Nghiên cứu khoa học " TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CẢM ỨNG CHO CÂY KEO LAI BẰNG SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH " doc

Nghiên cứu khoa học TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CẢM ỨNG CHO CÂY KEO LAI BẰNG SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CẢM ỨNG CHO CÂY KEO LAI BẰNG SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH Vũ Văn Định Trường Trung học Kinh tế - Kỹ thuật tỉnh Lào Cai TÓM TẮT Vi sinh vật nội sinh là những vi sinh vật sống trong mô tế bào của cây chủ, không gây bệnh cho cây và thiết lập mối quan hệ hai bên cùng có lợi. Các vi sinh vật nội sinh này thúc đẩy quá trình sinh trưởng của cây chủ vì đã tạo ra một hàng rào kiểm soát sinh học bằng việc tiêu diệt trực tiếp các mầm bệnh đã xâm nhiễm vào cây chủ. Cây chủ không bị bệnh hoặc bị bệnh ở mức độ nhẹ đến trung bình phân lập được vi khuẩn nội sinh kháng nấm gây bệnh trong khi đó cây bị bệnh ở mức độ nặng, rất nặng hoàn toàn không có vi khuẩn nội sinh kháng nấm gây bệnh và sự khác biệt này còn thể hiện về mật độ tế bào hữu hiệu của vi khuẩn trên các cây chủ có mức độ bị bệnh khác nhau. Cây khoẻ (không bị bệnh) có mật độ vi khuẩn cao hơn cây bị bệnh. Chủng vi khuẩn B03 có hiệu lực cao, nhiễm cho cây Keo lai ở giai đoạn 2 tháng tuổi với liều lượng 15ml/cây, mật độ là 1x10 5 CFU/ml, cây con có khả năng kháng bệnh đối với nấm Colletotrichum gloeosporioides gây hại và sinh trưởng nhanh hơn so với đối chứng. Từ khóa: Kháng bệnh cảm ứng, Keo lai, Vi sinh vật nội sinh MỞ ĐẦU Các loài keo sinh trưởng nhanh, chu kỳ kinh doanh ngắn có thể dùng làm gỗ củi, làm giấy, làm đồ xây dựng, đồ gỗ và đồ mỹ nghệ. Ngoài ra, keo là loài cây có khả năng tổng hợp nitơ tự do trong khí quyển rất cao (Chanway, 1996). Các loài keo có khả năng thích ứng với điều kiện khí hậu đất đai ở nước ta từ vùng cát ven biển tương đối khô hạn đến vùng núi thấp dưới 400m. Theo thống kê đến tháng 12 năm 2006, diện tích rừng trồng cả nước ta là 2.463.709ha, trong đó diện tích rừng trồng các loài keo chiếm tỷ lệ lớn. Trước sự gia tăng nhanh về mặt diện tích, các rừng trồng keo đã xuất hiện nhiều bệnh gây khó khăn không nhỏ cho một số địa phương trong cả nước. Năm 2007 có khoảng 900ha rừng Keo lai 2 tuổi bị nhiễm bệnh loét thân, thối vỏ và dẫn đến khô ngọn, với tỷ lệ bị bệnh khác nhau ở các địa phương. Tỷ lệ bị bệnh nặng nhất ở Lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ và Lâm trường Hàm Yên tỉnh Tuyên Quang lên đến 85% cây bị chết ngọn. Nguyên nhân gây bệnh được xác định là nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc, với triệu chứng đốm lá, khô cành ngọn đã ảnh hưởng rất lớn đến sinh trưởng và năng suất của rừng trồng. Áp dụng biện pháp hoá học để phòng trừ bệnh cho rừng trồng là không khả thi khi diện tích lớn và gây ảnh hưởng đến môi trường sinh thái. Sử dụng vi khuẩn nội sinh để