Ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tiềm năng gia tăng và biệt hóa của tế bào gốc phôi chuột nuôi cấy in vitro

Bài viết nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường nuôi cấy đến tiềm năng gia tăng và biệt hóa của tế bào gốc phôi chuột nuôi cấy in vitro bằng cách bổ sung các chất vào môi trường nuôi cấy để điều khiển tốc độ gia tăng và hạ biệt hóa định hướng của tế bào gốc.

27(4): 70-73 12-2005 Tạp chí Sinh học ảnh hởng môi trờng nuôi cấy đến tiềm gia tăng biệt hóa tế bào gốc phôI chuột nuôI cấy in vitro Đỗ Thị Thảo, Đỗ Khắc Hiếu Viện Công nghệ sinh học Nguyễn Mộng Hùng Trờng đại học Khoa học tự nhiên, ĐHQGHN Tế bào gốc (stem cell) đợc ý đến năm gần ý nghĩa khoa học thực tiễn Khả phân chia liên tục biệt hóa thành loại tế bào khác thể tiềm tế bào gốc mà tế bào bình thờng (chuyên hóa) khác [1,4] Chính nhờ có tiềm mà tế bào gốc đợc øng dơng nhiỊu lÜnh vùc nh− liƯu ph¸p tế bào điều trị bệnh đái đờng, bệnh lú lẫn (alzheimer), bệnh máu, bệnh tim, nghiên cứu trình ung th hóa tế bào điều trị ung th, tạo động vật chuyển gien cho sản phẩm quý, nghiên cứu di truyền trình phát triển cá thể[1,5,6] Khi nhân nuôi in vitro tế bào gốc môi trờng nuôi cấy tế bào động vật thông thờng, tế bào gốc nhanh chóng tiềm quý giá này; chúng bị chết môi trờng không phù hợp hay biệt hóa không định hớng thành loại tế bào chuyên hóa khác nhau, ngừng phân chia chết theo chơng trình (apoptosis) Việc nghiên cứu bổ sung chất vào môi trờng nuôi cấy để điều khiển tốc độ gia tăng biệt hóa định hớng tế bào gốc đợc tập trung nghiên cứu Một số công trình nghiên cứu cho thấy bổ sung LIF (Leukemie Inhibit Factor) vào môi trờng nuôi cấy trì đợc khả gia tăng biệt hóa tế bào gốc [2,3] Kết nghiên cứu cho thấy dùng môi trờng đ nuôi tế bào FC (Feeder Cells) ngày để nuôi tế bào gốc giữ đợc tế bào gốc không biệt hóa tiếp tục gia tăng, huyết thai bò huyết bê sinh vừa thúc đẩy trình đổi tế bào, vừa thúc đẩy trình biệt hóa tự nhiên tế bào gốc 70 I phơng pháp nghiên cứu Thu nhận phôi, tách nhân nuôi tế bào FC phôi chuột Chuột nhắt trắng dòng Swiss có trọng lợng 25-30g (4-6 tuần tuổi), Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ơng cung cấp đợc theo dõi hàng ngày chu kỳ tế bào âm đạo Chuột thời kỳ tiền động dục đợc ghép ®ùc (1♀/1♂) vµ tiÕp tơc theo dâi hai ngµy Ngày thấy có nút trắng hay tinh trùng âm đạo đợc xem ngày phôi thứ Tế bào sợi phôi chuột đợc gọi tế bào nuôi FC (Feeder Cells), đợc tách từ phôi 13-15 ngày tuổi theo phơng pháp Anna M Wobus (2002) [1] Tách nhân nuôi tế bào gốc phôi chuột Tế bào gốc phôi chuột ESC (Embryonic Stem Cell) đợc tách từ phôi 5-6 ngày tuổi theo phơng pháp Claudia Hegert (2002) [2] Tổ chức thí nghiệm Để nghiên cứu ảnh hởng yếu tố môi trờng nuôi cấy đến khả gia tăng biệt hóa tế bào ESC, tổ chức thí nghiệm nh sau: Tế bào ESC đợc nuôi khay có 48 giếng phủ giêlatin 1%; mật độ ban đầu 100 tế bào 400 àl môi trờng/mỗi giếng Các môi trờng đợc chuẩn bị nh− sau: M1 = m«i tr−êng RPMI 1640 kh«ng cã FBS lớp tế bào FC; M2 = môi trờng RPMI 1640 có 10% FBS lớp tế bào FC; M3 = môi trờng RPMI 1640 cã 10% FBS vµ cã líp tÕ bµo FC; M4 = môi trờng RPMI 1640 có 10% FBS 40% dung dịch nuôi tế bào FC ngày nuôi thứ hai, lớp tế bào FC; M5 = môi tr−êng DMEM cã 10% FBS vµ cã líp tÕ bµo FC; M6 = môi trờng DMEM có 10% FBS 40% dung dịch nuôi tế bào FC ngày nuôi thứ hai, lớp tế bào FC; M7 = môi trờng