Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố hóa lý và thành phần dinh dưỡng tới quá trình sinh tổng hợp chitinase từ trichoderma

Trent đại học vinh 664 Tr-ờng đại học vinh KHOA HểA HC === === đồ án tốt nghiệp Đề tµi: NGHIÊN CỨU ẢNH HƢỞNG CỦA MỘT SỐ YẾU TỐ HĨA LÝ VÀ THÀNH PHẦN DINH DƢỠNG TỚI Q TRÌNH SINH TỔNG HỢP CHITINASE TỪ TRICHODERMA Giảng Viên h-íng dÉn : Ths Đào Thị Thanh Xuân Sinh Viờn thực : Nguyễn Thị Hồng Líp : 50K - C«ng nghƯ thùc phÈm M· sè Sinh Viên : 0952040425 NghÖ an - 1/2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC NHIỆM VỤ ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng Số hiệu sinh viên: 0952040425 Khóa: 50 Ngành: Công Nghệ thực phẩm Tên đề tài:“Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hóa lý thành phần dinh dưỡng tới trình sinh tổng hợp Chitinase từ Trichoderma” Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: - Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ, pH đến khả sinh tổng hợp chitinase - Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase Họ tên cán hƣớng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Ngày giao nhiệm vụ đồ án: Ngày tháng năm 2013 Ngày hoàn thành đồ án: tháng 12 năm 2013 Ngày Ngày tháng năm 2014 Chủ nhiệm môn Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) (Ký, ghi rõ họ, tên) Sinh viên hoàn thành nộp đồ án tốt nghiệp ngày tháng năm 2014 Ngƣời duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng Số hiệu sinh viên: 0952040425 Khóa: Ngành: Cơng nghệ thực phẩm 50 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: PGS.TS Trần Đình Thắng Nội dung nghiên cứu, thiết kế: - Thu nhận enzym chitinase từ chủng nấm Trichoderma 095(2)TH - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ, pH đến khả sinh tổng hợp chitinase - Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng môi trường nuôi cấy đến trình sinh tổng hợp chitinase Nhận xét cán hƣớng dẫn: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2014 Cán hƣớng dẫn (Ký, ghi rõ họ, tên) BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO CỘNG HÒA XÃ HỘI CHỦ NGHĨA VIỆT NAM TRƯỜNG ĐẠI HỌC VINH ĐỘC LẬP - TỰ DO - HẠNH PHÚC BẢN NHẬN XÉT ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP Họ tên sinh viên: Nguyễn Thị Hồng Số hiệu sinh viên: Khóa: Ngành: Công nghệ thực phẩm 50 0952040425 Cán hướng dẫn: ThS Đào Thị Thanh Xuân Cán duyệt: PGS.TS Trần Đình Thắng Nội dung nghiên cứu, thiết kế: - Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ, pH đến khả sinh tổng hợp chitinase - Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng môi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase Nhận xét cán duyệt: ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ……………………………………………………………………………………… Ngày tháng năm 2014 Cán duyệt (Ký, ghi rõ họ, tên) LỜI CẢM ƠN Đồ án thực phịng thí nghiệm, Trung tâm Kiểm định An tồn Thực phẩm Mơi trường, Trường Đại học Vinh Với lịng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới ThS Đào Thị Thanh Xuân - Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh giao đề tài tận tình hướng dẫn em thời gian nghiên cứu hoàn thành đồ án Em xin gửi lời cảm ơn đến cán bộ, giảng viên khoa Nông - Lâm - Ngư, Trường Đại học Vinh cung cấp cho em chủng Trichoderma (095TH) Em xin chân thành cảm ơn ThS Ngơ Thị Thủy Hà – Khoa Hóa, Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em hoàn thành đồ án Nhân dịp em xin gửi lời cảm ơn đến quý thầy cơ, cán khoa Hóa, cán hướng dẫn thí nghiệm phịng Hóa thực phẩm, phịng Vi sinh Trung tâm thực hành thí nghiệm – Trường Đại học Vinh tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ em kiến thức đóng góp ý kiến để em hoàn thành đồ án Cuối em xin tỏ lịng biết ơn tới gia đình bạn bè động viên, giúp đỡ em suốt trình học tập làm đồ án Đây nguồn động viên vững giúp em vượt qua khó khăn để hồn thành tốt đồ án Do hạn chế trình độ chun mơn kinh nghiệm, nên đồ án cịn nhiều thiếu sót, mong giúp đỡ góp ý thầy, cô bạn Em xin chân thành cảm ơn ! Vinh, tháng 01 năm 2014 Sinh viên Nguyễn Thị Hồng i MỤC LỤC Trang LỜI CẢM ƠN i DANH MỤC