Ảnh hưởng của nồng độ đường, vitamin, cường độ ánh sáng và thành phần khoáng lên sự tăng trưởng của sâm bố chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) nuôi cấy in vitro

Sâm bố chính, Hibiscus sagittifolius Kurz, là loài dược liệu có phần rễ củ được sử dụng trong y học cổ truyền với các tác dụng như kích thích não bộ, tăng cường sinh lực, chống suy nhược thần kinh. Tỷ lệ nảy mầm từ hạt của cây sâm bố chính trong tự nhiên rất thấp, vì vậy, một số yếu tố ảnh hưởng lên quá trình vi nhân giống nhằm tạo ra một lượng lớn cây con chất lượng cao và đồng nhất đã được nghiên cứu.

TAP SINH 2017, 39(1): 86-95 ẢnhCHI hưởng củaHOC nồng độ đường, vitamin DOI: 10.15625/0866-7160/v39n1.8468 ẢNH HƯỞNG CỦA NỒNG ĐỘ ĐƯỜNG, VITAMIN, CƯỜNG ĐỘ ÁNH SÁNG VÀ THÀNH PHẦN KHOÁNG LÊN SỰ TĂNG TRƯỞNG CỦA SÂM BỐ CHÍNH (Hibiscus sagittifolius Kurz) NUÔI CẤY IN VITRO Nguyễn Lê Thụ Minh1, Nguyễn Thụy Phương Duyên1, Lê Thị Tuyết Anh2, Nguyễn Thị Quỳnh1* Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất Dược liệu miền Trung, Tuy Hòa, Phú n TĨM TẮT: Sâm bố chính, Hibiscus sagittifolius Kurz, lồi dược liệu có phần rễ củ sử dụng y học cổ truyền với tác dụng kích thích não bộ, tăng cường sinh lực, chống suy nhược thần kinh Tỷ lệ nảy mầm từ hạt sâm bố tự nhiên thấp, vậy, số yếu tố ảnh hưởng lên trình vi nhân giống nhằm tạo lượng lớn chất lượng cao đồng nghiên cứu Những yếu tố ảnh hưởng gồm nồng độ đường, vitamin, cường độ ánh sáng, thành phần khống mơi trường nuôi cấy Sau 42 ngày nuôi cấy, đốt thân sâm bố in vitro có mang ni bao polypropylene điều kiện quang tự dưỡng cường độ ánh sáng cao, 150 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng ni 25oC ± 2oC, ẩm độ tương đối (RH) 55% ± 5%, có tăng trưởng tốt so với nuôi cấy điều kiện quang dị dưỡng hay điều kiện quang tự dưỡng cường độ ánh sáng thấp, 75 µmol m-2 s-1 Trên loại mơi trường khoáng khác (MS, 1/2 MS, 1/2 NH4, SH, B5, EN), đốt thân sâm bố in vitro có mang nuôi cấy quang tự dưỡng môi trường khống SH có gia tăng khối lượng tươi cao (384,9 mg/cây) có thân rễ phát triển đồng so với mơi trường khống khác ngày ni cấy thứ 42 Kết nghiên cứu cho thấy, sâm bố tăng trưởng tốt ni cấy in vitro bao polypropylene có gắn màng trao đổi khí giấy lọc, mơi trường khống SH không đường vitamin, cường độ ánh sáng 150 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ phòng ni cấy 25oC ± 2oC, RH 55% ± 5% Từ khóa: Hibiscus sagittifolius, cường độ ánh sáng, quang dị dưỡng, quang tự dưỡng, thành phần khoáng MỞ ĐẦU Sâm bố chính, Hibiscus sagittifolius Kurz, gọi nhân sâm Phú Yên, thuộc họ Malvaceae, lồi dược liệu có phần rễ củ sử dụng y học cổ truyền với tác dụng kích thích não bộ, tăng cường sinh lực, chống suy nhược thần kinh, chóng mặt đau bụng (Đỗ Tất Lợi, 2004) Ngồi ra, sâm bố khai thác lồi cảnh vẻ đẹp hoa hình dáng đặc biệt rễ Nhằm đáp ứng nhu cầu giống khỏe đồng mặt di truyền với số lượng lớn, nhân giống vơ tính ni cấy mô thực vật, bao gồm vi nhân giống truyền thống quang tự dưỡng, xem phương pháp ưu việt so với nhân giống vơ tính phương pháp giâm cành, chiết cành, v.v Trong phương pháp vi nhân giống truyền thống, gọi vi nhân giống quang dị dưỡng, thực vật sử dụng nguồn carbon hữu (đường, 86 vitamin, chất điều hòa sinh trưởng thực vật, v.v.) để gia tăng sinh khối Trong phương pháp quang tự dưỡng, gọi phương pháp vi nhân giống mơi trường khơng có diện đường, vitamin chất điều hòa sinh trưởng thực vật, khả quang hợp điều kiện nuôi cấy in vitro xem yếu tố định cho