DMEM có 10% NBS 40% dung dịch nuôi tế bào FC ngày nuôi thứ hai, không cã líp tÕ bµo FC FBS = hut cđa thai bò; NBS = huyết bê sinh Cứ sau hai ngày, tế bào lại đợc thay môi trờng loại cho tất giếng nuôi Đến ngày thứ mời, lớp tế bào ESC đợc làm bong rời đếm buồng đếm Neubauer có trypan blue Số liệu đợc xử lý phần mềm Excel II kết thảo luận Kết nghiên cứu đợc trình bầy bảng Bảng Sự gia tăng biệt hóa tế bào gốc phôi chuột ESC sau 10 ngày nuôi cấy M«i tr−êng Nu«i cÊy M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Số ESC ban đầu 100 tb 100 tb 100 tb 100 tb 100 tb 100 tb 100 tb Sè ESC sau 10 ngµy 042,0 ± 03,5 164,8 ± 12,7 339,5 ± 16,2 296,0 ± 14,8 390,5 ± 19,6 320,1 17,1 280,3 13,3 Tế bào ESC nuôi cấy môi trờng M1 (hình 1a) gần nh không phân chia không biệt hóa, bám yếu ớt đáy chai nuôi chết dần; sau 10 ngày, khoảng 42% tế bào ESC chết hết sau khoảng 18 ngày Trong môi trờng M2, sau 10 ngày, tế bào ESC (hình 1b) phân chia nhân lên = 164,8 ± 12,7, ®ång thêi mét sè lín (80,5 5,2%) biệt hóa thành tế bào dạng sợi, đa số dạng dạng tế bào thần kinh (tế bào có sợi trục (a) (b) X% ESC bÞ biƯt hãa 06,8 ± 0,7 80,5 ± 5,2 24,3 ± 2,6 20,8 ± 2,1 19,6 ± 1,8 18,4 ± 1,7 12,6 1,1 Ngày không ESC 18 26 >30 >30 >30 >30 >30 phân nhánh) Sau 26 ngày, không thấy tế bào ESC (tế bào có dạng hình cầu có nhân to), nhiên tồn số tế bào chuyên hóa Về thống kê, khác môi trờng M1 môi trờng M2 có ý nghĩa với = 0,05 Về thành phần, môi trờng M2 khác với môi trờng M1 có thêm 10% FBS Nh vậy, rõ ràng FBS có tác dụng kích thích trình phân chia còng nh− biƯt hãa cđa tÕ bµo ESC (c) Hình Tế bào ESC đợc nhân nuôi môi trờng M1 (a), M2 (b) M3 (c) 71 Tế bào ESC đợc nuôi cấy môi trờng M3 sau 10 ngày đ phân chia nhân lên nhanh = 339,5 16,2, xuất cụm tế bào thể phôi 24,3 2,6% số tế bào ESC bị biệt hóa (hình 1c) Sau 30 ngày, số tế bào ESC tế bào chuyên hóa tồn với tỷ lệ tơng tự nh sau 10 ngày (khoảng 24,3%) So sánh phát triển tế bào ESC môi trờng M2 môi trờng M3 cho thấy khác có ý nghĩa thống kê, tốc độ phân chia nh biệt hóa; điều nµy chøng minh líp tÕ bµo FC (sau xư lý MC) đ ức chế trình biệt hóa tế bào ESC trực tiếp hay gián tiếp (thông qua ức chế biệt hóa) làm tế bào ESC tăng nhanh Tế bào ESC đợc nuôi môi trờng M4 phát triển tơng tự nh môi trờng M3 song tốc độ có thấp Sau 10 ngày, số tế bào ESC = 296,0 ± 14,8, xt hiƯn c¸c cơm tÕ bào thể phôi EB số tế bào ESC bị biệt hóa 20,8 2,1% Kết phát triển tế bào ESC môi trờng M3 môi trờng M4 đ chứng minh cho kết luận số tác giả [5], [6] lớp tế bào FC (sau xử lý MC) đ tiết vào môi trờng nuôi dỡng chúng chất thuộc nhóm LIF có ảnh hởng đến hoạt động gien công tắc Oct-4 Trong hai môi trờng M5 M6 sử dụng DMEM, tế bào ESC phân chia nhanh hơn, có tỷ lệ biệt hóa thấp so với môi trờng M3 M4 sư dơng RPMI1640 Sau 10 ngµy, sè tÕ bµo ESC = 390,5 ± 19,6/M5 vµ = 320,1 ± 17,1/M6; số tế bào ESC bị biệt hóa 19,6 1,8%/M5 18,4 1,7%/M6, tơng ứng với môi trờng M3 môi trờng M4 = 339,5 16,2/M3, 296,0 ± 14,8/M4 vµ 24,3 ± 2,6%/M3, 20,8 ± 2,1%/M4 Các cụm tế bào thể phôi hình thành hai môi trờng M5 M6 có kích thớc lớn so sánhvới hai môi trờng M3 M4 So sánh phát triển tế bào ESC hai m«i tr−êng M6 sư dơng FBS víi m«i tr−êng M7 sư dơng NBS thÊy sù kh¸c biƯt cã ý nghĩa thống kê gia tăng tế bào ESC nh tỷ lệ biệt hóa; với môi tr−êng M6 sè tÕ bµo ESC = 320,1 ± 17,1 vµ tû lƯ biƯt hãa = 18,4 ± 72 1,7% với môi trờng M7 tơng