CÁC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH VẼ v LỜI MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục tiêu đề tài Nhiệm vụ nghiên cứu CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu nấm sợi Trichoderma 1.1.1 Phân loại đặc điểm hình thái Trichoderma 1.1.2 Dinh dưỡng đường trao đổi chất Trichoderma 1.2 Khái quát enzyme chitinase 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phân loại 1.2.3 Tính chất enzyme chitinase 1.2.4 Cơ chế tác dụng hệ enzyme chitinase 11 1.2.5 Các nguồn thu nhận enzyme chitinase 12 1.2.6 Các phương pháp tinh chế enzyme 14 1.3 Các loại chất enzyme chitinase 16 1.3.1 Chitin 16 1.3.2 Các dẫn xuất chitin 20 1.4 Ứng dụng enzyme chitinase nông nghiệp y dược 21 1.4.1 Ứng dụng enzyme chitinase nông nghiệp 21 1.4.2 Ứng dụng y học 22 1.5 Tình hình nghiên cứu thu nhận chitinase từ Trichoderma 24 1.5.1 Thế giới 24 1.5.2 Việt Nam 25 CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 26 2.1 Vật liệu, hóa chất môi trường 26 2.1.1 Vật liệu 26 2.1.2 Hóa chất thiết bị 26 ii 2.1.3 Các môi trường nuôi cấy 27 2.2 Phương pháp nghiên cứu 27 2.2.1 Kỹ thuật cấy chuyền giữ giống 27 2.2.2 Phương pháp nuôi cấy Trichoderma môi trường lỏng cho STH chitinase 27 2.2.3 Xác định hoạt độ enzyme chitinase (phương pháp Elson – Morgan) 28 2.2.4 Xây dựng đường chuẩn glucosamine 30 2.2.5 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố vật lý đến sinh tổng hợp chitinase 31 2.2.6 Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng đến trình sinh tổng hợp chitinase 32 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Nghiên cứu thu nhận enzyme chitinase từ chủng Trichoderma môi trường lỏng 35 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố vật lý đến trình sinh tổng hợp chitinase 35 3.2.1 Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian đến trình sinh tổng hợp chitinase 35 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp chitinase 36 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp chitinase 38 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase 39 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến trình sinh tổng hợp chitinase 39 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ đến trình sinh tổng hợp chitinase 40 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng photpho đến trình sinh tổng hợp chitinase 42 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ion kim loại đến trình sinh tổng hợp chitinase 43 3.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chất bề mặt nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase 44 KẾT LUẬN 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO 47 iii DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Hình 1.1: Sự phát triển nấm Trichoderma đĩa thạch (a) hình dạng sợi nấm Trichoderma (b) Hình 1.2: Cấu trúc bậc enzyme chitinase Hình 1.3: Sơ đồ phân cắt chitin enzyme thuộc nhóm chitinase Hình 1.4: Mơ hình cấu trúc khơng gian chitinase Serratia marcescens Hình 1.5: Mơ hình cấu trúc không gian chitinase Hodeum vulgare Hình 1.6: Mơ tả trình tự amoni axit Hình 1.7: Cấu trúc hóa học allosamidin dẫn xuất allosamidin 11 Hình 1.8: Cơ chế hoạt động hệ enzyme chitinase Trichoderma 12 Hình 1.9: Chitin vỏ tơm 17 Hình 1.10: 1) chitin; 3) cellulose 18 Hình 1.11: Cấu trúc mạch chitin 19 Hình 1.12: Cấu trúc bậc chitosan 20 Hình 2.1: Chitin huyền phù 1% 28 Hình 2.2: Màu đỏ glucosamine theo nồng độ sau bỏ thuốc thử Erlich I 30 Hình 3.1: Đường chuẩn glucosamine nồng độ 300 - 500 (µg/ml) 35 Hình 3.2: Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính chitinase thô chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 36 Hình 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ mơi trường ni cấy lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 37 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 38 Hình 3.5: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 40 Hình 3.6: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 41 Hình 3.7: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng photpho lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 42 Hình 3.8: Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 43 Hình 3.9: Ảnh hưởng chất bề mặt ni cấy lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 44 iv DANH MỤC HÌNH VẼ Trang Bảng 2.1: Cách pha nồng độ glucosamin 300 - 500µg/ml 30 Bảng 3.1: Hoạt tính chitinase theo thời gian nuôi cấy môi trường lỏng 36 Bảng 3.2: Hoạt tính chitinase theo nhiệt độ nuôi cấy môi trường lỏng 37 Bảng 3.3: Hoạt tính chitinase theo pH ni cấy mơi trường lỏng 38 Bảng 3.4: Hoạt tính chitinase theo nguồn dinh dưỡng cacbon môi trường lỏng 39 Bảng 3.5: Hoạt tính chitinase theo dinh dưỡng nguồn nitơ môi trường lỏng 41 Bảng 3.6: Hoạt tính chitinase theo nguồn dinh dưỡng photpho môi trường lỏng 42 Bảng 3.7: Hoạt tính chitinase theo ion kim loại môi trường lỏng 43 Bảng 3.8: Hoạt tính chitinase theo chất bề mặt ni cấy môi trường lỏng 44 v LỜI MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Enzyme chất xúc tác sinh học có chất protein, có cấu trúc phân tử phức tạp tinh vi, hoạt lực xúc tác cao nhiều so với chất xúc tác thông thường, có tính đặc hiệu cao… Chitinase nhóm enzyme quan trọng enzyme cơng nghiệp, chứa đơn phân N-acetyl-glucosamine, liên kết với liên kết 1,4-β-glucoside Chitinase thuộc nhóm enzyme thủy phân, phân cắt chitin thành sản phẩm khác oligosaccharide, N-acetyl-glucosamine Là enzyme ứng dụng nhiều ngành nông nghiệp y dược kiểm sốt nấm gây bệnh trùng thực vật, tổng hợp chitooligosaccharide Chitinase thu nhận từ nhiều nguồn khác động vật, thực vật, nấm, vi khuẩn … Tuy nhiên, năm gần việc gia tăng sử dụng vi sinh vật nguồn cung cấp chitinase sử dụng nhiều, sản phẩm tạo nhiều rút ngắn thời gian thu nhận hơn, giá thành chế phẩm thu cịn cao, sử dụng enzyme sản xuất hạn chế Những nguồn sinh vật để thu nhận chitinase đáng kể chủng vi khuẩn thuộc chi Enterobacter Streptomces, chủng nấm sợi thuộc chi Asperillus, Penicillium Trichoderma số động vật nguyên sinh Vì ứng dụng rộng rãi chitinase, mục đích tơi nhằm nghiên cứu khả sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma mơi trường điều kiện cho hoạt tính cao Vì vậy, tơi lựa chọn đề tài: “Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hóa lý thành phần dinh dưỡng tới trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma” Mục tiêu đề tài Nghiên cứu để tìm mơi trường ni cấy thích hợp cho q trình sinh tổng hợp chitinase Thu nhận enzyme chitinase từ canh trường Nhiệm vụ nghiên cứu Trong đồ án chúng tơi có nhiệm vụ: - Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH - Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian, nhiệt độ, pH đến khả sinh tổng hợp chitinase - Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase vịng/phút mơi trường lỏng nhiệt độ từ 25 – 30oC Sau đó, lấy mẫu thời điểm 3, 4, 5, 6, ngày để xác định hoạt độ theo phương pháp Elson - Morgan Kết thu sau : Bảng 3.1: Hoạt tính chitinase theo thời gian nuôi cấy môi trường lỏng Thời gian (ngày) Mật độ quang (OD) 0,470 0,659 0,755 0,571 0,388 0,143 0,221 0,260 0,185 0,109 Hoạt độ chitinase (µmol/ml/phút) 0.3 Hoạt độ chitinase 0.25 0.2 0.15 Hoạt độ 0.1 0.05 Thời gian (ngày) Hình 3.2: Ảnh hưởng thời gian ni cấy lên hoạt tính chitinase thô chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ biểu đồ ta có nhận xét : Kết nghiên cứu cho thấy enzyme chitinase thu ngày nuôi cấy thứ có hoạt tính cao đạt 0,260(U/ml) Vậy, thời gian ni cấy thích hợp cho q trình sinh tổng hợp chitinase chủng nấm Trichoderma 095(2)TH ngày Tuy nhiên, theo nghiên cứu chủng nấm Aspergillus tereus thời gian ni cấy để thu hoạt độ chitinase cao khoảng thời gian ngày [27] Nhưng với chủng Aspergillus protuberus thu hoạt tính chitinase cao ni khoảng thời gian ngắn ngày [1] 3.2.