3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.2. Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin và độ thông thoáng của hộp nuô
cây lên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro và tác động lên cây con ex vitro
Vi nhân giống quang dị dưỡng (QDD) hay còn gọi là vi nhân giống truyền thống phần lớn chú trọng đến các yếu tố hóa học của môi trường nuôi cấy bao gồm nồng độ, thành phần các loại hợp chất bổ sung vào môi trường nuôi cấy, trong khi vi nhân giống quang tự dưỡng (QTD) phần lớn chỉ quan tâm đến các yếu tố vật lý như ánh sáng, nồng độ CO2, nhiệt độ, độ ẩm tương đối, sự trao đổi không khí giữa bên trong và bên ngoài hộp nuôi cây. Trong thí nghiệm này, ảnh hưởng của yếu tố hóa học đường, vitamin
trong điều kiện nuôi cấy QDD và ảnh hưởng của yếu tố vật lý sự thông thoáng khí của hộp nuôi cây trong điều kiện nuôi cấy QTD lên sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật
Bản in vitro đã được nghiên cứu. Các kết quả thu được cho thấy cây đương quy Nhật
Bản có khả năng tăng trưởng tốt trong điều kiện nuôi cấy QTD không thua kém gì so với cây nuôi theo phương pháp truyền thống QDD.
Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh về hiệu quả của phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng trong vấn đề giúp gia tăng khả năng tăng trưởng của cây không chỉ trong điều kiện in vitro mà còn trong điều kiện ex vitro. Nguyen va Kozai (2001a) đã tiến hành nuôi cấy rất nhiều loài thực vật thân gỗ như măng cụt (Garcinia mangostana), cà phê (Coffea arabusta), hông (Paulownia fortunei), keo (Acacia mangium) và neem
(Azadirachta indica) bằng phương pháp nuôi cấy mô QTD. Kết quả cho thấy rằng các
đối tượng thực vật này đều tăng trưởng rất tốt, bằng hoặc hơn so với điều kiện nuôi cấy QDD. Couceiro và cs, 2006 cũng nhận thấy rằng cây St. John’s wort (Hypericum
perforatum L.) nuôi cấy QTD cho sự gia tăng sinh khối tốt hơn so với điều kiện nuôi
cấy QDD (gấp hơn 10 lần về trọng lượng tươi). Bên cạnh đó, vẫn có một số kết quả ghi nhận rằng gia tăng trọng lượng của cây trong điều kiện QDD tốt hơn QTD. Nguyen và Kozai (2001b) ghi nhận kết quả về GTTLT của cây chuối Musa spp. trong điều kiện QDD cao hơn. Iarema và cs (2012) cũng đưa đến kết quả GTTLT tốt hơn trong điều kiện QDD so với điều kiện QTD khi nuôi cấy cây sâm (Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen). Tuy nhiên, các tác giả này nhận thấy rằng hợp chất 20-hydroxyecdysone (hợp chất thứ cấp quan trọng trong loài sâm này) trong mẫu thực vật tăng cao hơn trong điều kiện QTD. Tuy có sự khác biệt về GTTLT của mẫu thực vật trong điều kiện in
vitro, các nghiên cứu này đều có sự tương đồng khi ghi nhận rằng khả năng tăng trưởng
và tỷ lệ sống sót khi đưa ra vườn ươm của các cây con QTD đều cao hơn so với các cây con QDD.
Các kết quả đạt được từ những nghiên cứu trên cho thấy rằng, sự tăng trưởng của cây con khi áp dụng phương pháp nuôi cấy mô QTD trước tiên là do sinh lý của từng loài thực vật quyết định.
Cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy QDD vẫn có khả năng tự quang hợp. Nồng độ CO2 bên trong hộp của cây QDD vào ngày nuôi cấy thứ 20 rất cao so với ngày nuôi cấy thứ 30 và 40 (Hình 3.7). Điều này chứng tỏ cùng với sự tăng trưởng theo thời gian của cây thì sự hấp thu khí CO2 trong hộp nuôi cây QDD cũng gia tăng. Kết quả này tương đồng với kết quả của Baroja và cs (1995) khi nghiên cứu trên cây khoai tây (Solanum
tuberosum L.). Các tác giả này nhận thấy rằng nồng độ CO2 bên trong hộp nuôi cây
giảm từ 600-900 µmol mol-1 ở giai đoạn tối xuống còn 90-110 µmol mol-1 ngay ở giai đoạn sáng. Trong thí nghiệm này, trên cây đương quy Nhật Bản in vitro, sự hấp thu CO2
của cây làm cạn kiệt lượng CO2 trong hộp trong khi không khí không vào được trong hộp khiến cho nồng độ CO2 trong hộp QDD gần như không đổi khi đo ở các ngày 30 và 40. Mức CO2 này, có thể là mức điểm bù CO2 của cây đương quy Nhật Bản, rõ ràng đã làm giới hạn khả năng quang hợp của cây, dẫn đến hiệu suất quang hợp thuần Pn của cây trong điều kiện QDD thấp hơn nhiều so với điều kiện QTD (Hình 3.8). Ngoài ra, trong nuôi cấy truyền thống, khi có sự hiện diện của đường và vitamin trong môi trường, cây cấy mô sẽ ưu tiên sử dụng đường và vitamin và khiến bộ máy quang hợp hoạt động kém (Kozai và Sekimoto, 1988). Theo Neumann và Bender (1987), nồng độ sucrose cao trong môi trường ngăn chặn sự tích lũy chlorophyll in vitro, kết quả này là do sự sản xuất chlorophyll giảm khi đường ngoại sinh được bổ sung (Grout và Donkin, 1987). Trong thí nghiệm này, hàm lượng chl a và chl a+b của cây ở nghiệm thức QDD đều thấp hơn so với cây ở nghiệm thức QTD.
