Nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp và sinh sản của lợn (PRRS) ở việt nam và một số đặc tính bệnh biến tế bào MARC145

luận văn

Bộ giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiƯp hµ néi Trần thị hà NGHIấN CU PHÂN LẬP VI RÚT GÂY HỘI CHỨNG RỐI LOẠN HÔ HẤP VÀ SINH SẢN CỦA LỢN (PRRS) Ở VIỆT NAM VÀ MỘT SỐ ðẶC TÍNH BỆNH BIẾN TẾ BÀO MARC145 luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành : Thú y M· sè : 60.62.50 Ng−êi h−íng dÉn khoa häc : pgs.ts nguyễn hữu nam Hà Nội - 2010 Li cam đoan Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các kết số liệu thể luận văn trung thực chưa sử dụng ñể bảo vệ học vị Tơi cam đoan thơng tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hà Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp i LỜI CẢM ƠN ðể hoàn thành luận văn tốt nghiệp cố gắng nỗ lực thân, tơi nhận ñược nhiều giúp ñỡ quý báu cá nhân tập thể Nhân dịp cho phép tơi bày tỏ lịng biết ơn chân thành tới: Ban giám hiệu, thầy cô giáo Viện ðào Tạo Sau ðại Học, Khoa Thú Y - Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội đào tạo truyền tải kiến thức khoa học cho suốt trình học tập trường Ban lãnh đạo Viện Thú Y, tập thể mơn Hóa sinh, Miễn dịch - Bệnh lý, nơi công tác nơi tơi thực đề tài ðặc biệt, tơi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Thầy giáo: (1) PGS.TS Nguyễn Hữu Nam - Trưởng khoa Thú Y - Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội; (2) TS Nguyễn Viết Khơng - Trưởng mơn Hóa sinh- Miễn dịch- Bệnh lý, Viện Thú y; (3)TS Ken Inui- chuyên gia FAO - người thầy ñã trực tiếp hướng dẫn giúp đỡ tơi suốt q trình thực hồn thành luận văn Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến gia đình người ln tạo điều kiện tốt cho tơi hồn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn! Tác giả luận văn Trần Thị Thanh Hà Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT cDNA Complementary Deoxyribonucleic Acid CPE Cytopathogenic Effect (Bệnh tích tế bào) DNA Deoxyribonucleic Acid ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay FAO Food and Agriculture Organization (Tổ chức Nông - Lương liên hiệp quốc FBS Fetal Bovine Serum HSMDBL Bộ mơn Hóa sinh-Miễn dịch-Bệnh lý IFAT Indirect Fluorescent Antibody Test IPMA Immuno- Peroxidase Monolayer Assay MEM Minimum Eagle Medium OIE PBS Office Internationable des Epizooties (Tổ chức bảo vệ sức khỏe ñộng vật giới) Phosphate Buffer Saline PCR Polymerase Chain Reaction PRRS Porcine Reproductive and Resiratory Syndrome: PRRSV Porcine Reproductive and Resiratory Syndrome Virus RNA Ribonucleic Acid RT-PCR Reverse Transcriptase - Polymerase Chain Reaction TCID50 50% Tissue Culture Infectious Dose: liều gây nhiễm 50% tế bào VNT Virus Neutralization Test: Phản ứng trung hòa vi rút AEC 3- Amino-9-Ethycarbazone (cơ chất) Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iii MỤC LỤC ðẶT VẤN ðỀ Mục tiêu ñề tài Ý nghĩa ñề tài TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Tình hình nghiên cứu ngồi nước 1.2 Tình hình nghiên cứu nước 1.3 Căn bệnh 1.3.1 Cấu trúc Arteriviruses 1.3.2 Các chủng vi rút phân bố 10 1.3.3 ðường truyền lây 11 1.3.4 Sức ñề kháng 12 1.3.5 Triệu chứng lâm sàng 13 1.3.6 Bệnh tích 14 1.3.7 Chẩn đốn 15 NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22 2.1 ðối tượng nghiên cứu 22 2.2 Nội dung nghiên cứu 22 2.3 Cách tiếp cận 22 2.4 ðịa ñiểm, thời gian nghiên cứu 22 2.5 Nguyên liệu 22 2.5.1 Bệnh phẩm 22 2.5.2 Kháng nguyên chuẩn, kháng thể chuẩn 22 2.5.2 Vật liệu, hóa chất, sinh phẩm 23 2.6 Phương pháp nghiên cứu 25 2.6.1 Nuôi cấy tế bào Marc145 25 2.6.2 Phân lập