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến trình sinh tổng hợp chitinase Mỗi enzyme thu từ loài, chủng khác có dải nhiệt độ hoạt động khác Để nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt lên trình sinh tổng hợp enzyme chitinase chúng tơi thực ni lắc chủng Trichoderma 095(2)TH 36 môi trường chọn lọc tốc độ lắc 180 vòng/phút nhiệt độ khác nhau: 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50 Sau tiến hành xác định hoạt độ sau ngày ni cấy Từ thực nghiệm ta có kết sau: Bảng 3.2: Hoạt tính chitinase theo nhiệt độ ni cấy môi trường lỏng 20oC Nhiệt độ Mật độ quang (OD) Hoạt tính enzyme UI (µmol/ml/phút) 25oC 35oC 30oC 40oC 45oC 50oC 0,551 0,699 0,764 0,655 0,571 0,449 0,373 0,176 0,237 0,264 0,219 0,185 0,134 0,103 0.3 Hoạt độ chitinase 0.25 0.2 Hoạt độ 0.15 0.1 0.05 0 10 20 30 Nhiệt độ (oC) 40 50 60 Hình 3.3: Ảnh hưởng nhiệt độ môi trường nuôi cấy lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ kết cho thấy: - Hoạt tính enzyme chitinase tăng dần từ 20 – 30oC, giảm dần từ 35 – 50oC - Nhiệt độ thích hợp để sinh tổng hợp enzyme chitinase từ chủng Trichoderma 095(2)TH tốt 30oC, hoạt tính đạt 0,264 (U/ml) Trong đó, chủng khác lại thể khả chịu nhiệt cho hoạt tính enzyme cao ni nhiệt độ cao Chủng nấm Aspergillus fumigatus cho thấy nhiệt độ tối ưu để nấm sinh chitinase hoạt độ cao (0,118U/ml) 55oC Chitinase thu nhận từ Aspergillus sp nhiệt độ thích hợp 45oC, hoạt độ chitinase cao đạt 3,1(U/ml) [1] Chủng nấm sợi khác Aspergillus carneus hoạt động thích hợp nhiệt độ 40oC [39] Penicillium aculeatum 50oC [37] 37 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp chitinase Sự thay đổi pH làm cho hoạt tính enzyme thay đổi Hoạt tính enzyme tăng hay giảm ni cấy lồi, chủng mơi trường axit hay mơi trường kiềm Để xác định pH thích hợp cho chủng nấm Trichoderma 095(2)TH Chúng tiến hành nuôi chủng Trichoderma 095(2)TH môi trường chọn lọc với pH khác từ - (điều chỉnh pH HCl, NaOH), nhiệt độ 30oC tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ Tiến hành xác định hoạt độ enzyme kết thu sau: Bảng 3.3: Hoạt tính chitinase theo pH ni cấy mơi trường lỏng pH 3,0 4,0 5,0 6,0 7,0 8,0 Mật độ quang (OD) 0,482 0,690 0,770 0,653 0,549 0,495 0,148 0,233 0,266 0,218 0,175 0,153 Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 0.3 Hoạt độ chitinase 0.25 0.2 Hoạt độ 0.15 0.1 0.05 0 pH 10 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ biểu đồ ta rút kết luận: pH có ảnh hưởng lớn đến khả sinh tổng hợp chitinase Từ kết nghiên cứu cho thấy chủng Trichoderma 095(2)TH có khả sinh tổng hợp chitinase mơi trường có pH từ - 8, pH = thích hợp cho trình sinh tổng hợp chitinase Kết phù hợp với nghiên cứu chủng Aspergillus protuberus đạt hoạt tính chitinase cao mơi trường có pH = [3] Tuy nhiên, chủng 38 Aspergillus protuberus sinh enzyme chitinase có hoạt tính cao đạt 1,693U/ml pH = 5,5 [1] chủng Aspergillus awamori cho hoạt tính cao pH tối ưu 4,0 [3] Nhận xét: Từ nghiên cứu thấy rằng, chủng nấm Trichoderma 095(2)TH cho hoạt tính chitinase cao nuôi môi trường lỏng điều kiện: Nuôi tủ lắc ổn nhiệt với tốc độ 180 vòng/phút, nhiệt độ 30oC pH = ngày 3.3 Nghiên cứu ảnh hƣởng thành phần dinh dƣỡng mơi trƣờng ni cấy đến q trình sinh tổng hợp chitinase Hoạt tính enzyme chitinase tạo khơng phụ thuộc vào điều kiện môi trường mà cịn phụ thuộc vào thành phần dinh dưỡng ni cấy Vì vậy, lựa chọn nguồn dinh dưỡng thích hợp cho môi trường nuôi cấy cần thiết cho trình sinh tổng hợp chitinase 3.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon đến trình sinh tổng hợp chitinase Nguồn dinh dưỡng cacbon thành phần có vai trị quan trọng q trình kích thích phát triển chủng nấm Trichoderma.Vì vậy, để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon lên hoạt độ chitinase Chúng tiến hành nuôi chủng Trichoderma 095(2)TH mơi trường lỏng sử dụng nguồn cacbon chitin môi trường lỏng bổ sung thêm nguồn cacbon loại đường đơn như: D-glucose, D-mantose, D-lactose…(với nồng độ 2,5g/l) với pH = 5, cho ni cấy tủ lắc với tốc độ 180 vịng/phút nhiệt độ 30oC tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ Kết thu sau: Bảng 3.4: Hoạt tính chitinase theo nguồn dinh dưỡng cacbon môi trường lỏng Chitin + Chitin + Chitin + Lactose Mantose Glucose 0,767 0,765 0,766 0,767 0,265 0,264 0,265 0,265 Nguồn cacbon Chitin Mật độ quang (OD) Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 39 0.3 Hoạt độ chitinase 0.25 0.2 