tăng trưởng (Nguyen et al., 2016) Để đạt hiệu quang hợp tốt, bình ni cấy cần thống khí để cung cấp đủ lượng khí CO2 cần thiết cho hoạt động quang hợp, đồng thời cường độ ánh sáng (photosynthetic photon flux, PPF) phải điều chỉnh mức tương ứng để cung cấp đủ lượng photon cho thực vật sử dụng hoạt động quang hợp Ngoài ra, khác biệt thành phần hàm lượng chất khống mơi trường ni cấy chứng minh có vai trò quan trọng tăng trưởng in vitro nuôi cấy quang tự dưỡng Nguyen Le Thu Minh et al (Lê Trọng Lư nnk., 2015; Ngô Thị Ngọc Hương nnk., 2015) Phan Duy Hiệp nnk (2014) cơng bố nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên tạo chồi rễ bất định sâm Phú Yên nuôi cấy in vitro Số chồi bất định (4,5 chồi) cao đốt thân sâm Phú Yên nuôi cấy mơi trường khống MS bổ sung mg/l BA, 0,2 mg/l GA3, 10% nước dừa, số rễ bất định (6,6 rễ) cao mơi trường khống MS bổ sung 0,5 mg/l IBA, 0,5 mg/l NAA Trong nghiên cứu này, ảnh hưởng điều kiện nuôi cấy in vitro (sự diện đường vitamin, cường độ ánh sáng, thành phần khống mơi trường ni cấy) khác khảo sát, nhằm mục đích tìm điều kiện thích hợp góp phần xây dựng quy trình vi nhân giống sâm bố VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Mẫu nuôi cấy đốt thân thứ (dài 1,0-1,5 cm) tính từ xuống mang mở in vitro Cây sâm bố trồng ngồi tự nhiên, Trung tâm Nghiên cứu Sản xuất dược liệu miền Trung, Tuy Hòa, Phú Yên cung cấp khử trùng ni cấy trước mơi trường MS (Murashige & Skoog, 1962) có thành phần NH4NO3 giảm 1/2, vitamin Morel (Morel et al., 1951) đường (công ty Đường Biên Hòa, Đồng Nai) 15 g L-1, agar (Cơng ty Cổ phần Đồ hộp Hạ Long) 10 g L-1 Nhằm mục đích tìm điều kiện ni cấy thích hợp góp phần xây dựng quy trình vi nhân giống sâm bố chính, nghiên cứu thực với thí nghiệm Ảnh hưởng cường độ ánh sáng diện đường, vitamin môi trường nuôi cấy lên tăng trưởng sâm bố nuôi cấy in vitro Đốt thân nuôi cấy bao polypropylene (V = 800 ml) không gắn màng trao đổi khí ni cấy mơi trường có đường vitamin, có gắn hai màng ( = cm) trao đổi khí giấy lọc (cơ sở sản xuất Lê Mai Tâm, Đà Lạt) nuôi cấy mơi trường khơng có diện đường vitamin Số lần trao đổi khí (N) bao khơng có có màng trao đổi khí đo 0,21 2,52 lần/giờ theo phương pháp Kozai et al (1986) Mỗi bao chứa 120 ml mơi trường khống MS với hàm lượng khống NH4NO3 giảm 1/2, giá thể sử dụng agar 10 g L-1, pH môi trường điều chỉnh mức 6,0 trước khử trùng Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với yếu tố khác biệt điều kiện nuôi cấy (bảng 1) gồm cơng thức: (SL) mơi trường có chứa đường 30 g L-1, vitamin Morel, kết hợp với PPF thấp, 75 µmol m-2 s-1, (FL) mơi trường khơng có diện đường vitamin kết hợp với PPF thấp, 75 µmol m-2 s-1, (FH) mơi trường khơng có diện đường vitamin kết hợp với PPF cao, 150 µmol m-2 s-1 Thí nghiệm đặt phòng ni có nhiệt độ khơng khí 25oC ± 2oC, độ ẩm tương đối (RH) 55% ± 5%, đèn huỳnh quang (cơng ty Điện Quang, Hồ Chí Minh) với thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày Mỗi công thức gồm bao polypropylene, bao chứa đốt thân Thí nghiệm lặp lại lần Thời gian thí nghiệm 42 ngày Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng sâm bố Dựa kết thí nghiệm 1, đốt thân sâm bố ni cấy quang tự dưỡng (trên mơi trường khơng có diện đường vitamin) bao polypropylene (V = 800 ml) có màng trao đổi khí, bao chứa 120 ml mơi trường với giá thể agar 10 g L1 để khảo sát tăng trưởng ảnh hưởng loại thành phần khống khác pH mơi trường điều chỉnh mức 6,0 trước khử trùng Thí nghiệm bố trí hồn tồn