ức chế sự xâm nhiễm của nấm bệnh, làm giảm nguy cơ mắc bệnh đối với cây trồng đã và đang được các nhà khoa học quan tâm (Phạm Quang Thu và Trần Thanh Trăng, 2002). Bài báo này trình bày kết quả nghiên cứu về chủng loại và mật độ của các vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng với nấm gây bệnh trên các cây chủ ở các cấp bệnh hại khác nhau. Sử dụng vi khuẩn nội sinh để tăng cường khả năng kháng bệnh, bảo vệ cây chủ, phòng chống sự xâm nhiễm của sinh vật gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. gây hại. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nội dung nghiên cứu - Phân lập và xác định nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai. - Phân lập các chủng vi khuẩn nội sinh ở các cây bị bệnh ở cấp 0 đến cấp 4. - Xác định hiệu lực ức chế bệnh đốm lá khô cành, ngọn Keo lai thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh. - Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong phòng chống bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai. Phương pháp nghiên cứu - Lấy mẫu tại Lâm trường Tam Thắng, huyện Thanh Sơn tỉnh Phú Thọ, tiến hành phân cấp mức độ bị bệnh của các cây theo 5 cấp được đánh số theo chỉ số bệnh từ 0 đến 4 với các chỉ tiêu như sau: Chỉ tiêu phân cấp mức độ bị hại theo Nguyễn Hoàng Nghĩa và cộng sự năm 2007. Mức độ bị hại Cấp bệnh Biểu hiện bên ngoài Không bị bệnh 0 Cây khoẻ, tán lá phát triển bình thường Hại nhẹ 1 Dưới 25% tán lá bị bệnh hoặc dưới 10% cành bị bệnh. Hại trung bình 2 25-50% tán lá bị bệnh hoặc 10-25% cành bị bệnh. Hại nặng 3 50 đến 75% tán lá bị bệnh hoặc lớn trên 25 đến 50% cành bị bệnh. Hại rất nặng 4 Trên 75% tán lá bị bệnh hoặc trên 50% cành bị bệnh. Ở mỗi cấp mức độ bị bệnh chọn 3 cây tiêu chuẩn, mỗi cây lấy một mẫu (một cành) có đường kính 1- 1.5cm và đánh ký hiệu cho từng mẫu. - Phân lập vi khuẩn nội sinh: Lấy cành mẫu đã được chọn cắt thành từng đoạn nhỏ khoảng 7-8 cm, khử trùng bề mặt bằng cồn 75% trong 1 phút. Lấy ra hơ nhanh qua đèn cồn, sau đó cắt thành các lát mỏng có kích thước 0.5-1.0 (mm) ở 3 vị trí: phần vỏ, phần tượng tầng và phần gỗ. Ngâm các lát cắt riêng rẽ của từng phần qua đêm trong môi trường PBS. Phân lập vi khuẩn theo phương pháp pha loãng tới hạn, cấy gạt trên mặt thạch môi trường King B. Sau 24 giờ đến 48 giờ đếm số lượng khuẩn lạc của từng chủng vi khuẩn có trên mặt thạch và cấy truyền thu vi khuẩn thuần khiết, đánh số và ký hiệu của từng chủng riêng biệt. - Xác định hiệu lực ức chế bệnh đốm lá khô cành ngọn Keo lai thông qua chủng loại và mật độ vi khuẩn nội sinh: Sau phân lập được vi khuẩn thuần khiết chúng ta cấy nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn keo ở 3 góc của hộp lồng. Sau 5-7 ngày thì tiến hành đánh giá hiệu lực của vi khuẩn đối với nấm gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai trên môi trường PDA bằng việc đo đường kính vòng ức chế và chọn