RT-PCR
để khẳng ựịnh chắc chắn sự có mặt hay không của vi rút PRRS trong các mẫu gây nhiễm, chúng tôi tiến hành giám ựịnh RNA của vi rút 3 chủng ựại diện bằng phương pháp RT-PCR.
Chuẩn bị RNA bằng phương pháp Trizol
Chuẩn bị cDNA bằng phương pháp sử dụng random primer PCR sử dụng cặp mồi (primer) F2R2 với ựộ dài là 462bp Kết quả thực hiện PCR ựược thể hiện ở hình 03-05
Hình 03-05. Hình ảnh ựiện di agarose gel sản phẩm PCR, nhuộm Ethidium bromide
[Ghi chú: Cột 01: vi rút PRRS chủng Châu Âu (EU); côt 02: thang chuẩn DNA (marker), vạch 100bp; cột 03: vi rút PRRS chủng Việt nam (VN); cột 04: ựối chứng âm (không có vi rút, chỉ có tế bào marc145); cột 05: ựối chứng dương; cột 06: vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ (NA)].
EU MK VN Ctrl- Ctrl+ NA
462bp
EU MK VN Ctrl- Ctrl+ NA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
Nhận xét: Qua hình ảnh chạy ựiện di sản phẩm PCR cho thấy mẫu ựối chứng âm không lên vạch, mẫu ựối chứng dương cho vạch 462bp. Chủng vi rút VN (do bộ môn HSMDBL cung cấp) và 2 chủng vi rút PRRS có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và Châu Âu ựều cho vạch ựặc hiệu 462 bp khi sử dụng cặp mồi (primer) F2R2 của bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú ỵ Chứng tỏ việc gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào Marc145 thành công.
3.2.5. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA
Ngoài phương pháp RT-PCR chúng tôi tiến hành phương pháp thứ 2 ựó là phương pháp IPMA ựể xác ựịnh sự có mặt của vi rút dựa vào cơ sở miễn dịch học. Phản ứng IPMA có ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu cao, phương pháp này thường chỉ ựược sử dụng trong các phòng thắ nghiệm có ựiều kiện nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút.
Mẫu vi rút phân lập ựã ựược chuẩn ựộ ựể biết liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50). Trong phản ứng này chúng tôi sử dụng liều 500TCID50/ml gây nhiễm trên ựĩa tế bào Marc145 (100ộl/giếng, ựĩa 96 giếng), 2 ngày sau khi gây nhiễm vi rút xuất hiện bệnh tắch trên tế bào gây nhiễm. Chúng tôi tiến hành cố ựịnh tế bào và thực hiện phản ứng theo trình tự các bước như trong phần phương pháp. Trong thắ nghiệm này chúng tôi bố trắ mẫu ựối chứng huyết thanh dương và mẫu ựối chứng huyết thanh âm (do chuyên gia FAO cung cấp). Huyết thanh ựược pha loãng theo tỷ lệ 1/40, 1/160, 1/640, 1/1280, 1/2560 kết quả thắ nghiệm ựược trình bày hình 03-06.
Nhận xét: (1) đối chứng dương có ựám tế bào bắt màu ựỏ ựậm nhân từ trong nguyên sinh chất. Lượng tế bào bắt màu ựậm trong nguyên sinh chất giảm dần từ khi ựộ pha loãng huyết thanh tăng lên. Phản ứng IPMA hợp cách. đối chứng âm các tế bào bắt màu hồng ựều, rải rác có ựám tế bào bắt mà ựậm nhưng không bắt mầu ựậm ở trong nguyên sinh chất. Vì vậy ựược ựánh giá âm tắnh. Mẫu xét nghiệm bắt màu giống ựối chứng dương, tuy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42
nhiên mức ựộ dương tắnh ựạt ở các ựộ pha loãng vi rút khác nhau tùy theo từng chủng vi rút.