0.15 Hoạt độ 0.1 0.05 Chitin Chitin + Lactose Chitin + Mantose Chitin + Glucose Hình 3.5: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng cacbon lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ biểu đồ ta rút kết luận: Việc bổ sung thêm nguồn cacbon loại đường vào môi trường nuôi cấy không làm tăng hoạt tính chitinase Từ nghiên cứu ta thấy, bổ sung thêm loại đường vào môi trường nuôi cấy không cần thiết chitin nguồn cacbon tốt chất kích thích cho q trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma 095(2)TH Hầu hết, nghiên cứu cho thấy chủng nấm sợi sử dụng nguồn cacbon chitin làm chất kích thích tốt cho phát triển tổng hợp nên chitinase có hoạt tính cao Chẳng hạn, chủng nấm Aspergillus protuberu, Aspergillus awamori, Paenibacillus sp D1 [1, 3] 3.3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ đến trình sinh tổng hợp chitinase Nguồn dinh dưỡng nitơ đóng vai trị quan trọng q trình sinh tổng hợp chitinase Vì vậy, để nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ lên hoạt độ enzyme chitinase Chúng tiến hành nuôi chủng Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng cách thay peptone môi trường nguồn nitơ hữu là: cao thịt, cao nấm men thay (NH4)2SO4 nguồn nitơ vô là: NH4NO3 (với trọng lượng tương đương)… pH=5, nhiệt độ 30oC tiến hành lấy mẫu ngày nuôi thứ đem xác định hoạt độ 40 Kết thu sau: Bảng 3.5: Hoạt tính chitinase theo dinh dưỡng nguồn nitơ môi trường lỏng Nguồn nitơ MT thay MT thay MT thay NH4NO3 cao thịt 0,706 0,897 0,764 0,767 0,240 0,318 0,264 0,265 Mật độ quang (OD) Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) cao MT nấm men 0.35 Hoạt độ chitinase 0.3 0.25 0.2 Hoạt độ 0.15 0.1 0.05 NH4NO3 cao nấm men cao thịt MT Hình 3.6: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng nitơ lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH Từ biểu đồ ta rút kết luận: Từ kết nghiên cứu cho thấy môi trường thay nguồn nitơ thu hoạt tính chitinase cao từ cao thịt đạt 0,318(U/ml) Trong đó, nguồn nitơ từ NH4NO3 lại cho hoạt độ enzyme thấp Chứng tỏ rằng, việc sử dụng nguồn nitơ hữu tốt nguồn nitơ vơ q trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma 095(2)TH cao thịt nguồn nitơ thích hợp Trong đó, nghiên cứu nguồn nitơ hữu từ ure, peptone, cao nấm men làm tăng đáng kể hoạt tính chitinase từ pantoea dispersa [28] Sử dụng nguồn nitơ từ cao nấm men làm tăng hoạt tính chitinase từ Paenibacillus sabina JD [40] 41 3.3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng photpho đến trình sinh tổng hợp chitinase Trong trình sinh tổng hợp chitinase nguồn dinh dưỡng photpho đóng vai trò lớn đến phát triển tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma Vì vậy, chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng photpho lên hoạt độ enzyme chitinase Chủng Trichoderma 095(2)TH nuôi môi trường lỏng thay KH2PO4 nguồn photpho khác là: Na2HPO4, K2HPO4 (với trọng lượng tương đương)… pH=5 nhiệt độ 30oC tiến hành lọc dịch ngày nuôi thứ Đưa dịch enzyme xác định hoạt độ kết thu sau: Bảng 3.6: Hoạt tính chitinase theo nguồn dinh dưỡng photpho môi trường lỏng Nguồn photpho MT thay MT thay MT Na2HPO4 K2HPO4 KH2PO4 0,765 0,766 0,768 0,264 0,265 0,265 Mật độ quang (OD) Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 0.3 Hoạt độ chitinase 0.25 0.2 Hoạt độ 0.15 0.1 0.05 Na2HPO4 K2HPO4 KH2PO4 Hình 3.7: Ảnh hưởng nguồn dinh dưỡng photpho lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 42 Từ biểu đồ ta rút kết luận: Từ kết nghiên cứu cho thấy việc thay nguồn photpho khác môi trường nuôi cấy không làm tăng hoạt tính chitinase từ Trichoderma 095(2)TH so với nguồn Trong khi, chủng nấm Paenibacillus sp D1 sử dụng nguồn photpho từ K2HPO4 để sinh chitinase có hoạt tính cao Nhưng việc bổ sung thêm nguồn photpho hữu như: phytate làm giảm mạnh sinh tổng hợp chitinase [40] 3.3.4 Nghiên cứu ảnh hưởng ion kim loại đến trình sinh tổng hợp chitinase Các nguồn ion kim loại bổ sung vào môi trường nuôi cấy làm tăng, giảm khơng làm ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp chitinase Chúng