những chủng có đường kính vòng ức chế lớn > 20mm. Đường kính vòng ức chế của vi khuẩn đối với nấm bệnh được tính bằng cụông thức: V = D – d, trong đó: V (mm): đường kính trung bình vòng ức chế; D (mm): đường kính tính theo hai chiều từ tâm của hộp lồng đến mép trong của khuẩn lạc nấm bệnh và d (mm): đường kính trung bình của khuẩn lạc vi khuẩn tính theo hai chiều vuông góc. - Ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong việc nâng cao khả năng kháng bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai trong giai đoạn vườn ươm: Thí nghiệm với 3 chủng khuẩn có hiệu lực cao nhất, được tiến hành với 12 công thức với các chủng vi khuẩn và lượng vi khuẩn tiêm vào cây khác nhau, mật độ vi khuẩn trong dung dịch tiêm vào cây là 1,0 x 10 5 CFU/1ml cho tất cả các công thức và 1 công thức đối chứng, mỗi công thức 30 cây, 3 lần lặp. Công thức 1: chủng vi khuẩn B03, tiêm 05ml dịch vi khuẩn Công thức 2: chủng vi khuẩn B03, tiêm 10ml dịch vi khuẩn Công thức 3: chủng vi khuẩn B03, tiêm 15ml dịch vi khuẩn Công thức 4: chủng vi khuẩn B03, tiêm 20ml dịch vi khuẩn Công thức 5: chủng vi khuẩn P01, tiêm 5ml dịch vi khuẩn Công thức 6: chủng vi khuẩn P01, tiêm 10ml dịch vi khuẩn Công thức 7: chủng vi khuẩn P01, tiêm 15ml dịch vi khuẩn Công thức 8: chủng vi khuẩn P01, tiêm 20ml dịch vi khuẩn Công thức 9: chủng vi khuẩn X01, tiêm 5ml dịch vi khuẩn Công thức 10: chủng vi khuẩn X01, tiêm 10ml dịch vi khuẩn Công thức 11: chủng vi khuẩn X01, tiêm 15ml dịch vi khuẩn Công thức 12: chủng vi khuẩn X01, tiêm 20ml dịch vi khuẩn Công thức 13: tiêm 10ml nước cất vô trùng Sau 2 tuần phun ướt toàn bộ cây thí nghiệm ở các công thức thí nghiệm bằng dung dịch nấm gây bệnh Collectotrichum gloeosporioides có mật độ 10 5 CFU/1 ml. Theo dõi sau 1 tháng đánh giá tỷ lệ và mức độ bị bệnh, chiều cao vút ngọn (Hvn), đường kính cổ rễ (Dg). KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Nguyên nhân gây bệnh đốm lá, khô cành, ngọn bạch đàn Từ các mẫu bệnh thu thập ở rừng trồng Keo lai tại Lâm trường Tam Thắng, Phú Thọ đã phân lập và thuần khiết nấm gây bệnh. Bào tử vô tính hình trứng dài, kích thước: bào tử có chiều dài từ 11,87m - 16,38m, chiều rộng 3,26 - 4,78m. Từ đặc điểm trên nấm gây bệnh được xác định định là Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Kết quả phân lập vi khuẩn nội sinh Với 30 mẫu cành Keo lai ở các cấp bị bệnh từ 0 đến 4 đã phân lập được 30 chủng vi khuẩn nội sinh trong đó có 20 chủng khác nhau, kết quả được trình bày ở bảng 1. Bảng 1. Số lượng chủng vi khuẩn ở các mức độ bị bệnh STT Mức độ bị bệnh Số lượng Ký hiệu chủng vi khuẩn 1 Cây khoẻ, không bị bệnh 10 B01, B02, B03, B1.3 P01, P1.3, P2.2 X01, X02, X2.2 2 Hại nhẹ 9 B01, B03, B1.2, B1.3 P1.1, P1.3, P2.2 X1.1, X02 3 Hại trung bình 5 B1.3, B3.1 P2.1 X1.1, X02 4 Hại nặng 4 B1.3, B3.1 P3.1 X3.1 5 Hại rất nặng 2 B4.1 P4.1 Qua bảng 1 cho thấy số lượng chủng