Hình 03-06. Kết quả thực hiện phản ứng IPMA ựối với 3 chủng ựại diện
[Ghi chú: Cột 1: Gây nhiễm vi rút chủng Việt Nam; Cột 2: Gây nhiễm vi rút chủng Châu Âu; cột 3: gây nhiễm vi rút chủng Bắc Mỹ; cột 4: ựối chứng âm; cột 05: ựối chứng dương].
(2) Qua hình 03-06 cho thấy: đối với vi rút chủng Việt Nam kết quả IPMA ựạt 1/1280, tương ựương với kết quả khi thực hiện ựối với vi rút chủng Bắc Mỹ. Ngược lại kết quả IPMA ựối với vi rút chủng Châu Âu chỉ ựạt 1/640. Tuy nhiên, cả 3 chủng vi rút ựại diện ựều cho kết quả IPMA dương tắnh khi sử dụng huyết thanh chuẩn hay nói cách khác việc gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào Marc145 thành công.
3.2.6. So sánh ựặc tắnh nhân lên và gây bệnh trên tế bào của 3 chủng vi rút ựại diện
Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào sau gây nhiễm của 3 chủng ựại diện ựược thể hiện trong bảng 03-05.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43
Bảng 03-05. kết quả so sánh bệnh biến tế bào các chủng ựại diện
TT Thời gian (giờ) Tỷ lệ % có CPE
(Chủng Châu Âu) Tỷ lệ % có CPE (Chủng Bắc Mỹ) Tỷ lệ % có CPE (Chủng Việt Nam) 1 0 0 0 0 2 24 10 40 5 3 48 20 90 20 4 72 50 100 40 5 96 100 60 6 120 60
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Nhận xét:
(1) Qua các thắ nghiệm trên cho thấy sự khác biệt về bệnh biến tế bào giữa chủng phân lập ở Việt Nam và 2 chủng vi rút tham chiếu (chủng vi rút Châu Âu và chủng vi rút Bắc Mỹ) là: Sự phá hủy tế bào hoàn toàn ở 2 chủng tham chiếụ Có 100% tế bào bị phá hủy ở ngày thứ 3 ựối với chủng vi rút Bắc Mỹ và khoảng 90% tế bào bị phá hủy khi gây nhiễm chủng vi rút có nguồn gốc từ Châu Âụ Trong khi ựó chủng vi rút ở Việt Nam gây biến ựổi tế bào theo kiểu các tế bào tụ lại thành chùm nho nổi cộm lên nhưng không bị bong ra khỏi ựáy chai nuôi và ở phắa dưới vẫn còn lớp tế bào bám ựáỵ
(2) Các chủng Bắc Mỹ và Châu Âu ựược phân lập lại từ những chủng vi rút vac-xin, các chủng này ựã thắch ứng trên tế bào, gây bệnh biến có tắnh chất phá hủy tế bào sau gây nhiễm 24 - 48 giờ. Ngược lại, chủng ựược phân lập tại Việt Nam chưa qua nhiều lần tiếp ựời trên tế bào nên bệnh biến chủ yếu quan sát ựược là hình ảnh tế bào co cụm sau gây nhiễm 48 - 96 giờ. Sự phá hủy có thể nhanh hay chậm hoặc không có tùy ựộc lực. Chủng do phòng thắ nghiệm cung cấp là chủng có ựộc lực cao có tác dụng phá hủy tế bào ở 48 giờ sau gây nhiễm. Nhưng trong thực tế có thể hoàn toàn không nhận thấy sự phá hủy của tế bào sau 5 ngày vì vậy việc nhận biết chủ yếu dựa vào dấu hiệu các tế bào co cụm sau khi gây nhiễm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44
3.3. Quy trình phân lập vi rút ở ựiều kiện Việt Nam. Chuẩn bị tế bào: Chuẩn bị tế bào:
Mở giống tế bào:
Bước 1: Chuẩn bị ựầy ựủ môi trường, chai nuôi, dụng cụ thắ nghiệm dùng cho nuôi cấy tế bào, buồng cấy, và các máy móc cần thiết trong phòng thắ nghiệm.