tơi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng ion Cu2+ Na+ chủng Trichoderma 095(2)TH Chủng Trichoderma 095(2)TH nuôi môi trường lỏng cách bổ sung vào môi trường chọn lọc ion kim loại khác là: CuSO4, Na2CO3 (với nồng độ 5mM)…ở pH=5 nhiệt độ 30oC, tiến hành lọc dịch sau ngày nuôi cấy Đưa xác định hoạt độ enzyme kết thu sau: Bảng 3.7: Hoạt tính chitinase theo ion kim loại môi trường lỏng MT bổ sung MT bổ sung CuSO4 Na2CO3 Mật độ quang (OD) 0,748 0,743 0,766 Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 0,257 0,255 0,265 Nguồn ion kim loại MT 0.266 0.264 Hoạt độ chitinase 0.262 0.26 Hoạt độ 0.258 0.256 0.254 0.252 0.25 CuSO4 Na2CO3 MT Hình 3.8: Ảnh hưởng ion kim loại lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 43 Từ kết nghiên cứu cho thấy môi trường bổ sung thêm ion kim loại: CuSO4, Na2CO3 làm giảm hoạt tính chitinase từ Trichoderma 095(2)TH so với mơi trường Khác với chủng Trichoderma số nghiên cứu cho thấy có hiệu sử dụng nguồn iôn kim loại môi trường nuôi cấy như: Pantoea dipersa sử dụng CaCl2 để tăng cường hoạt tính chitinase [28] Trong khi, pyrococcu furiosus lại có hiệu sử dụng FeCl2 để làm tăng hoạt tính chitinase [40] 3.3.5 Nghiên cứu ảnh hưởng chất bề mặt nuôi cấy đến sinh tổng hợp chitinase Chất bề mặt bổ sung vào môi trường ngăn cản khếch tán khơng khí từ ngồi vào mơi trường ni cấy Vì vậy, chúng hạn chế sinh trưởng phát triển chủng nấm sợi, làm giảm khả sản sinh enzyme chitinase Chúng tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng chất bề mặt chủng nấm Trichoderma 095(2)TH cách bổ sung thêm vào môi trường nuôi cấy với nồng độ 0,1% chất bề mặt: tween 80, natrilaurisunfat… Kết thu sau: Bảng 3.8: Hoạt tính chitinase theo chất bề mặt nuôi cấy môi trường lỏng Chất bề mặt MT bổ sung Tween 80 MT bổ sung Natrilaurisunfat MT Mật độ quang (OD) 0,743 0,731 0,767 Hoạt tính chitinase UI (µmol/ml/phút) 0,255 0,250 0,265 0.27 Hoạt độ chitinase 0.265 0.26 Hoạt độ 0.255 0.25 0.245 0.24 Tween 80 Natrilaurisunfat MTcơ Hình 3.9: Ảnh hưởng chất bề mặt ni cấy lên hoạt tính chitinase chiết tách từ nấm Trichoderma 095(2)TH 44 Từ kết nghiên cứu cho thấy có mặt chất bề mặt: natrilaurisunfat, tween 80 môi trường nuôi cấy làm giảm đáng kể hoạt tính chitinase so với mơi trường nuôi cấy Chứng tỏ, chủng nấm Trichoderma chủng có khả phát triển mạnh điều kiện hiếu khí Một vài nghiên cứu khác cho thấy chất bề mặt như: tween 80,triton X 100 coi chất bổ sung vào mơi trường ni cấy có tác động tốt lên hoạt tính chitinase số chủng nấm: Alcaligenes xylosoxydans sử dụng tween 80 để tăng hoạt tính chitinas triton X 100 làm chất bề mặt tốt cho sinh tổng hợp chitinase từ Aeromonas sp [40] Trong chất bề mặt như: CTAB, SDS dicotyl sulfosuccinate lại làm giảm hoạt tính chitinase từ Paenibacillus sp D1 [40] Nhận xét: Qua kết nghiên cứu nhận thấy thành phần dinh dưỡng thiết yếu môi trường nuôi cấy chủng nấm Trichoderma 095(2)TH có ảnh hưởng lớn đến q trình sinh tổng hợp chitinase 45 KẾT LUẬN Đề tài đạt số kết sau :  Nghiên cứu số yếu tố vật lý ảnh hưởng tới trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng : - Thời gian nuôi cấy : ngày - Nhiệt độ nuôi cấy : 30 0C - pH nuôi cấy : pH =  Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng đến trình sinh tổng hợp chitinase từ nấm Trichoderma 095(2)TH môi trường lỏng : - Chitin 1% chất kích thích nguồn cacbon chủ yếu cho trình sinh tổng hợp chitinase - Nguồn nitơ thích hợp cho q trình sinh tổng hợp chitinase cao thịt - Thay nguồn photpho: K2HPO4, Na2HPO4 khơng làm ảnh hưởng đến q trình sinh tổng hợp chitinase - Bổ sung ion kim loại: CuSO4, Na2CO3 làm giảm khả sinh tổng hợp chitinase - Bổ sung chất bề mặt: tween 80, natrilaurisunfat làm giảm trình sinh tổng hợp chitinase 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt: Nguyễn Thị Hà (2012), Tối ưu hóa điều kiện ni cấy chủng Aspergillus protuberus sinh tổng hợp enzym chitinase phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Tạp chí khoa học 2012:22b 26-35, Đại học Cần Thơ, Tr 29-34 Đinh Minh Hiệp cộng (2005), Nghiên cứu hoạt tính đối kháng