vi khuẩn phân lập được từ các mẫu keo bị bệnh ở các mức độ khác nhau có số lượng chủng rất khác nhau, cây khỏe không bị bệnh có lượng chủng vi khuẩn nhiều nhất, 10 chủng và số lượng chủng vi khuẩn giảm dần theo mức độ bị bệnh. Cây bị bệnh ở mức độ bị hại nặng có số lượng chủng vi sinh vật ít nhất, chỉ có 2 chủng. Chủng vi khuẩn X02 có ở tất cả các mẫu từ cây khỏe đến cây bị bệnh ở mức độ trung bình. Xác định hiệu lực ức chế bệnh đốm lá khô cành ngọn Keo lai của các chủng vi khuẩn nội sinh Xác định hiệu lực ức chế nấm gây bệnh được thực hiện theo phương pháp cấy nấm bệnh và vi khuẩn trên cùng một đĩa Petri. Những chủng có hiệu lực là những chủng có vòng ức chế lớn (hình 1). Hình 1: Các chủng khuẩn ức chế nấm Colletotrichum gloeosporioides Hiệu lực đối kháng với nấm gây bệnh và mật độ tế bào của các chủng vi sinh vật nội sinh phân lập từ các mẫu được trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Khả năng kháng nấm Colletotrichum gloeosporioides của các chủng khuẩn nội sinh STT Mức độ bị bệnh Số lượng Ký hiệu chủng vi khuẩn Mật độ (CFU/1gam) Đường kính vòng ức chế (mm) 1 B01 12 . 10 5 37.5 2 B02 12 . 10 5 30 3 B03 13 x 10 5 41,6 4 B1.3 9 . 10 5 16 5 P01 8 . 10 4 34 6 P1.3 8 . 10 4 18 7 P2.2 4 . 10 4 15 8 X01 12 . 10 5 28 9 X02 11 . 10 5 37 10 Cây khoẻ, cây không bị bệnh 10 X2.2 7 . 10 5 16 11 B01 10 . 10 5 37.5 12 B03 11 . 10 5 30 13 Hại nhẹ 9 B1.2 4 . 10 5 14 14 B1.3 9 . 10 5 16 15 P1.1 6 . 10 5 14 16 P1.3 3 . 10 5 18 17 P2.2 4 . 10 5 15 18 X1.1 7 . 10 5 25 19 X02 9 . 10 5 37 20 B1.3 9 . 10 5 16 21 B3.1 3 . 10 5 3 22 P2.1 5 . 10 5 12 23 P1.2 6 . 10 5 2 24 Hại trung bình 5 X0.2 7 . 10 5 37 25 B1.3 6 . 10 5 16 26 B3.1 3 . 10 5 3 27 P3.1 2 . 10 5 2 28 Hại nặng 4 X3.1 4 . 10 5 1 29 B4.1 1 . 10 5 - 30 Hại rất nặng 2 P4.1 1 . 10 5 - Kết quả ở bảng 2 cho thấy mật độ của các chủng khuẩn có khả năng ức chế nấm gây bệnh có trong cây chủ nằm ở mức 1.10 5 - 13.10 5 CFU/1gam. Cây không bị bệnh (cây khoẻ) có số lượng chủng vi khuẩn và cả mật độ tế bào cao hơn so với cây chủ bị bệnh ở mức độ nhẹ và trung bình và nặng. Những chủng khuẩn có đường kính vòng ức chế lớn hơn 20mm thường và có mật độ cao (7.10 5 - 13.10 5 ) là những chủng có hiệu lực tốt trong việc ngăn chặn và ức chế sự xâm nhiễm của nấm gây bệnh. Như vậy, từ các mẫu cây khỏe có 6 chủng vi khuẩn có hiệu lực kháng nấm gây bệnh cao, đường kính vòng ức chế > 20mm, đó là các chủng: B01, B02, B03, P01, X01 và X02. Cây bị hại nhẹ có 4 chủng vi khuẩn có hiệu lực cao là: B01, B03, X1.1 và X02. Cây bị hại trung bình chỉ có 1 chủng vi khuẩn có hiệu lực cao là X02. Cây bị hại nặng và hại rất nặng không có chủng vi khuẩn nào có hiệu lực kháng nấm. Qua trên thấy rằng sự có mặt của vi khuẩn nội sinh trong cây chủ đã nâng cao tính kháng bệnh cho cây chủ. Sự kháng bệnh này được gọi là kháng bệnh cảm ứng, với từ tiếng Anh tương ứng là Induced Disease Resistance. Ứng