3. CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.3.Ảnh hưởng của thành phần khoáng và giá thể lên sự tăng trưởng của chồ
cây đương quy Nhật Bản nuôi cấy in vitro quang tự dưỡng
Trong thí nghiệm này, hai thành phần hóa học (khoáng) và vật lý (giá thể) của môi trường đã được khảo sát.
Việc áp dụng phương pháp nuôi cấy mô QTD vào thực vật đòi hỏi một sự thiết lập nhiều điều kiện nuôi cấy mới liên quan đến nhiều yếu tố khác nhau, bao gồm cả yếu tố hóa học lẫn vật lý, để đạt được sự phù hợp và từ đó kích thích sự tăng trưởng của thực vật thông qua sự quang hợp của lá cũng như sự tăng trưởng của rễ. Một trong những yếu tố vật lý mà các nhà nghiên cứu nuôi cấy mô rất quan tâm là loại giá thể bổ sung vào môi trường nuôi cấy. Yếu tố này tác động trực tiếp lên sự phát triển của vùng rễ. Rất nhiều nghiên cứu đã chứng minh rằng việc thay thế giá thể agar của nuôi cấy mô truyền thống bằng các giá thể có cơ cấu xốp (chất lỏng, không khí có thể đi qua được) sẽ giúp làm thay đổi cấu trúc bộ rễ, từ đó giúp tăng khả năng tăng trưởng của cây (Afreen-Zobayed và cs, 1999).
Agar là loại giá thể đặc trưng đại diện cho các giá thể loại gel được sử dụng thông dụng nhất trong nuôi cấy in vitro (Caldas và cs, 1990). Tuy nhiên gần đây, nhiều tác giả đã đề cập đến những ảnh hưởng không tốt đến chất lượng rễ của cây khi nuôi cấy trên môi trường agar. Yu và cs (2000) đã quan sát thấy khi nuôi cấy in vitro cây đu đủ, rễ hình thành ít hơn trên môi trường agar so với trên vermiculite. Theo Pierik (1988), rễ hình thành trong điều kiện kị khí trên giá thể agar không thể hiện đầy đủ chức năng khi chuyển sang điều kiện ex vitro. Những rễ in vitro phát triển yếu với hệ thống rễ thứ cấp nghèo nàn và chết đi rất nhanh. Nồng độ oxy thấp trong môi trường giá thể agar đặc góp phần làm cho sự hình thành rễ kém đi và sự tăng trưởng của rễ cũng giảm đi (Pierik, 1987). Các kết quả đạt được đối với sự tăng trưởng của bộ rễ đương quy Nhật
Bản in vitro cho thấy rõ tác động của giá thể lên trọng lượng và cấu trúc của bộ rễ. Bộ
rễ của cây trong giá thể vermiculite cho thấy một hệ thống rễ thứ cấp phát triển mạnh mẽ (Hình 3.13). Cây trong môi trường khoáng B5 và Enshi kết hợp với giá thể xốp là vermiculite cho tỷ lệ rễ có rễ thứ cấp là 100%. Trong khi đó, bộ rễ của cây trên giá thể agar có hệ thống rễ thứ cấp tương đối nghèo nàn. Kết quả này tương đồng với kết quả của Nguyen và cs (1999) trên đối tượng cây cà phê Coffea arabusta, Zobayed và cs (2001) trên cây Eucalyptus, Afreen và cs (2000) trên cây khoai lang. Các tác giả này
đều ghi nhận rằng cây in vitro đạt được hiệu suất quang hợp thuần cao hơn, sự tích lũy sinh khối lớn hơn và đặc biệt là khả năng sống sót cao hơn của cây trong giai đoạn ex
vitro do sự phát triển tốt hơn của bộ rễ khi thay thế agar bằng vermiculite trong môi
trường nuôi cấy. Theo Yu và cs (2000), sự thông khí là yếu tố quan trọng trong sự hình thành rễ bất định. Soffer và Burger (1988) cũng đã chứng minh rằng oxy hòa tan thiết yếu cho sự hình thành và tăng trưởng của rễ. Bằng cách sử dụng hệ thống khí thủy canh, các tác giả này nhận thấy nồng độ oxy hòa tan thấp dẫn đến thời gian cần cho sự hình thành rễ bất định dài hơn đồng thời phần trăm mẫu hình thành rễ, số lượng rễ hình thành trên mẫu và chiều dài rễ cũng bị giảm. Vermiculite là loại giá thể xốp, thông thoáng, do đó, sự xâm nhập của oxy vào hệ thống rễ sẽ dễ dàng hơn, từ đó giúp cho bộ rễ tăng trưởng tốt hơn.