vi rút PRRS 26 2.6.3 Phản ứng RT-PCR 26 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp iv 2.6.4 Phản ứng IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay) 28 2.6.5 Chuẩn ñộ vi rút PRRS 30 2.6.6 Nhuộm tế bào nuôi cấy phiến kính mỏng 31 2.6.7 Cách tính tính giá trị TCID50/ml đọc kết 33 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết nghiên cứu đặc tính nhân lên vi rút RRRS tế bào Marc 145 34 3.2.1 ðặc tính nhân lên gây bệnh biến tế bào vi rút PRRS chủng Việt Nam 36 3.2.2 ðặc tính nhân lên gây bệnh biến tế bào vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ.37 3.2.3 ðặc tính nhân lên gây bệnh biến tế bào vi rút PRRS chủng Châu Âu 39 3.2.4 Kết xác định có mặt vi rút PRRS phương pháp RT-PCR 40 3.2.5 Kết xác ñịnh có mặt vi rút PRRS phương pháp IPMA 41 3.2.6 So sánh đặc tính nhân lên gây bệnh tế bào chủng vi rút ñại diện 42 3.3 Quy trình phân lập vi rút ñiều kiện Việt Nam 44 3.4 Kết phân lập vi rút PRRS số ñịa phương 48 3.4.1 Kết phân lập vi rút từ mẫu huyết 49 3.4.2 Kết phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm 50 3.4.3 Kết xác ñịnh có mặt vi rút PRRS phương pháp RT-PCR 51 3.4.4 Kết xác định có mặt vi rút PRRS phương pháp IPMA 51 3.4.5 Chuẩn độ vi rút PRRS mơi trường tế bào Marc 145 52 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 54 KẾT LUẬN 54 ðỀ NGHỊ 54 TÀI LIỆU THAM KHẢO 55 Tiếng việt 55 Tiếng anh 56 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp v DANH MỤC BẢNG Bảng 01-01 Sự tương ñồng chủng vi rút PRRS 10 Bảng 02-01 Trình tự nucleotide primer đặc hiệu cho PRRS 26 Bảng 02-02 Thành phần phản ứng sinh tổng hợp cDNA 27 Bảng 02-03 Thành phần phản ứng PCR 27 Bảng 02-04 Chu trình nhiệt phản ứng PCR 28 Bảng 03-01 Kết quan sát bệnh tích tế bào sau nhuộm Hematoxylin Eosin 36 Bảng 03-02 Kết theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Việt Nam 37 Bảng 03-03 Kết theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Bắc Mỹ 38 Bảng 03-04 Kết theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Châu Âu 39 Bảng 03-05 kết so sánh bệnh biến tế bào chủng ñại diện 43 Bảng 03-06 Kết xác ñịnh mật ñộ tình trạng phát triển tế bào Marc145 46 Bảng 03-07 Kết theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) phân lập vi rút từ huyết 49 Bảng 03-08 Kết theo dõi bệnh tích tế bào (CPE) phân lập vi rút từ phủ tạng 50 Bảng 03-09 Kết xác định có mặt vi rút PRRS phương pháp RT-PCR 51 Bảng 03-10 Kết xác định có mặt vi rút PRRS phương pháp IPMA 52 Bảng 03-11 Kết chuẩn ñộ vi rút PRRS chủng phân lập 53 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vi DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 01-01 Tình hình dịch bệnh PRRS từ năm 2007 - 2010 Hình 01-02 ðại thực bào sau bị vi rút PRRS xâm nhập Hình 01-03 ðại thực bào chưa bị vi rút PRRS xâm nhập Hình 01- 04 Mơ hình cấu trúc vi rút PRRS Hình 01- 05 Cấu trúc genome vi rút PRRS Hình 01-06 Sự tương ñồng chủng vi rút PRRS 11 Hình 01-07 Sơ đồ ngun lý phản ứng RT-PCR 19 Hình 03-01 Sự biến ñổi tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h hình ảnh nhuộm tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h gây nhiễm vi rút PRRS 35 Hình 03-02 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng Việt Nam 37 Hình 03-03 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm chủng vi rút Bắc Mỹ 38 Hình 03-04 Hình ảnh bệnh tích tế bào gây nhiễm vi rút Châu Âu 39 Hình 03-05 Hình ảnh điện di agarose gel sản phẩm PCR-PRRS, nhuộm Ethidium bromide 40 Hình 03-06 Kết thực phản ứng IPMA ñối với chủng ñại diện 42 Hình 03-07 Tế bào Marc145 46 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp vii ðẶT VẤN ðỀ Trong năm gần đây, với phát triển khơng ngừng ngành chăn nuôi lợn nước ta, bệnh lợn xuất ngày nhiều mối đe dọa nhà chăn ni Trong vô số bệnh truyền nhiễm nguy hiểm gây bệnh cho lợn phải kể đến Hội chứng Rối loạn hơ hấp sinh sản (Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome PRRS) ðây bệnh vi rút gây Bệnh có đặc điểm sốt cao, biếng ăn, rối loạn sinh sản, gây chết ñối với lợn con, ho có dấu hiệu viêm phổi lợn lứa tuổi Hội chứng Rối loạn hô hấp sinh sản gây thiệt hại lớn ñối với ngành chăn nuôi lợn Việt nam giới Hàng năm, Mỹ ước tính thiệt hại PRRS gây mức 720 triệu la Mỹ [2] Ở Việt nam, thiệt hại kinh tế PRRS gây chưa ước tính, nhiên hai năm 2007 2008 hàng loạt trại lợn ñã phải tiêu huỷ PRRS Bệnh xếp vào nhóm bệnh nguy hiểm danh mục bệnh Tổ chức sức khỏe ñộng vật giới Cho ñến nay, lợn ñộng vật mắc hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản Vi rút PRRS thường lan truyền qua đường tiếp xúc trực tiếp, khơng khí, loại dịch tiết, phân, nước tiểu [29,31] Tại phổi vi rút xâm nhập nhân lên ñại thực bào Bình thường đại thực bào bắt tiêu diệt vi khuẩn vi rút xâm nhập vào thể, vi rút PRRS khơng bị tiêu diệt mà cịn nhân lên ñại thực bào với số lượng lớn, làm cho chức hệ thống bảo vệ thể suy giảm nguy bị nhiễm bệnh kế phát tăng lên ðiều giải thích lợn bị PRRS người ta thường khó xác định ngun nhân gây bệnh [39] Ở Việt nam chưa có nhiều nghiên cứu PRRS, để làm tiền ñề cho nghiên cứu sâu bệnh học vi rút PRRS, đồng Trường ðại học Nơng nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp thời muốn phòng chống PRRS Việt nam cần thiết phải có vi rút phân lập Trong phân lập vi rút việc xác ñịnh ñược ñặc tính nhân lên vi rút, đặc tính gây bệnh biến tế bào ni tiêu chí đánh giá phân lập vi rút ngăn trở vi rút phá huỷ tế bào phản ứng trung hồ huyết thanh, đánh giá mức độ miễn dịch lợn tiêm phịng vac-xin cần thiết Xuất phát từ u cầu thực tế chúng tơi tiến hành ñề tài “Nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) Việt Nam số đặc tính bệnh biến tế bào Marc145” Mục tiêu ñề tài Thiết lập quy trình phân lập vi rút PRRS phịng thí nghiệm điều kiện Việt Nam, xác định ñược cách ñánh giá bệnh biến tế bào gây nhiễm vi rút PRRS kính hiển vi dựa vào giám ñịnh phương pháp tham chiếu áp dụng quy trình phân lập vi rút PRRS lưu hành Ý nghĩa ñề tài Vi rút PRRS thường khơng gây phá hủy tế bào từ lần đầu phân lập, việc theo dõi ñánh giá kết phân lập không giống trường hợp vi rút gây phá hủy hàng loạt tế bào cảm thụ ðộc lực mức phá hủy/gây bệnh biến tế bào nuôi vi rút PRRS Việt Nam khác nhau, việc xác lập ñiều kiện phân lập ñánh giá biến ñổi vi thể tế bào nhiễm vi rút PRRS bước khởi ñầu quan trọng cho việc thường quy hóa phân lập vi rút PRRS phịng thí nghiệm Bước đầu phân lập vi rút lưu hành, ngồi ý nghĩa đánh giá tính ổn định lập lại phương pháp, cịn có ý nghĩa thực tiễn quan trọng việc tạo nguồn chủng, nguồn gen vi rút cho nghiên cứu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... cầu thực tế chúng tơi tiến hành ñề tài ? ?Nghiên cứu phân lập vi rút gây hội chứng rối loạn hô hấp sinh sản lợn (PRRS) Vi? ??t Nam số đặc tính bệnh biến tế bào Marc145? ?? Mục tiêu ñề tài Thiết lập quy... đặc tính nhân lên vi rút RRRS tế bào Marc 145 34 3.2.1 ðặc tính nhân lên gây bệnh biến tế bào vi rút PRRS chủng Vi? ??t Nam 36 3.2.2 ðặc tính nhân lên gây bệnh biến tế bào vi rút PRRS chủng Bắc... loạt tế bào cảm thụ ðộc lực mức phá hủy /gây bệnh biến tế bào ni vi rút PRRS Vi? ??t Nam khác nhau, vi? ??c xác lập ñiều kiện phân lập ñánh giá biến ñổi vi thể tế bào nhiễm vi rút PRRS bước khởi ñầu