dụng vi khuẩn nội sinh để tăng cường khả năng kháng bệnh của cây Chọn 3 chủng vi khuẩn có hiệu lực cao nhất trong việc ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh là B03, P01 và X02. Thí nghiệm được tiến hành tại vườn ươm Viện Khoa học Lâm nghiệp Việt Nam. Kết quả thí nghiệm được trình bày ở bảng 3. Bảng 3. Sinh trưởng và sự kháng bệnh của cây Keo lai được nhiễm vi khuẩn nội sinh Tỷ lệ bị bệnh (P%) Mức độ bị bệnh (R%) Chiều cao (H cm) Đường kính cổ rễ (D mm) TT Công thức thí nghiệm Trước khi nhiễm nấm gây bệnh Sau khi nhiễm nấm gây bệnh Trước khi nhiễm nấm gây bệnh Sau khi nhiễm nấm gây bệnh Trước khi nhiễm nấm gây bệnh Sau khi nhiễm nấm gây bệnh Trước khi nhiễm nấm gây bệnh Sau khi nhiễm nấm gây bệnh 1 CT1 0 12,50 0 13,50 34,51 49,20 4,80 4,90 2 CT2 0 21,00 0 18,00 35,00 49,90 4,95 5,00 3 CT3 0 0 0 0 34,25 59,00 5,20 5,50 4 CT4 0 8,00 0 10,50 33,50 51,50 4,90 5,00 5 CT5 0 20,50 0 19,25 35,67 48,60 4,75 4,80 6 CT6 0 16,00 0 19,00 34,78 49,50 4,90 5,00 7 CT7 0 15,30 0 17,50 35,23 50,80 5,15 5,20 8 CT8 0 14,30 0 20,50 34,55 48,80 4,85 4,90 9 CT9 0 23,00 0 17,25 35,56 50,00 4,65 4,70 10 CT10 0 18,00 0 20,00 36,00 49,40 5,00 5,10 11 CT11 0 18,10 0 17,50 35,32 51,00 4,94 5,00 12 CT12 0 19,40 0 14,00 34,37 50,00 5,00 5,10 13 CT13 0 59,30 0 53,25 35,75 40,40 4,60 4,60 Khi tiêm 3 chủng vi khuẩn nội sinh B03, X01và P01 cho cây Keo lai ở các công thức như trên ta thấy cả 3 chủng đều có hiệu lực tăng cường khả năng kháng bệnh cho cây và sinh trưởng vượt trội so với đối chứng, được thể hiện mức độ bị bệnh, tỷ lệ bị bệnh thấp, đường kính gốc và chiều cao vút ngọn. Tỷ lệ bị bệnh trung bình của các công thức thí nghiệm so với đối chứng giảm 43,5%, mức độ bị bệnh cũng giảm đi 37,5%. Chiều cao vút ngọn trung bình của cây con ở các công thức thí nghiệm tăng 45,3%, đường kính gốc cũng tăng lên 1,9% so với đối chứng. Trong 3 chủng vi khuẩn thí nghiệm thì chủng B03 được tiêm với liều lượng 15ml/cây có hiệu lực cao nhất, cây con không bị bệnh, sinh trưởng đạt giá trị cao nhất, Chiều cao tăng 72,3%, đường kính cổ rễ tăng 5,8% so với công thức đối chứng. KẾT LUẬN Nguyên nhân gây bệnh đốm lá, khô cành ngọn Keo lai tại Phú Thọ được xác định do nấm Colletotrichum gloeosporioides (Penz.) Sacc. Số lượng chủng vi khuẩn nội sinh và mật độ tế bào các chủng vi khuẩn nội sinh có trong 1 gam gỗ của cây chủ Keo lai ở các cấp bị bệnh khác nhau là rất khác nhau. Cây khỏe, không bị bệnh có số lượng chủng vi khuẩn nhiều nhất, cây bị bệnh nặng có số lượng chủng vi khuẩn ít nhất. Chủng vi khuẩn có hiệu lực cao đối với ức chế sự phát triển của nấm gây bệnh cũng khác nhau ở các mức độ bị bệnh khác nhau. Cây khỏe có nhiều chủng vi khuẩn hiệu lực cao, số lượng các chủng vi khuẩn giảm dần theo mức độ bị bệnh và cây chủ bị bệnh nặng hoàn toàn không có chủng vi khuẩn nội sinh nào có hiệu lực kháng nấm gây bệnh. Khi tiêm vi khuẩn nội sinh vào