Trong thí nghiệm này, một loại giá thể xốp khác được sử dụng là perlite. Tuy nhiên, cây đương quy Nhật Bản đặt nuôi trên giá thể perlite tăng trưởng kém hơn so với cây trên giá thể agar. Bởi vì bộ rễ của các cây trên giá thể perlite đã tăng trưởng kém hơn so với hai loại giá thể còn lại. Trong điều kiện phát triển tự nhiên, cây đương quy Nhật Bản được trồng ở những vùng đất sét ẩm (Yamada và Haruki, 2005). Điều này có nghĩa là loại giá thể sử dụng cho cây nên là những loại giá thể có độ mịn cao. Perlite là những hạt tinh thể có thành phần cấu tạo từ đá của núi lửa. Mặc dù hạt perlite xốp, chứa nhiều nước và thông thoáng để khí có thể đi vào dễ dàng, hạt perlite lại to và không mịn. Có lẽ chính vì đặc tính quá thông thoáng của hạt perlite khi xếp chồng lên nhau mà loại giá thể này không thích hợp cho sự tăng trưởng của rễ cây đương quy Nhật Bản in
vitro. Trong thí nghiệm này, tuy không đạt được sự tăng trưởng tốt, hệ rễ của cây đương
quy Nhật Bản khi phát triển trên giá thể perlite vẫn cho thấy những đặc trưng về mặt cấu trúc của các rễ phát triển ở những loại giá thể thông thoáng, đó là bộ rễ với tỷ lệ rễ có rễ thứ cấp cao hơn và đường kính rễ lớn hơn so với trên giá thể agar (Hình 3.13).
Cấu trúc giải phẫu cắt ngang qua gốc thân của chồi đương quy Nhật Bản in vitro
cho thấy rằng, sự hình thành rễ bất định ở cây đương quy Nhật Bản đi theo hai con đường: (1) rễ hình thành trực tiếp từ vùng tượng tầng libe mộc, và (2) rễ hình thành thông qua mô sẹo (Hình 3.14). Theo George (1996), sự hình thành rễ bất định gồm 4 giai đoạn: (1) giai đoạn cảm ứng: khi một vài tế bào được lên chương trình trở thành những tế bào có khả năng tạo rễ; (2) giai đoạn khởi xướng: khi sự thay đổi xảy ra, một vài tế bào ở những vùng có mạch (chẳng hạn như nhu mô libe) cho thấy hoạt động giống như các tế bào ở vùng mô phân sinh; (3) giai đoạn hình thành: các tế bào biệt hoá thành sơ khởi rễ có thể được nhìn thấy dưới kính hiển vi; và (4) giai đoạn phát triển (giai đoạn kéo dài): khi sơ khởi rễ kéo dài, chui ra khỏi vùng vỏ và phát triển thành rễ. Cho đến nay, auxin vẫn được xem là CĐHSTTV chính cảm ứng các tế bào biệt hóa thành những tế bào có khả năng tạo rễ. Các chồi đương quy Nhật Bản khi được đặt trong điều kiện không có sự bổ sung một số thành phần hóa học như đường, vitamin và các CĐHSTTV vẫn hình thành các rễ bất định với sự phát triển tốt của hệ thống rễ thứ cấp. Điều này có nghĩa là trong điều kiện QTD, khả năng quang hợp giúp cây tạo ra đầy đủ các hợp chất cần cho tất cả các quá trình sinh lý, phát sinh hình thái và tăng trưởng của cây.