ngẫu nhiên với yếu tố khác biệt thành phần khoáng mơi trường ni cấy Thí nghiệm gồm cơng thức: (MS) khoáng đa lượng vi lượng MS, (1/2 MS) khoáng đa lượng MS giảm 1/2 kết hợp với khoáng vi lượng MS, (1/2 NH4) khống đa lượng MS có hàm lượng NH4NO3 giảm 1/2 kết hợp với khoáng vi lượng MS, (SH) khoáng đa lượng vi lượng theo môi trường Schenk & Hildebrandt (Schenk et al., 1972), (B5) khống đa lượng vi lượng theo mơi trường Gamborg B5 (Gamborg et al., 1968) (EN) khoáng đa lượng vi lượng theo môi trường Enshi-Shoho (Hori, 1966) Mỗi công thức gồm bao polypropylene, bao mang đốt thân Thí nghiệm lặp lại lần đặt 87 Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin phòng ni cường độ ánh sáng 150 µmol m-2 s-1, thời gian chiếu sáng 12 giờ/ngày, nhiệt độ khơng khí 25oC ± 2oC RH 55% ± 5% Các tiêu tăng trưởng số lá, diện tích lá, số rễ, chiều dài rễ, chiều cao cây, khối lượng tươi khối lượng khô cây, thu thập ngày thứ 42 thí nghiệm Diện tích đo máy LI-3100C (LI-COR® Biosciences, Inc., Hoa Kỳ) Cường độ ánh sáng đo máy đo cường độ ánh sáng LICOR, model LI-250A (LI-COR® Biosciences, Inc., Hoa Kỳ) Hiệu suất quang hợp đo thời gian nuôi cấy ngày 21, 28, 35, 42 máy sắc ký khí GC 2010 (Shimadzu Co., Nhật Bản) theo phương pháp Fujiwara et al (1987) Số liệu thống kê phân tích ANOVA yếu tố phân hạng theo LSD-test hay Duncan’s Multiple Range Test (tùy theo số lượng công thức thí nghiệm) phần mềm MSTATC phiên 2.10 Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ vẽ đồ thị phần mềm Excel 2010 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin cường độ ánh sáng lên tăng trưởng sâm bố ni cấy in vitro Ở ngày thứ 42, gia tăng khối lượng tươi (IFW) sâm bố ba điều kiện ni cấy khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (bảng 1) Cây sâm nuôi cấy môi trường không đường vitamin điều kiện cường độ ánh sáng cao (cơng thức FH) có IFW (297,7 mg/cây) lớn so với hai công thức FL (268,5 mg/cây) SL (242,5 mg/cây) Tuy nhiên, gia tăng tích lũy vật chất khơ không khác biệt phương diện thống kê ba điều kiện nuôi cấy khác (bảng 1) Như vậy, sâm bố ni cấy in vitro tạo lượng sinh khối từ nguồn carbon vơ CO2 khơng khí thơng qua hoạt động quang hợp, tương đương với lượng sinh khối mà tích lũy ni cấy điều kiện có nguồn carbon hữu đường vitamin Mặc dù số công thức không khác biệt mặt thống kê, diện tích sâm bố mơi trường khơng đường vitamin hai công thức, FL FH, lớn gấp hai lần so với nuôi cấy mơi trường có đường vitamin (hình 1, bảng 2) Điều cho thấy, hoạt động máy quang hợp sâm bố điều kiện ni cấy quang tự dưỡng thúc đẩy mạnh, dẫn đến gia tăng kích thước điều kiện thí nghiệm Bảng Gia tăng khối lượng tươi (IFW), gia tăng khối lượng khô (IDW) phần trăm chất khơ (% DM) sâm bố ngày thứ 42 Điều kiện nuôi cấy Tên IFW IDW công % DM Sucrose Vitamin Màng trao PPF (mg/cây) (mg/cây) z thức (mg L-1) Morel đổi khí (mol m-2 s-1) SL 30 Có 75 242,5 cx 24,3 10,15 FL Không 75 268,5 b 24,6 9,40 FH Không 150 297,7 a 26,1 9,03 y ANOVA ** NS NS CV (%) 2,50 10,29 7,68 z S hay F bên trái tên công thức tượng trưng cho mơi trường ni cấy có hay khơng có đường vitamin; L hay H bên phải tượng trưng cho cường độ ánh sáng (PPF) mức thấp (75 µmol m-2 s-1) hay cao (150 µmol m-2 s-1); y NS, **: không khác biệt hay khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng LSD-test Cây sâm bố cơng thức SL có số rễ (5,8 rễ/cây) chiều dài rễ (56,8 mm) ngày thứ 42 lớn so với công thức FL 88 (3,1 rễ/cây 28,8 mm) FH (4,3 rễ/cây 43,9 mm) (bảng 2) Điều sâm