao 10 mm và trong hộp chứa một mẫu cao 60 mm tương ứng chỉ bằng 1/3 và 1/6 so với tốc độ dòng khí đạt được trong hộp không chứa mẫu thực vật nào. Cũng theo Kitaya và cs (2005), việc tăng cường sự di chuyển của không khí trong hộp nuôi cây sẽ thúc đẩy quang hợp của thực vật do lượng CO2 cung cấp sẽ đáp ứng đầy đủ hơn cho nhu cầu quang hợp của thực vật . Vì vậy, với cây đương quy Nhật Bản có kích thước lớn hơn, sự giới hạn về hộp nuôi cây ở nghiệm thức 16-150 có thể đã góp phần làm sụt giảm Pn ở nghiệm thức này vào ngày nuôi cấy thứ 42. Nếu cây đương quy Nhật Bản được nuôi trong hộp có kích thước lớn hơn hay/và sự lưu thông không khí trong hộp nuôi lớn hơn (số lần trao đổi khí lớn hơn) thì khả năng tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản có thể sẽ lớn hơn nữa.