trong thân cây Keo lai ở giai đoạn vườn ươm, khả năng kháng bệnh của cây đó được tăng lên, được đánh giá trên 4 chỉ tiêu tỷ lệ bị bệnh, mức độ bị bệnh, chiều cao của cây và đường kính gốc. C hủng vi khuẩn B03 được tiêm với liều lượng 15ml/cây, mật độ 1.10 5 CFU/ml có hiệu quả nhất về khả năng kháng bệnh và tăng sinh trưởng của cây. TÀI LIỆU THAM KHẢO Bộ Nông nghiệp và Phát triển nông thôn, 2007. Quyết định về việc công bố hiện trạng rừng toàn quốc năm 2006. Quyết định số 2503/QĐ/BNN-KL, ngày 27 tháng 8 năm 2007. Chanway C.P., 1996. Endophytes: They are not just fungi. Canadian Journal of Botany 74: 321-322. Nguyễn Hoàng Nghĩa, Phạm Quang Thu và Nguyễn Văn Chiến, 2007. Báo cáo công nhận giống các dòng bạch đàn, Keo lai và Keo lá tràm chống chịu bệnh có năng suất cao. Bộ NN&PTNT - Viện KHLN Việt Nam. Hà Nội. Phạm Quang Thu và Trần Thanh Trăng, 2002. Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn đối kháng với nấm gây bệnh vùng rễ cây thông. Thông tin Khoa học Kỹ thuật Lâm nghiệp- Số 3, trang 2-5. ENHANCEMENT OF INDUCED DISEASE RESISTANCE OF ACACIA HYBRID USING BACTERIAL ENDOPHYTES Vu Van Dinh Economics-Technical College, Lao Cai SUMMARY Endophytic microorganisms living in cell tissues of host plants not only cause disease to plants but can also establish beneficial relationships. These microorganisms promote the growth of host plants by creating a biological barrier to control the pathogens which attack host plants. Endophytic bacteria having a high effect in antipathogens were isolated from healthy plants, low and moderately infected plants, while plants which were highly or seriously infected by disease didn’t have any of the effective endophyte bacteria. This difference is also reflected in differences in bacterium density in plants infected by disease to different levels. Bacteria density in healthy plants is higher than in infected plants. Two month old Acacia magium in treatment (effected by effective bacteria clone, B03, with dosage of 15ml per plant and density of 1 x 10 5 CFU/ml) have the ability to enhance reduced disease resistance caused by fungus Colletotrichum gloeosporioides, and also grow better than in the control. Key words: Induced disease resistance, Acacia hybrid, Endophytic microorganisms . Nghiên cứu khoa học TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CẢM ỨNG CHO CÂY KEO LAI BẰNG SỬ DỤNG VI KHUẨN NỘI SINH TĂNG CƯỜNG KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH CẢM ỨNG CHO CÂY KEO LAI. của các vi khuẩn nội sinh có hoạt tính đối kháng với nấm gây bệnh trên các cây chủ ở các cấp bệnh hại khác nhau. Sử dụng vi khuẩn nội sinh để tăng cường khả năng kháng bệnh, bảo vệ cây chủ,. có chủng vi khuẩn nội sinh nào có hiệu lực kháng nấm gây bệnh. Khi tiêm vi khuẩn nội sinh vào trong thân cây Keo lai ở giai đoạn vườn ươm, khả năng kháng bệnh của cây đó được tăng lên,