bố ni cấy mơi trường khơng có Nguyen Le Thu Minh et al diện đường vitamin tập trung vào hoạt động quang hợp khiến máy quang hợp, lá, có tích lũy sinh khối lớn rễ Cây nuôi cấy môi trường có diện đường vitamin tăng trưởng chiều cao tốt hơn, biểu ni điều kiện có cường độ ánh sáng thấp Khi nuôi cấy quang tự dưỡng (QTD), sâm bố đặt PPF cao, 150 µmol m-2 s1 , có chiều cao tăng 75% với diện tích lớn số rễ nhiều so với đặt cường độ ánh sáng thấp 1/2 (bảng 2) Tuy nhiên, kết không tương đồng với kết nghiên cứu Neem (Azadirachta indica A Juss.) nuôi cấy quang tự dưỡng mức cường độ ánh sáng 70, 150 hay 230 µmol m-2 s-1 (Nguyen & Kozai, 2005) Chiều cao Neem thấp gia tăng sinh khối lớn nhất, nuôi cấy cường độ ánh sáng cao nhất, 230 µmol m-2 s-1 Oh et al (2015) chứng minh hoa anh thảo (Cyclamen persicum) có cuống dài hoạt tính gibberelin nội sinh cao ni cấy cường độ ánh sáng 60 µmol m-2 s-1 so với nuôi cường độ ánh sáng 240 µmol m-2 s-1 Hình Sự tăng trưởng sâm bố ngày thứ 42 Ghi tên công thức bảng Bảng Ảnh hưởng phương pháp ni cấy lên số (No.L), diện tích (LA), số rễ (No.R), chiều dài rễ (RL) chiều cao (SL) nhân sâm bố ngày nuôi cấy thứ 42 Tên công thứcz SL FL FH ANOVAy CV (%) No.L (lá/cây) 5,8 6,2 6,4 NS 8,08 LA (cm2/cây) 4,6 bx 9,7 a 10,3 a ** 5,08 No.R (rễ/cây) 5,8 a 3,1 c 4,3 b ** 8,05 RL (mm) 56,8 a 28,8 b 43,9 ab ** 12,22 SL (mm) 41,3 a 21,9 b 38,4 a * 22,06 Ghi chú: bảng 89 Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin Hình Hiệu suất quang hợp (Pn) sâm bố công thức khác theo thời gian nuôi cấy Ghi tên công thức bảng Hiệu suất quang hợp (Pn) công thức SL thấp nhất, Pn công thức FH cao suốt thời gian ni cấy (hình 2) Việc giảm Pn từ ngày nuôi cấy thứ 21 đến ngày 28 hai công thức FH FL trạng thái sinh lý khơng có rụng hay vàng thời gian hay trước Hiệu phương pháp nuôi cấy mô quang tự dưỡng tăng tưởng giai đoạn in vitro ex vitro chứng minh nhiều nghiên cứu Nguyen & Kozai (2001) cho thấy, nhiều loài thực vật thân gỗ măng cụt (Garcinia mangostana), cà phê (Coffea arabusta), hông (Paulownia fortunei), keo (Acacia mangium) Neem (Azadirachta indica) nuôi cấy phương pháp QTD tăng trưởng tương đương tốt so với nuôi cấy phương pháp quang dị dưỡng (QDD) Trong điều kiện nuôi cấy QDD, tăng trưởng chậm phụ thuộc phần lớn vào việc hấp thu carbohydrate từ đường vitamin phần tiếp xúc với mơi trường ni cấy, đồng thời bình ni cấy kín khơng có trao đổi khí với bên ngồi, khí ethylene tạo khơng phóng thích mơi trường khơng khí mà tích lũy dần bình ni với nồng 90 độ ngày cao, dẫn đến việc hạn chế trình tăng trưởng sâm bố Theo Jackson et al (1987), sung (Ficus lyrata) nuôi cấy in vitro bình kín, khí ethylene tạo tích lũy bình ni làm giảm diện tích cây, gia tăng tạo mơ sẹo ảnh hưởng đến tạo chồi Tương tự sung, sâm bố ni cấy điều kiện QDD (trên mơi trường có đường vitamin, bao polypropylene kín khơng có màng trao đổi khí) có diện tích nửa so với nuôi cấy điều kiện QTD Tuy nhiên, Iarema et al (2012) chứng minh sâm Brazil (Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen) có gia tăng khối lượng tươi cao nuôi cấy QDD Điều điều kiện ni cấy QTD (chủ yếu nồng độ CO2 cường độ ánh sáng) chưa phù hợp để sâm Pfaffia phát huy khả tự dưỡng điều kiện in vitro Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng sâm bố Thành phần khống yếu tố hóa học quan trọng tăng trưởng điều kiện tự nhiên nuôi cấy mô tế bào thực vật Ở ngày nuôi cấy thứ 42, gia tăng khối lượng tươi (IFW) sâm bố cao (384,9 mg/cây) ni cấy mơi trường