Thành phần khoáng là một yếu tố hóa học khác không kém phần quan trọng trong nuôi cấy mô tế bào thực vật. Việc tìm hiểu ảnh hưởng của thành phần khoáng trong điều kiện nuôi cấy QTD sẽ cho thấy rõ vai trò của yếu tố khoáng lên sự tăng trưởng của cây. Các thành phần khoáng khác nhau cho thấy tác động khác nhau trên sự tăng trưởng của chồi cây đương quy Nhật Bản in vitro. Trên cùng một loại giá thể, sự tăng trưởng của cây luôn tốt hơn trên môi trường khoáng Enshi so với môi trường khoáng MS hoặc B5. Môi trường khoáng Enshi có tỷ lệ ion Ca2+ và Mg2+ cao hơn 1,3 và 2,7 lần so với môi trường khoáng MS, và hàm lượng K+, NO3- và NH4+ chỉ bằng 0,4; 0,4 và 0,1 lần so với môi trường khoáng MS (Bảng 3.19).
Bảng 3.19. Hàm lượng các ion đa lượng và tỷ lệ ion giữa các môi trường Loại ion MS (mmol/l) B5 (mmol/l) Enshi (mmol/l) Tỷ lệ ion Enshi/MS Tỷ lệ ion Enshi/B5 Ca2+ 3 1 4 1,3 4,0 K+ 20,1 24,8 8 0,4 0,3 Mg2+ 1,5 1 4,1 2,7 4,1 NO3- 39,4 24,4 16 0,4 0,7 NH4+ 20,6 2 1,3 0,1 0,7 H2PO4- 1,3 1,1 1,3 1,0 1,2
Môi trường khoáng đa lượng và vi lượng MS là môi trường tối ưu cho sự tăng trưởng dị dưỡng hoặc sự biệt hóa của mô sẹo, vì vậy có lẽ không phải là môi trường tối ưu cho sự phát triển của thực vật. Yang và cs (1995) nhận thấy rằng sự gia tăng khoảng
3 lần của một trong các ion Ca2+, Mg2+ hay H2PO4- sẽ giúp cho trọng lượng khô, trọng lượng tươi và diện tích lá của cây dâu tây nuôi cấy in vitro QTD gia tăng. Môi trường Enshi có sự gia tăng hàm lượng ion Mg2+ lên gần 3 lần so với trong môi trường MS và khoảng 4 lần so với môi trường B5. Đây có lẽ là lý do khiến cho sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản trong môi trường Enshi tốt hơn so với môi trường MS và B5. Bởi vì Mg và Ca là những nguyên tố có hoạt động đối kháng, sự gia tăng Mg cần đi kèm với sự tăng Ca để đạt được hiệu ứng tối hảo (Bùi Trang Việt, 2002).
Theo George và Davies (2008), sự phát triển của tế bào rễ sẽ bị kìm hãm nếu môi trường chứa nhiều amonium (NH4+), nhưng ngược lại rễ tăng trưởng cần nitrate (NO3-). Điều này liên quan mật thiết đến sự đồng hóa đạm của rễ. Giai đoạn đầu tiên của sự đồng hóa đạm là sự khử nitrate, thường xảy ra ở rễ, trong tối. Tiếp theo là sự tổng hợp acid amin có vai trò quan trọng trong sự tổng hợp protein của tế bào. Đặc biệt, sự đồng hóa đạm có những đặc điểm sau: mô non thích NH4+, NH4+ đối kháng với K+, Ca2+ hay
Mg2+. Do đó nếu dùng NH4+ quá nhiều sẽ gây thiếu K+, Ca2+ hay Mg2+ (Avilla, 1998). Sự dư thừa quá mức hàm lượng các ion NO3- và NH4+ có lẽ đã làm cho bộ rễ của cây
trong môi trường MS kém phát triển hơn so với môi trường Enshi. Ninh và cs (2007) cũng nhận thấy rằng, việc sử dụng dung dịch 200% Enshi (nghĩa là gia tăng mạnh lượng N có trong môi trường) làm giảm sự tăng trưởng của cây đường quy Nhật Bản trong cả hai hệ thống khí canh và thủy canh. Kozai và cs (1988) cũng đưa ra kết quả cho thấy dưới điều kiện QTD, sự tăng trưởng của cây cẩm chướng tốt hơn nếu môi trường MS cơ bản phức tạp được thay thế bằng môi trường Enshi đơn giản thường sử dụng trong hệ thống thủy canh.