Bước 2: Lấy tế bào từ nitơ lỏng ra, ngâm ngay ống tế bào vào trong cốc
nước nóng 370C hoặc nắm chặt trong tay cho tế bào tan rạ Dùng pipet hút
hết dung dịch tế bào vào ống ly tâm ựã có sẵn 10 ml môi trường, ly tâm 1500 vòng trong 10 phút ựể loại bỏ dung dịch bảo quản. đánh tan cặn tế bào trong 1- 2 ml môi trường, và nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa ựủ 8ml môi trường. Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Nhân giống tế bào Marc145 trên chai nuôi (T25, T75, T150...)
Bước 1:Rửa tế bào
Chai T25 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Bước 2: Trypsin hóa
Cho 2ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ Hút bỏ 1ml Trypsin. để tế bào trong tủ ấm 370C cho tế bào tách nhau hoàn toàn.
Vỗ nhẹ chai ựể tế bào bong hoàn toàn.
Bước 3: đánh tan tế bào
Cho 3ml MEM 5% FBS ựánh tan cặn tế bàọ Ly tâm tế bào ở 1500 vòng trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, ựánh tan cặn tế bào trong 2 ml môi trường.
đếm tế bào: Hút 100 ộl tế bào sang 1 ống Eppendorf 1,5ml, thêm 100ộl dung dịch tryppan blue 0,4%. Trộn ựều, ựếm bằng buồng ựếm Neubauer. Sau ựó ra chai theo yêu cầụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 45
Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Nhân tế bào Marc 145 trên ựĩa 96 giếng, 6 giếng:
Bước 1:
Chai T75 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Cho 5ml PBS láng ựều mặt tế bào, hút bỏ PBS.
Bước 2: Trypsin hóa
Cho 3ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ Hút bỏ 2ml Trypsin. để tế bào trong tủ ấm 370C cho tế bào tách nhau hoàn toàn.
Vỗ nhẹ chai ựể tế bào bong hoàn toàn.
Bước 3: đánh tan tế bào
Cho 10ml MEM 5% FBS ựánh tan cặn tế bàọ
đếm tế bào: 100ộl huyễn dịch tế bàơ100ộl Trypan bluẹ đếm tế bào trên buồng ựếm. Số tế bào=Tổng số tế bào 4 góc/4*2*104.
Pha tế bào mật ựộ 5-8x104cell/ml (5000-8000 tế bào/giếng), 10ml/ựĩa 96 giếng và 18ml/ ựĩa 6 giếng, trong môi trường MEM 5% FBS.
Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2 sau 1 ngày bám ựáy 100% gây nhiễm vi rút.
Nhận xét: Kết quả của việc phân lập và gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào phụ thuộc vào tình trạng phát triển của tế bào và mật ựộ tế bàọ Do vậy, ựể có lượng tế bào Marc145 ựủ cung cấp cho công tác nghiên cứu về vi rút PRRS trong phòng thắ nghiệm, ựòi hỏi phải có những thắ nghiệm ựể chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy tế bàọ Ở ựây các thắ nghiệm chủ yếu như: Xác ựịnh mật ựộ tế bào khi nuôi cấy, thời gian, và % CO2 ựể tế bào phát triển tốt nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 46
Các thắ nghiệm ựược thiết kế như sau: Tế bào ựược nuôi ở các mật ựộ khác nhau bắt ựầu từ nồng ựộ: 104 tế bào/ml, sau ựó tăng dần theo cơ số 2 và theo dõi thời gian, chỉnh lượng CO2 sao cho phù hợp nhất ựể các chai tế bào phủ ựáy 100% theo như dự kiến.