khống Schenk & Hildebrandt (SH), thấp (229,5 mg/cây) ni mơi trường khống MS (MS) (bảng 3) Gia tăng khối lượng khô (IDW) công thức sau 42 ngày nuôi cấy khơng có khác biệt mặt thống kê (bảng 3), phần trăm chất khô (% DM) cơng thức lại có khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 (hình 3) Trong thí nghiệm này, IFW tỷ lệ khối lượng tươi thân lá/khối lượng tươi rễ (SFW/RFW) cơng thức có mối tương quan nghịch với (bảng 3, hình 3) Tỷ lệ khối lượng tươi thân lá/rễ nhỏ phát triển phận thân phận rễ đồng Cây sâm in vitro có tỷ lệ SFW/RFW nhỏ (6,8) cơng thức SH lớn (14,2) cơng thức MS (hình 3) Nguyen Le Thu Minh et al Bảng Gia tăng khối lượng tươi (IFW), gia tăng khối lượng khô (IDW) diện tích (LA) sâm bố ảnh hưởng loại thành phần khống ngày thứ 42 IFW (mg/cây) 229,5 dx 261,4 cd 268,1 c 384,9 a 291,7 c 333,0 b ** 4,87 Tên công thứcz MS 1/2 MS 1/2 NH4 SH B5 EN ANOVAy CV (%) IDW (mg/cây) 25,3 23,2 24,7 29,2 26,9 29,9 NS 12,31 LA (cm2) 7,8 b 9,5 ab 7,8 b 12,4 a 10,6 ab 11,1 a ** 11,09 z MS, 1/2 MS, 1/2 NH4, SH, B5 EN tượng trưng cho mơi trường khống MS, khống đa lượng MS giảm 1/2, khống MS có thành phần NH4NO3 giảm 1/2, khoáng Schenk & Hildebrandt, khoáng Gamborg B5 khống Enshi-Shoho; y NS, **: khơng khác biệt hay khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,01; x Các số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test 12 10 9,2 14,2 SFW/RFW 9,4 16 7,8 13,0 11,3 9,2 6,8 mặt tăng trưởng in vitro (bảng & 4, hình 3) 20 9,4 9,6 12 7,7 SFW/RFW % DM DM 11,1 0 MS 1/2 MS 1/2 NH4 SH B5 EN Tê n cơng thức Hình Phần trăm chất khơ (% DM) tỷ lệ khối lượng tươi thân+lá/rễ (SFW/RFW) sâm bố ngày thứ 42 Ghi chú: Tên cơng thức xem bảng Cây sâm bố in vitro có nhiều (6,4 lá/cây), thân cao (49,6 mm/cây) cơng thức khống Enshi-Shoho (EN) (bảng 4) Các thuộc cơng thức SH khơng có diện tích lớn (12,4 cm2), có rễ phát triển mạnh với số rễ nhiều (8,2 rễ/cây) chiều dài rễ dài (58,1 mm/cây) (bảng 4) Cây sâm bố ni cấy quang tự dưỡng mơi trường khống MS tăng trưởng chậm với số lượng (5,1 lá/cây) rễ tạo thành (3,6 rễ/cây) ni mơi trường khống lại (bảng 4) Ở ngày thứ 42, việc giảm 1/2 hàm lượng khống đa lượng mơi trường MS hay giảm 1/2 hàm lượng khoáng NH4NO3 đem lại kết tương đương Trong vi nhân giống thực vật, khoáng MS sử dụng phổ biến môi trường nuôi cấy giàu nitơ hai dạng nitrate amonium (Villamor, 2010) Julkiflee et al (2014) chứng minh môi trường khoáng MS chưa phải tối ưu cho tăng trưởng Dendrobium Sonia-28 nuôi cấy in vitro George & Klerk (2008) cho rằng, phần lớn thực vật hấp thu nitơ hiệu sinh trưởng tốt môi trường nuôi cấy có chứa hai loại ion NO3‾ NH4+ Tuy nhiên, điều liên quan mật thiết đến đồng hóa đạm rễ Giai đoạn đồng hóa đạm khử nitrate, thường xảy rễ, tối, tổng hợp acid amin tế bào rễ Sự đồng hóa đạm rễ liên quan đến đặc điểm mô non phát triển cần NH4+, NH4+ thường đối kháng với K+, Ca2+ hay Mg2+ Do đó, NH4+ cung cấp cho tế bào rễ nhiều gây thiếu hụt K+, Ca2+ hay Mg2+ dẫn đến kìm hãm tăng trưởng rễ Sự phát triển rễ sâm bố ni cấy môi trường MS so với loại môi trường nuôi cấy khác có lẽ việc dư thừa mức cần thiết ion NH4+ lượng ion NH4+ diện môi trường MS cao 2-16 lần so với mơi trường sử dụng khác Nói cách khác, tăng trưởng chậm sâm bố in vitro ni mơi trường MS so với 91 Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin mơi trường MS có tồn khống đa lượng giảm 1/2 hay MS có NH4NO3 giảm 1/2 hàm lượng khoáng NH4NO3 cao nhu cầu sâm bố dẫn đến kìm hãm tăng trưởng (Britto et al., 