Theo Fujiwara và Kozai (1995), điện thế thẩm thấu của môi trường MS là -212 Pa, môi trường B5 là -143 Pa và môi trường Enshi là -76 Pa. Dòng nước sẽ di chuyển từ nơi có điện thế thẩm thấu thấp đến nơi có điện thế thẩm thấu cao. Sự khác biệt về điện thế thẩm thấu chính là lực đẩy đưa nước từ môi trường nuôi cấy đến không khí thông qua thực vật nuôi cấy trong hộp. Sự di chuyển nhanh nước và muối khoáng trong môi trường Enshi có lẽ đã giúp cây tăng trưởng tốt hơn.
Sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản in vitro không chỉ chịu tác động riêng lẻ của yếu tố hóa học (khoáng) hay vật lý (giá thể) mà đồng thời chịu tác động của cả hai yếu tố này. Chính sự tương tác cùng lúc của cả hai yếu tố dẫn đến một kết quả gần như không có sự áp đảo của yếu tố nào trong sự tăng trưởng của cây đương quy Nhật Bản. Khi phối hợp giá thể vermiculite với một trong 3 loại môi trường khoáng thì GTTLT của cây thay đổi theo chiều tăng dần từ môi trường khoáng MS sang môi trường B5 rồi tới môi trường Enshi. Điều này không xảy ra tương tự ở môi trường khoáng MS hay B5 khi kết hợp với agar hay perlite. Tuy nhiên, dù kết hợp với loại giá thể nào, môi trường khoáng Enshi vẫn thích hợp hơn với cây đương quy Nhật Bản so với hai loại môi trường khoáng còn lại.
Stitt và Quick (1989) đã chứng minh rằng hiệu suất quang hợp của cây gia tăng khi số lá và diện tích lá gia tăng. Trong thí nghiệm này, từ ngày nuôi cấy thứ 21 đến ngày nuôi cấy thứ 42, cùng với sự gia tăng không ngừng của số lá mở cũng như diện tích lá (Bảng 3.10) đã giúp cho hiệu suất quang hợp thuần của các cây đương quy trong
tất cả các nghiệm thức gia tăng từ ngày 20 đến ngày 40 của thí nghiệm (Hình 3.16). Vào ngày nuôi cấy thứ 42, số lá mở và diện tích lá đạt cao nhất ở hai nghiệm thức EA và EV đã giúp cho hiệu suất quang hợp thuần của hai nghiệm thức này đạt cao nhất.
Khi nuôi cấy thực vật trong điều kiện sinh trưởng hoàn toàn tự dưỡng, hay nói cách khác, sự phát triển của cây in vitro trong các hộp nuôi cây giờ đây tương tự như sự phát triển của cây trong điều kiện nhà kính. Vì thế, tất cả những yếu tố vật lý tác động đến quá trình tăng trưởng của cây trong điều kiện nhà kính đều có thể trở thành những yếu tố tác động trực tiếp đến cây in vitro (Kozai và Kubota, 2005b). Tuy nhiên, do các hộp nuôi cây thường nhỏ, một sự thay đổi nhỏ của các yếu tố này sẽ dẫn đến một sự thay đổi vô cùng lớn, ảnh hưởng rõ rệt đến sinh lý và tăng trưởng của cây in vitro. Trong thí nghiệm này, sử dụng loại giá thể không phù hợp cho cây là một ví dụ. Từ đó có thể thấy rằng, việc áp dụng phương pháp nuôi cấy mô QTD đòi hỏi trước hết sự hiểu biết về sinh lý của đối tượng thực vật nghiên cứu, tiếp theo là những kiến thức nhất định về các yếu tố vật lý và hóa học sẽ tác động đến đối tượng thực vật đó.