vi nấmTrichoderma loài nấm gây bệnh trồng thử nghiệm ứng dụng, Đề tài cấp thành phố - Sở KH&CN TP Hồ Chí Minh Lê Thị Huệ (2010), Khảo sát khả sinh tổng hợp enzyme chitinase số chủng nấm thuộc giống Aspergillus, Trichoderma ứng dụng, Luận văn Thạc sĩ Trường Đại Học Sư Phạm TP Hồ Chí Minh, Tr 37-45 Tô Duy Khương (2004), Khảo sát sinh tổng hợp chitinase Trichoderma spp khả đối kháng với số nấm gây bệnh thực vật, Luận văn Thạc sĩ Sinh học, Trường Đại học Khoa học tự nhiên TP Hồ Chí Minh Phạm Thị Lịch, Trần Thanh Thủy (2013), Nghiên cứu điều kiện nuôi cấy để thu nhận chế phẩm enzyme chitinase thô từ chủng Trichoderma sp, Tạp chí khoa học, Đại học sư phạm TP Hồ Chí Minh, Số 51/2013, Tr 117-128 Huỳnh Bá Lĩnh, Glucosamine, thuốc điều trị bệnh viêm khớp, Bệnh Viện Việt Đức Hà Nội, Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa : vietduchospital.edu.vn Trần Kim Long, Lê Đình Đơn, Tạ Thành Nam, Ngơ Thị Xuân Thịnh, Nguyễn Thị Tiến Sỹ, Trần Thị Xê (2009), Phòng trừ bệnh nấm Phytophthora hồ tiêu chế phẩm sinh học Trichoderma (Trico-VTN) Tây Nguyên, Tạp chí chuyên ngành bảo vệ thực vật, Số 2, Tr 22-27 Đặng Văn Luyến (1995), Chitin/Chitosan, Các giảng báo cáo chuyên đề, tập 2, tr 27-35 Trần Thị Luyến, Huỳnh Nguyễn Duy Bảo số cộng sự, Hồn thiện quy trình sản xuất Chitin-Chitosan chế biến số sản phẩm công nghiệp từ phế liệu vỏ tôm, cua, Báo cáo khoa học, Đề tài cấp bộ, Nha Trang, 2000 10 Nguyễn Đức Lượng, Công nghệ enzyme, Công nghệ vi sinh tập 1, 2, 3, NXB Đại học quốc gia TP Hồ Chí Minh 11 Nguyễn Đình Nga, Đinh Minh Hiệp, Trần Cát Đơng, Nguyễn Văn Thanh (2008) Tác dụng kháng Candida albicans chitinase Tạp chí Dược học, số 384, trang 19-22 47 12 Nguyễn Vĩnh Ngọc, Thuốc điều trị thối hóa khớp, Khoa xương khớp Bệnh Viện Bạch Mai Hà Nội, Tạp chí Sức khỏe & đời sống ngày 30/5/2006, số 964 13 Vũ Công Phong (Sưu tầm biên soạn), Những đặc điểm Chitin, Chitosan dẫn xuất, Tài liệu truy cập mạng internet, theo địa chỉ: http://www.hoahocvietnam.com/Home/Moi-tuan-mot-hoa-chat/Nhung-dac-diemcua-Chitin-Chitosan-va-dan-3.html 14 Nguyễn Ngọc Phúc (2005), Bước đầu khảo sát mối liên hệ diện Trichoderma yếu tố đất, Khóa luận tốt nghiệp, Trường đại học NơngLâm TP Hồ Chí Minh 15 Nguyễn Thị Thuần, Lê Minh Thi, Dương Thị Hồng (1996), Kết nghiên cứu bước đầu nấm đối kháng Trichoderma, Tuyển tập cơng trình nghiên cứu bảo vệ thực vật 1990-1995, NXB Hà Nội Tài liệu nƣớc ngoài: 16 Ainsworth G S and Sussman A S (1968), The fungi, an advance treatise, Vol III, The fungal population, Acad press Inc, New York, USA 17 Barnett H L and Hunter B B (1972), Illustrated genera of imperfect fungi, 3rd edition, Burgess Publishing Co., 273 pp 18 Bhushan, Bharat and Hoondal, Gurinder Singh, Isolation, purification and properties of a thermostable chitinase from Bacillus sp BG-11, Biotechnology Letters, February 1998, vol 20, no 2, pp 157-159 19 Carroad P A., Tom R A., Bio conversion of shellfish chitin wastes: Process conception and selection of microorganisms, J Food Sci 43 (1978), 1158–1161 20 Chet I., Harman G E., and Baker R (1981), Trichoderma hamatum; Its hypha interactions with Rhizoctonia solani & Pythium spp, Microb Ecol 7, pp 28 - 29 21 Cosio L G., Fisher R A., Carroad P A., Bio conversion of shell fish chitin waste: Waste pretreatment, enzyme production, process design, and economic analysis, J Food Sci 47 (1982), pp 901–905 22 Crispinus A, Omumasaba, Naoto Yoshida, and Kihachiro Ogawa (2001), Purification and characterization of a chitinase from Trichoderma viride, The Journal of Genaral anh Applied Microbiology Vol 47, No 2, pp 53-61 23 Dahiya, Neetu, Tewari, Rupinder, Tiwari, Ram Prakash and Hoondal, Gurinder Singh, Chitinase production in solid state fermentation by Enterobacter sp NRG4 using statistical experimental design, Current Microbiology, 2005, In the press 48 24 Elad & Chet Y I., Boyle P and Hennis Y (1983), Parasitism of Trichoderma spp On Rhizoctonia solani & Sclerotium rolfsii scaning electron microscopy and fluorescence microscopy, Phytopathology 73: pp 85 - 88 25 Esposito E