2002) Đốt thân oải hương nuôi cấy môi trường khống MS khơng bổ sung đường, vitamin có thành phần khoáng NH4NO3 giảm 1/2 tăng trưởng tốt so với nuôi cấy môi trường khoáng MS (Lê Trọng Lư nnk., 2015) Tương tự, sâm Ngọc Linh nuôi cấy quang tự dưỡng mơi trường khống MS có thành phần NH4NO3 KNO3 giảm 1/2 có hoạt động quang hợp tốt với diện tích tăng 30%, số lượng rễ tăng gấp lần khối lượng khô tăng 50% so với ni mơi trường khống MS (Ngô Thị Ngọc Hương nnk., 2015) Bảng Ảnh hưởng thành phần khoáng lên số (NoL), số rễ (NoR), chiều dài rễ (RL) chiều cao (SL) sâm bố ngày thứ 42 Tên công thứcz MS 1/2 MS 1/2 NH4 SH B5 EN ANOVAy CV (%) NoL (lá/cây) 5,1 cx 6,0 ab 5,5 bc 6,0 ab 6,2 ab 6,4 a * 6,88 NoR (rễ/cây) 3,6 c 5,4 bc 5,6 bc 8,2 a 7,0 ab 6,6 ab ** 13,89 RL (mm) 27,4 c 32,5 bc 30,1 bc 58,1 a 43,8 ab 30,1 bc ** 15,93 SL (mm) 23,2 b 28,3 b 22,6 b 33,1 ab 30,1 b 49,6 a ** 21,87 z MS, 1/2 MS, 1/2 NH4, SH, B5 EN tượng trưng cho mơi trường khống MS, khống đa lượng MS giảm 1/2, khống MS có thành phần NH4NO3 giảm 1/2, khoáng Schenk & Hildebrandt, khoáng Gamborg B5 khoáng Enshi-Shoho; y *, **: khác biệt có ý nghĩa mức p ≤ 0,05 hay p ≤ 0,01; x Các số có chữ giống cột khơng có khác biệt theo trắc nghiệm phân hạng Duncan’s Multiple Range Test Hình Cây nhân sâm bố in vitro ni mơi trường khoáng khác ngày thứ 42 Ghi tên công thức bảng Theo Rothstein & Cregg (2005), tỷ lệ ion NO3‾ /NH4+ môi trường nuôi cấy in vitro có ảnh hưởng lớn đến tăng trưởng hầu hết loại nuôi cấy Do đó, tỷ lệ ion NO3‾ /NH4+ mơi trường cần 92 điều chỉnh cho phù hợp với nhu cầu dinh dưỡng loài thực vật Tỷ lệ ion NO3‾ /NH4+ có cơng thức SH, B5 EN cao (lần lượt 9,5; 12,4 12,3) so với công thức MS, 1/2 MS 1/2 NH4 (lần lượt 1,9; Nguyen Le Thu Minh et al 3,8) Cây sâm bố ni cấy in vitro ni cấy mơi trường khống có tỷ lệ NO3‾ /NH4+ cao cơng thức SH, B5 hay EN có rễ tăng trưởng tốt so với cơng thức sử dụng mơi trường khống MS Aliva (1998) nhận kết tương tự nuôi cấy khoai tây loại mơi trường khống khác Trong nghiên cứu này, hai cơng thức B5 EN có tỷ lệ NO3‾ /NH4+ cao có lẽ chưa phải tối ưu so với nhu cầu sâm bố chính, vậy, rễ phát triển khơng tương đồng KẾT LUẬN Cây sâm bố in vitro tăng trưởng tốt nuôi cấy điều kiện quang tự dưỡng môi trường khống SH khơng bổ sung đường vitamin cường độ ánh sáng 150 µmol m-2 s-1 Việc áp dụng nuôi cấy quang tự dưỡng vi nhân giống sâm bố cần tiếp tục khảo sát với số yếu tố vật lý khác môi trường ni cấy nhằm xây dựng quy trình nhân giống vơ tính hồn chỉnh phục vụ sản xuất lồi theo nhu cầu số địa phương Việt Nam Lời cảm ơn: Đề tài hỗ trợ kinh phí từ Sở Khoa học Cơng nghệ tỉnh Phú Yên (20152017), với hỗ trợ trang thiết bị từ phòng Thí nghiệm Trọng điểm phía Nam Công nghệ tế bào thực vật, Viện Sinh học nhiệt đới, Viện Hàn Lâm KH & CN Việt Nam TÀI LIỆU THAM KHẢO Avilla A., Pereira M., Arguello A., 1998 Nitrogen concentration and proportion of NH4+-N affect potato cultivar response in solid and liquid media HortScience, 33(2): 336-338 Britto D T., Kronzucker H J., 2002 NH4+ toxicity in higher plants: a critical review J Plant Physiol., 159(6): 567-584 Fujiwara K., Kozai T., Watanabe I., 1987 Measurements of carbon dioxide gas concentration in closed vessels containing tissue culture plantlets and estimates of net photosynthesis rates of the plantlets J Agri Meteorol., 43(1): 21-30 Gamborg O L., Miller R A., Ojima K., 1968 Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells Exp Cell Res., 50(1): 151-158 George E F., de