Sau khi tối ưu hóa các ựiều kiện nuôi cấy tế bào, kết quả ựược chúng tôi tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 03-06. Kết quả xác ựịnh mật ựộ và tình trạng phát triển của tế bào Marc145
TT Thời gian
(giờ)
điều kiện Số lượng tế
bào/ml Tình trạng tế bào phủ ựáy (%) 1 0 370C, 3%CO2 105 0 2 24 370C, 3%CO2 2 x 105 50 3 48 370C, 3%CO2 5 x 105 75 4 72 370C, 3%CO2 2 x 106 100
Qua bảng 03-06, ựể có tế bào ở trạng thái ựang phát triển và phủ ựáy
100% sau 1; 2 ngày thì lượng tế bào khi cấy chuyển cần 5x105 tế bào /ml;
2x105 tế bào/ml, trong ựiều kiện 370C, 3%CO2. Với mật ựộ và tình trạng phát triển của tế bào như trên, các thắ nghiệm về phân lập và gây nhiễm vi rút, nhân giống vi rút... ựều ựạt kết quả tốt.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 47
Sau khi thiết lập và tối ưu hóa các ựiều kiện, quy trình phân lập vi rút PRRS gồm những bước như sau:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào phân lập
Ra chai tế bào ở mật ựộ: 5x105 tế bào /ml; 2x105 tế bào/ml, trong ựiều kiện 370C, 3%CO2 (tùy theo thời gian cần tế bào).
Bước 2: Gây nhiễm vi rút
Chuẩn bị bệnh bệnh phẩm 10% trong môi trường RPMI
Mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch amidan...
Cân bệnh phẩm, ghi lại khối lượng bệnh phẩm.
Nghiền bệnh phẩm bằng thạch anh trong cối chày sứ ựã ựược hấp tiệt trùng. Bổ sung RPMI ựể ựược huyễn dịch 10%.
Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút ở 40C (hoặc lọc qua filter 0,45 ộm). Thu huyễn dịch phắa trên vào Eppendorf, loại bỏ cặn.
Một phần sử dụng ựể phân lập còn 1 phần dán nhãn thông tin bệnh phẩm. Bảo quản -300C.
Trường hợp mẫu bệnh phẩm là máu thì phải chắt huyết thanh sau ựó gây nhiễm như bình thường.
Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS
Soi kắnh kiểm tra tế bào trước khi gây nhiễm phải ựảm bảo tế bào mọc dày thành 1 lớp
Loại bỏ môi trường cũ
Thêm 200ộl huyễn dịch vi rút vào mỗi T25
Nuôi trong tủ ấm 370C, 3% CO2 theo dõi bệnh biến tế bào hàng ngày trong 5-7 ngàỵ
Bước 3: Quan sát tế bào và ựọc kết quả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 48
Tùy theo từng chủng vi rút phân lập ựược mà bệnh biến tế bào xuất hiện khác nhau: (1) Có nhiều ựám tế bào co cụm; hoặc (2) Tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Mẫu âm tắnh: Tế bào mọc thành một lớp.
Bước 4: Thu vi rút
Việc thu huyễn dịch vi rút sẽ ựược thực hiện sau 3- 5 ngày, tùy theo mức ựộ hủy hoại tế bào của chủng vi rút có trong bệnh phẩm.
Thu vi rút vào ống ly tâm 15. Bảo quản -800C.
Bước 5: Xác ựịnh lại sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR hoặc IPMA
để khẳng ựịnh lại chắc chắn sự có mặt của vi rút PRRS trong mẫu phân lập, cần thiết sau khi thu hoạch vi rút phải ựược kiểm tra lại bằng phản ứng RT-PCR hoặc IPMA (các bước thực hiện 2 phương pháp này ựã ựược trình bày trong phân phương pháp nghiên cứu).