and Silva M D 1998, Systematics and enviromental application of the genus Trichoderma, crical reviews in Microbiology 24 (2): pp 89 - 98 26 Felse P A., Panda T, Production of microbial chitinases, A revisit, Bioprocess Eng 23 (2000), pp 127–134 27 Ghanem K M., Al-Garni S M., & Al-Makishah N H (2010), Statistical optimization of cultural conditions for chitinase production from fish scales waste by Aspergillus terreus, African Journal of Biotechnology, 9(32), pp 5135-5146 28 Gohel V., Megha C., Vyas P., Chhatpar H S (2004), Strain improvement of chitinolytic enzyme producing isolate pan – toea dispersa for enhancing its biocontrol potential against fungal plant pathogen, Ann Microbiol, 54(4): 503-515 29 Gray W P (1997), Chitinase – material and method, Patent WO97/47752 30 Harman E G, Kubicek P Christian (1998), Trichoderma & Gliocladium, Vol 2, pp 73 – 123 31 Hutchinson S A., and Cowan M E (1972), Identification and biological effects of volatile metabolites from cultures of Trichoderma harzinum, Trans.Br Mycol Soc 59: pp 71-77 32 Jeuniaux Charles (1963), Chitinase – Methods of Enzymology, Vol 4, pp 644- 650 33 Jeuniaux C, Braconnot H (1971), Structure of chitin and chitosan, Ann, Chitin, paris, pp – 49 – 1811 34 Jolles P, Muzzaralli A R (1999), Chitin and chitinase, Birkhauser verlag, Basel, Switzerland, pp 125 – 133 35 Joshi S., Kozlowski M., Richens S., and Comberbach D M (1989), Chitinase and chitobiase production during fermentation of genetically improved Serratia liquefaciens, Enzyme Microb Technol, 11: 289-296 36 Kapat A., Panda T, Rakshit S K (1996), Parameters optimization of chitin hydrolysis by Trichoderma harzianum chitinase under assay conditions, Bioprocess Engineering 14, pp 275-279 49 37 Parameswaran Binod, Tunde Pusztahelyi, Viviana Nagy, Chandran Sandhya, George Szakacs, Istvan Pocsi, Ashok Pandey (2005), Production and purification of extracellular chitinases from Penicilium aculeatum NRRL 21 under solid-state fermentation, Ezyme and Microbial Technology 36, pp 880-887 38 Patil R S., Ghormade V (2000), Chitinolytic enzymes: an exploration, Enzyme and Microbial Technology 26 (2000), pp 473 – 483 39 Sherief A A, El-Sawah M M A., Abd El-Naby M A (1991), Some properties of chitinase produced by a potent Aspergillus carneus strain, Applied Microbial Biotechnol 35: pp 228–300 40 Singha A K., Optimization of culture conditions for thermostable chitinase production by Paenibacillus sp D1, African Journal of Microbiology Research Vol 4(21), pp 2291-2298, November, 2010 41 Takahashi, Mamoru, Tsukiyama, Tadashi and Suzuki, Tomoo, Purification and some properties of chitinase produced by Vibrio sp, Journal of Fermentation and Bio engineering, (1993), vol 75, no 6, pp 457-559 42 Ulhoa C J and Peberdy J F (1992), Purification and some properties of the extracellular chitinase produced by Trichoderma harzianum, Enzyme Microb Technol, vol 14, pp 236-240 43 Villagomez-Castro J C, Lopez-Rmero E (1996), Indentification and partial characterization of three chitinase forms in Entamoebainvadens with emphasis on their inhibiton by allosamidin, Antonie Van leeuwenhoek 70:41-48 44 Vyas P R and Deshpande M V, Enzymatic hydrolysis of chitin by chitinase complex and its utilization to produce SCP, Journal of General and Applied Microbiology, (1991), vol 37, no 3, pp 267-275 50 ... tài:? ?Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hóa lý thành phần dinh dưỡng tới trình sinh tổng hợp Chitinase từ Trichoderma? ?? Nội dung nghiên cứu, thiết kế tốt nghiệp: - Thu nhận enzyme chitinase từ nấm Trichoderma. .. tài: ? ?Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố hóa lý thành phần dinh dưỡng tới trình sinh tổng hợp chitinase từ Trichoderma? ?? Mục tiêu đề tài Nghiên cứu để tìm mơi trường ni cấy thích hợp cho trình sinh tổng. .. trình sinh tổng hợp chitinase 36 3.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng pH đến trình sinh tổng hợp chitinase 38 3.3 Nghiên cứu ảnh hưởng thành phần dinh dưỡng mơi trường ni cấy đến q trình sinh tổng hợp