Klerk G J., 2008 The components of plant tissue culture media I: macro- and micro-nutrients In: George EF, Hall AM, de Klerk GJ (eds.) Plant Propagation by Tissue Culture, 3rd Edition, 1: 65-102 The Background, Springer, Dordrecht, The Netherlands Phan Duy Hiệp, Nguyễn Trí Minh, Phan Xn Hun, Cao Đình Hùng, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Thanh Hằng, 2014 Nghiên cứu ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng thực vật lên phát sinh hình thái số giống sâm Bố Chính (Hibiscus sagittifolius Kurz) điều kiện in vitro Tạp chí Sinh học, 36(1se): 266-271 DOI: 10.15625/0866-7160/v36n1se.4406 Hori H., 1966 Gravel culture of vegetable and ornamental crops Agric Hort., pp 210 Ngô Thị Ngọc Hương, Đinh Văn Khiêm, Nguyễn Thị Quỳnh, 2015 Ảnh hưởng thành phần khoáng lên sinh trưởng sâm Việt Nam (Panax vietnamensis Ha et Grushv.) nuôi cấy in vitro điều kiện quang tự dưỡng Tạp chí Sinh học, 37(1): 96102 DOI: 10.15625/0866-7160/v37n1.6202 Iarema L., Cláudia Ferreira da Cruz A., Saldanha C W., Dias L L., Vieira R F., Oliveira E J., Otoni W C., 2012 Photoautotrophic propagation of Brazilian ginseng [Pfaffia glomerata (Spreng.) Pedersen], Plant Cell Tiss Org Cult., 110(2): 227-238 Jackson M B., Abbott A J., Belcher A R.,Hall K C., 1987 Gas exchange in plant tissue cultures In:Jackson M.B., Mantell S.H., Blake J (eds) Advances in the Chemical Manipulation of PlantTissue Cultures Monograph 16, British Plant Growth Regulator Group, Bristol pp 57-71 Julkiflee A L., Uddain J., Subramaniam S., 2014 Efficient micropropagation of Dendrobium Sonia-28 for rapid PLBs 93 Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin proliferation Emir J Food Agric., 26(6): 545-551 Kozai T., Fujiwara K., Watanabe I., 1986 Effects of stoppers and vessels on gas exchange rates between-inside and outside of vessels closed with stoppers J Agr Meteorol., 42(2): 119-127 Đỗ Tất Lợi, 2004 Những thuốc vị thuốc Việt Nam Nxb Y học, Hà Nội, trang 813815 Lê Trọng Lư, Nguyễn Thụy Phương Duyên, Hoàng Ngọc Nhung, Phạm Minh Duy, Nguyễn Thị Quỳnh, 2015 Ảnh hưởng hàm lượng NH4NO3 KNO3 lên tăng trưởng oải hương điều kiện ni cấy quang tự dưỡng Tạp chí Cơng nghệ Sinh học, 13(4A): 1313-1319 Morel G., Wetmore R., 1951 Tissue culture of monocotyledons Am J Bot., 38(2): 138140 Murashige T., Skoog E., 1962 A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissues Plant Physiol.,15(3): 473497 Nguyen T Q., Kozai T., 2001 Photoautotrophic micropropagation of tropical and subtropical woody plants, In: Morohoshi N., Komamine A (eds.) Molecular Breeding of Woody Plants, Elsevier Science B.V., Amsterdams, The Nethelands pp 335-334 Nguyen T Q., Kozai T., 2005 Photoautotrophic 94 micropropagation of woody species In : Kozai T., Afreen F., Zobayed S.M.A (eds.) Photoautotrophic (sugar-free medium) micropropagation as new micropropagation and transplant production system, Springer, Dordrecht, The Netherlands pp 123-146 Nguyen T Q., Xiao Y., Kozai T., 2016 Photoautotrophic micropropagation In: Kozai T., Niu G., Takagaki M (eds.) Plant Factory-An indoor vertical farming system for efficient quality food production Academic Press, California, USA pp 271283 Oh W., Kim J., Kim Y.H., Lee I.J., Kim K.S., 2015 Shoot elongation and gibberellin contents in Cyclamen persicum are influenced by temperature and light intensity Hortic Environ Biotechnol., 56(6): 762-768 Rothstein D E., Cregg B M., 2005 Effects of nitrogen form on nutrient uptake