Nhận xét: Hầu hết các ựiều kiện trong quy trình phân lập vi rút PRRS mà chúng tôi thiết lập trong ựược trong khi tối ưu hóa ở ựiều kiện phòng thắ nghiệm Việt Nam ựều phù hợp với hướng dẫn của OIE, tuy nhiên có một số thay ựổi ựể phù hợp với ựiều kiện phòng thắ nghiệm Việt Nam như : điều
chỉnh lượng CO2 từ 5% xuống 2,5-3%, sau quá trình tripsin hóa không có
bước ly tâm ựể loại bỏ tripsin vì lượng tripsin ựã ựược bỏ bớt sau khi láng mặt thảm tế bào ...
3.4. Kết quả phân lập vi rút PRRS ở một số ựịa phương
Mẫu huyết thanh và mẫu phủ tạng của lợn nghi mắc bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp ựược lấy từ các tỉnh Hải Dương, Bắc Giang, Quảng Nam (mẫu do bộ môn HSMDBL cung cấp).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 49
3.4.1. Kết quả phân lập vi rút từ mẫu huyết thanh
Mẫu huyết thanh sau khi qua lọc 0.45ộm, ựược gây nhiễm trên tế bào Marc145. Việc phân lập thường ựược tiến hành khi thảm tế bào ựã bám ựáy 100% trên chai T25 hoặc ựĩa 6-24 giếng [12,32,37,45]. Khác với các loại vi rút khác, khi phân lập vi rút PRRS cần bổ sung thêm 5% huyết thanh bào thai bê vào môi trường nuôi cấỵ Sau ựó Nuôi trong tủ ấm 370C, 3%CO2
theo dõi bệnh biến tế bào hàng ngàytrong 5-7 ngày và so sánh với mẫu ựối
chứng.
Bảng 03-07. Kết quả theo dõi bệnh tắch tế bào (CPE) phân lập vi rút từ huyết thanh
TT Nguồn gốc Số mẫu phân lập Số có CPE Tỷ lệ (%)
1 Hải Dương 32 13 40,62
2 Bắc Giang 11 6 54,54
3 Quảng Nam 45 11 24,44
Tổng 88 30 34,09
Nhận xét: (1) Sau khi tế bào phát triển và phủ ựáy 100%, chúng tôi tiến hành gây nhiễm vi rút. Tế bào sau khi gây nhiễm ựược nuôi trong tủ ấm 370C có 3%CO2, và theo dõi bệnh tắch tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vi trong vòng 3- 5 ngày (Tùy theo ựộc lực của từng chủng vi rút). Những mẫu có biểu hiện CPE sẽ ựược thu và bảo quản trong tủ lạnh -800C, ựến khi giám ựịnh lại sự có mặt của vi rút bằng các phương pháp khác.
(2) Tổng số 88 mẫu huyết thanh ựược phân lập cho kết quả 30 mẫu có CPE, tỷ lệ có CPE trung bình là 34,09 %. Tỷ lệ có CPE cao nhất từ mẫu có nguồn gốc ở Bắc Giang(54,54%), tiếp ựến là mẫu ựược lấy từ các tỉnh Hải Dương (40,62%), và mẫu ắt có khả năng phân lập ựược vi rút nhất ựược lấy từ Quảng Nam (24,44%), kết quả phân lập của chúng tôi cũng phù hợp với kết quả phân lập của các tác giả trên thế giới [12,45,21]. Việc phân lập ựược
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 50
vi rút phụ thuộc vào rất nhiều yếu tố như: cách lấy mẫu, bảo quản, vận chuyển mẫu, phương pháp phân lập, mật ựộ tế bào, môi trường dùng trong phân lập...[39,48].
3.4.2. Kết quả phân lập vi rút từ mẫu bệnh phẩm
Chúng tôi tiến hành gộp mẫu ựể phân lập, mỗi nhóm từ 2-5 mẫu phủ tạng ựược nghiền với thủy tinh thạch anh theo tỷ lệ 1/10 trong môi trường