Theo Bùi Trang Việt (2002), cây thông qua hô hấp sẽ tiêu thụ lượng carbon đồng hóa để có năng lượng cần thiết cho sự duy trì và gia tăng sinh khối. Liu và cs (2009) khi tiến hành nuôi loài vi tảo Phaeodacty lumtricornutum trong điều kiện QDD và QTD cũng đã nhận thấy các nguồn carbon hữu cơ bổ sung vào môi trường nuôi cấy
QDD khiến cho vi tảo có hàm lượng chlorophyll a thấp hơn và hiệu suất quang hợp thuần thấp hơn do tốc độ vận chuyển electron bị giảm đi so với trong điều kiện nuôi cấy QTD, đồng thời cường độ hô hấp và sinh khối của tảo lại cao hơn so với trong điều kiện nuôi cấy QTD. Các tác giả đưa đến kết luận loài vi tảo này đã đồng hóa nguồn carbon hữu cơ bổ sung vào môi trường thông qua quá trình hô hấp để tạo sinh khối hơn là thông qua quá trình quang hợp. Trong thí nghiệm này, chồi cây đương quy Nhật Bản cũng có thể đã gia tăng hoạt động hô hấp để tiêu thụ lượng carbon đồng hóa từ đường và vitamin trong môi trường nuôi cấy giúp gia tăng sinh khối của cây.
Hiệu suất quang hợp thuần của cây đương quy Nhật Bản QTD in vitro gia tăng mạnh theo thời gian nuôi cấy, đi kèm là sự giảm nồng độ CO2 trong hộp nuôi theo thời gian (Hình 3.7 & Hình 3.8). Vào lúc này, nhu cầu CO2 của cây lớn hơn nhưng do sự hạn chế về lỗ thông khí cũng như nồng độ CO2 của môi trường bên ngoài nên nồng độ CO2 trong hộp nuôi giảm nhiều. Sự hiện diện của đường và vitamin ngay từ đầu trong môi trường nuôi cấy đã giúp chồi cây đương quy Nhật Bản tăng trưởng liên tục và gia tăng sinh khối thông qua hô hấp. Trong khi đó, trong điều kiện môi trường không có đường và vitamin, cây đương quy Nhật Bản in vitro phải dần thích nghi và gia tăng quang hợp để tạo nguồn carbon đồng hóa. Chính vì vậy, hiệu suất quang hợp thuần của cây QTD bắt buộc phải tăng cao, bởi vì lúc này, quang hợp là con đường duy nhất giúp thực vật cố định carbon. Sự thông thoáng khí của hộp nuôi cây trong điều kiện nuôi cấy quang tự dưỡng là điều bắt buộc để giúp gia tăng nồng độ CO2 trong hộp nuôi cây cần cho quang hợp. Sự gia tăng hiệu suất quang hợp thuần có thể được xem như là chỉ tiêu quan trọng nhất chứng minh khả năng phát triển tự dưỡng của cây đương quy Nhật Bản
in vitro.
Độ ẩm tương đối (RH) của hộp nuôi cây trong điều kiện QDD thường rất cao, hơn 95% trong các hộp kín. Trong khi đó, sự hiện diện của các màng trao đổi khí trên nắp hộp giúp cho RH trong hộp QTD giảm xuống do có sự trao đổi với RH của phòng nuôi cây. Sự giảm RH sẽ làm gia tăng tốc độ bốc thoát hơi nước và sự hấp thu muối
khoáng của cây (Nguyen và Kozai, 1998). Chính vì vậy, bộ rễ của cây đương quy Nhật Bản QTD in vitro lớn hơn so với bộ rễ của cây QDD (Bảng 3.3). Tichá (1996) nhận thấy rằng ở cây thuốc lá, việc sử dụng cả CO2 và đường trong môi trường làm nguồn carbon và năng lượng giúp thực vật tích lũy nhiều chất khô hơn là khi cây phát triển quang tự dưỡng hoàn toàn. Điều này có thể giải thích vì sao TLK rễ ở cây QDD lớn hơn so với cây QTD. Sự tăng trưởng tốt của bộ rễ cùng với khả năng quang hợp mạnh đã giúp cho cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy trong điều kiện QTD gia tăng trọng lượng tươi lớn hơn so với cây trong điều kiện QDD.
Sự phát triển tương đối đồng đều trong hai điều kiện nuôi cấy in vitro giúp cho các cây đương quy Nhật Bản tăng trưởng tương đồng nhau trong điều kiện ex vitro. Các chỉ tiêu về tỷ lệ sống, GTTLT, GTTLK, TLT rễ, TLK rễ, CCT, CDR, SL mở và DTL của các cây đương quy Nhật Bản ex vitro không có sự khác biệt. Có lẽ khả năng quang hợp vẫn được giữ nguyên trong điều kiện có đường và vitamin của cây QDD đã giúp cho các cây phát triển trong điều kiện này vẫn tăng trưởng tốt khi đặt cây vào giai đoạn ex vitro.
Tóm lại, cây đương quy Nhật Bản cho thấy khả năng tăng trưởng tốt trong điều kiện QTD in vitro và tiếp tục tăng trưởng tốt trong điều kiện ex vitro. Có rất nhiều thuận lợi khi giảm việc sử dụng đường trong môi trường nuôi cấy như ngăn chặn sự phát triển của nấm và vi khuẩn trong nuôi cấy, giảm giá thành (do không cần bổ sung đường và vitamin) và gia tăng tỷ lệ sống trong giai đoạn ex vitro (Kozai và Kubota,
2001). Chính vì vậy, việc sản xuất cây đương quy Nhật Bản in vitro có thể áp dụng phương pháp nuôi cấy mô QTD để đạt hiệu quả tốt hơn.