and physiology of Fraser fir (Abies fraseri) For Ecol Manag., 219(1): 69-80 Schenk R V., Hildebrandt A C., 1972 Medium and techniques for induction and growth of monocotyledonous plant cell cultures Can J Bot., 50(1): 199-204 Villamor C C., 2010 Influence of media strength and sources of nitrogen on micropropagation of ginger, Zingiber officinale Rosc E-Int Sci Res J., 2(2): 150-155 Nguyen Le Thu Minh et al EFFECTS OF SUCROSE CONCENTRATION, VITAMINS, LIGHT INTENSITY AND MINERAL COMPONENTS ON GROWTH OF Hibiscus sagittifolius Kurz CULTURED IN VITRO Nguyen Le Thu Minh1, Nguyen Thuy Phuong Duyen1, Le Thi Tuyet Anh2, Nguyen Thi Quynh1 Institute of Tropical Biology, VAST Center for Research and Manufacturing of Pharmaceutical Material in Central Vietnam, Tuy Hoa, Phu Yen Province SUMMARY Hibiscus sagittifolius Kurz is one herb plant with tuber roots used in traditional medicine thanks to numerous pharmaceutical properties, such as brain stimulus, vitality strengthening, anti-neurasthenia, etc Seed germination rate of H sagittifolius is very low in nature; therefore, aiming to create the large number of uniform, high quality plants, factors affecting the propagation process including effects of sugar concentration, vitamins, light intensity and culture mineral components were investigated After 42 days of culture, in vitro leafy nodal cuttings of H sagittifolius cultured photoautotrophically in polypropylene bags under high light intensity, 150 µmol m-2 s-1, photoperiod of 12 h d-1, room temperature at 25oC ± 2oC and relative humidity (RH) of 55% ± 5%, showed a better growth than that cultured photomixotrophically or photoautotrophically under low light intensity, 75 µmol m-2 s-1 On different culture media (MS, 1/2 MS, 1/2 NH4, SH, B5, EN), in vitro leafy nodal cuttings of H sagittifolius cultured photoautotrophically on SH medium had the greatest increased fresh weight (384.9 mg/plant), and their root growth conformed to their shoot growth better than those in other treatments on day 42 This study proved that H sagittifolius plants had the best growth when cultured in vitro in polypropylene bags having two paper membranes, on SH mineral medium without sucrose and vitamins, under light intensity of 150 µmol m-2 s-1, photoperiod of 12 h d-1, room temperature at 25oC ± 2oC and RH of 55% ± 5% Keywords: Hibiscus sagittifolius, light intensity, mineral components, photoautotrophic, photomixotrophic Citation: Nguyen Le Thu Minh, Nguyen Thuy Phuong Duyen, Le Thi Tuyet Anh, Nguyen Thi Quynh, 2017 Effects of sucrose concentration, vitamins, light intensity and mineral components on growth of Hibiscus sagittifolius Kurz cultured in vitro Tap chi Sinh hoc, 39(1): 86-95 DOI: 10.15625/08667160/v39n1.8468 *Corresponding author: qtnguyen_vn@yahoo.com Received July 2016, accepted 20 March 2017 95 ... cấy QTD (chủ yếu nồng độ CO2 cường độ ánh sáng) chưa phù hợp để sâm Pfaffia phát huy khả tự dưỡng điều kiện in vitro Ảnh hưởng thành phần khoáng lên tăng trưởng sâm bố Thành phần khống yếu tố... nghiệm) phần mềm MSTATC phiên 2.10 Đại học bang Michigan, Hoa Kỳ vẽ đồ thị phần mềm Excel 2010 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng nồng độ đường, vitamin cường độ ánh sáng lên tăng trưởng sâm bố ni cấy in. .. ni cấy thích hợp góp phần xây dựng quy trình vi nhân giống sâm bố chính, nghiên cứu thực với thí nghiệm Ảnh hưởng cường độ ánh sáng diện đường, vitamin môi trường nuôi cấy lên tăng trưởng sâm bố