ứng = 280,3 13,3% 12,6 1,1% Kết cho thấy tác dụng kích thích trình phân chia nh biệt hóa tế bào ESC FBS mạnh NBS III kết luận Từ kết trên, rút kết luận sau: Nuôi cấy môi trờng RPMI1640 đơn (không có FBS, tế bào nuôi FC), tế bào gốc phôi chuột ESC bị chết môi trờng không phù hợp Huyết thai bò FBS huyết bê sinh NBS có tác dụng kích thích trình phân chia nh biệt hóa tế bào ESC, song tác dụng FBS mạnh NBS Líp tÕ bµo FC (sau xư lý MC) nh dung dịch đ nuôi tế bào FC hai ngày có tác dụng kìm h m trình biệt hóa nhng không ức chế phân chia gia tăng tế bào ESC Các môi trờng M5, M6 M7 sử dụng để nhân nuôi tế bào ESC, tuỳ theo điều kiện có đợc mục đích sử dụng mà chọn môi trờng cho thích hợp Tài liệu tham khảo Anna M Wobus et al., 2002: Methods in Molecular Biology, 184: 127-155 Claudia Hegert et al., 2002: Journal of Cell Science, 115: 4617-4628 Helene Boeuf et al., 1997: Journ Cell Biol., 138 (6): 1207-1217 Janet Rossant et al., 2001: Stem Cells, 19 (5): 477-482 Junji Fujikura et al., 2002: Journ Genes & Development 16 (7): 784-789 Maurizio Pesce et al., 2001: Oct-4 Stem Cells, 19 (4): 271-278 effect of the supplemented media on the proliferated and Differentiated Capacities of in vitro cultured mouse stem cells Do Thi Thao, Do Khac Hieu, Nguyen Mong Hung Summary The ability of continuous dividing and differentiating into various cell types of living organisms is the potentials of stem cells which make them different from other normal cells These potentials of stem cells arise many possible applications such as in practical treatment of diabetes, alzheimer, blood cancer, heart disease…, in the studies on carcinogenic process for future suggesting therapies, in producing transgenic animals for making valuable products, in genetic study and evolutional development In our studies, we focused on the effects of supplement factors added into the growth media in order to regulate the proliferation and the specialization of stem cells Our results showed that: Mouse embryonic stem cells (ESC) were died when growing in the plain RPMI1640 medium (without FBS and without Feeder cells FC) due to the unsuitable medium Both the fetal bovine serum (FBS) and the newborn bovine serum (NBS) had effects on the stimulation of proliferation and differentitation of the ESC; however, FBS showed stronger effect than NBS The FC (after treatment with MC) as well as the days FC growing extracted medium showed the same effect on the suppression of the differentiation but not the proliferation of the ESC The M5, M6 and M7 media were all able to be used for the culture of the mouse ESC The choosen medium only was dependent on the laboratory availability and the scientific purposes Ngµy nhËn bµi: 20-6-2005 73 ... FC; M6 = môi trờng DMEM có 10% FBS 40% dung dịch nuôi tế bào FC ngày nuôi thứ hai, lớp tế bào FC; M7 = môi trờng DMEM có 10% NBS 40% dung dịch nuôi tế bào FC ngày nuôi thứ hai, lớp tế bào FC FBS... kết thảo luận Kết nghiên cứu đợc trình bầy bảng Bảng Sự gia tăng biệt hóa tế bào gốc phôi chuột ESC sau 10 ngày nuôi cấy Môi trờng Nuôi cấy M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 Sè ESC ban ®Çu 100 tb 100 tb 100... nh biệt hóa tế bào ESC (c) Hình Tế bào ESC đợc nhân nuôi môi trờng M1 (a), M2 (b) M3 (c) 71 Tế bào ESC đợc nuôi cấy môi trờng M3 sau 10 ngày đ phân chia nhân lên nhanh = 339,5 16,2, xuất cụm tế