Chuẩn bị tế bào:
Mở giống tế bào:
Bước 1: Chuẩn bị ựầy ựủ môi trường, chai nuôi, dụng cụ thắ nghiệm dùng cho nuôi cấy tế bào, buồng cấy, và các máy móc cần thiết trong phòng thắ nghiệm.
Bước 2: Lấy tế bào từ nitơ lỏng ra, ngâm ngay ống tế bào vào trong cốc
nước nóng 370C hoặc nắm chặt trong tay cho tế bào tan rạ Dùng pipet hút
hết dung dịch tế bào vào ống ly tâm ựã có sẵn 10 ml môi trường, ly tâm 1500 vòng trong 10 phút ựể loại bỏ dung dịch bảo quản. đánh tan cặn tế bào trong 1- 2 ml môi trường, và nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa ựủ 8ml môi trường. Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Nhân giống tế bào Marc145 trên chai nuôi (T25, T75, T150...)
Bước 1:Rửa tế bào
Chai T25 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Bước 2: Trypsin hóa
Cho 2ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ Hút bỏ 1ml Trypsin. để tế bào trong tủ ấm 370C cho tế bào tách nhau hoàn toàn.
Vỗ nhẹ chai ựể tế bào bong hoàn toàn.
Bước 3: đánh tan tế bào
Cho 3ml MEM 5% FBS ựánh tan cặn tế bàọ Ly tâm tế bào ở 1500 vòng trong 10 phút.
Loại bỏ dịch nổi, ựánh tan cặn tế bào trong 2 ml môi trường.
đếm tế bào: Hút 100 ộl tế bào sang 1 ống Eppendorf 1,5ml, thêm 100ộl dung dịch tryppan blue 0,4%. Trộn ựều, ựếm bằng buồng ựếm Neubauer. Sau ựó ra chai theo yêu cầụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 45
Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Nhân tế bào Marc 145 trên ựĩa 96 giếng, 6 giếng:
Bước 1:
Chai T75 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Cho 5ml PBS láng ựều mặt tế bào, hút bỏ PBS.
Bước 2: Trypsin hóa
Cho 3ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ Hút bỏ 2ml Trypsin. để tế bào trong tủ ấm 370C cho tế bào tách nhau hoàn toàn.
Vỗ nhẹ chai ựể tế bào bong hoàn toàn.
Bước 3: đánh tan tế bào
Cho 10ml MEM 5% FBS ựánh tan cặn tế bàọ
đếm tế bào: 100ộl huyễn dịch tế bàơ100ộl Trypan bluẹ đếm tế bào trên buồng ựếm. Số tế bào=Tổng số tế bào 4 góc/4*2*104.
Pha tế bào mật ựộ 5-8x104cell/ml (5000-8000 tế bào/giếng), 10ml/ựĩa 96 giếng và 18ml/ ựĩa 6 giếng, trong môi trường MEM 5% FBS.
Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2 sau 1 ngày bám ựáy 100% gây nhiễm vi rút.
Nhận xét: Kết quả của việc phân lập và gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào phụ thuộc vào tình trạng phát triển của tế bào và mật ựộ tế bàọ Do vậy, ựể có lượng tế bào Marc145 ựủ cung cấp cho công tác nghiên cứu về vi rút PRRS trong phòng thắ nghiệm, ựòi hỏi phải có những thắ nghiệm ựể chuẩn hóa phương pháp nuôi cấy tế bàọ Ở ựây các thắ nghiệm chủ yếu như: Xác ựịnh mật ựộ tế bào khi nuôi cấy, thời gian, và % CO2 ựể tế bào phát triển tốt nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 46
Các thắ nghiệm ựược thiết kế như sau: Tế bào ựược nuôi ở các mật ựộ khác nhau bắt ựầu từ nồng ựộ: 104 tế bào/ml, sau ựó tăng dần theo cơ số 2 và theo dõi thời gian, chỉnh lượng CO2 sao cho phù hợp nhất ựể các chai tế bào phủ ựáy 100% theo như dự kiến.
Sau khi tối ưu hóa các ựiều kiện nuôi cấy tế bào, kết quả ựược chúng tôi tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 03-06. Kết quả xác ựịnh mật ựộ và tình trạng phát triển của tế bào Marc145
TT Thời gian
(giờ)
điều kiện Số lượng tế
bào/ml Tình trạng tế bào phủ ựáy (%) 1 0 370C, 3%CO2 105 0 2 24 370C, 3%CO2 2 x 105 50 3 48 370C, 3%CO2 5 x 105 75 4 72 370C, 3%CO2 2 x 106 100
Qua bảng 03-06, ựể có tế bào ở trạng thái ựang phát triển và phủ ựáy
100% sau 1; 2 ngày thì lượng tế bào khi cấy chuyển cần 5x105 tế bào /ml;
2x105 tế bào/ml, trong ựiều kiện 370C, 3%CO2. Với mật ựộ và tình trạng phát triển của tế bào như trên, các thắ nghiệm về phân lập và gây nhiễm vi rút, nhân giống vi rút... ựều ựạt kết quả tốt.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 47
Sau khi thiết lập và tối ưu hóa các ựiều kiện, quy trình phân lập vi rút PRRS gồm những bước như sau:
Bước 1: Chuẩn bị tế bào phân lập
Ra chai tế bào ở mật ựộ: 5x105 tế bào /ml; 2x105 tế bào/ml, trong ựiều kiện 370C, 3%CO2 (tùy theo thời gian cần tế bào).
Bước 2: Gây nhiễm vi rút
Chuẩn bị bệnh bệnh phẩm 10% trong môi trường RPMI
Mẫu bệnh phẩm là phổi, hạch amidan...
Cân bệnh phẩm, ghi lại khối lượng bệnh phẩm.
Nghiền bệnh phẩm bằng thạch anh trong cối chày sứ ựã ựược hấp tiệt trùng. Bổ sung RPMI ựể ựược huyễn dịch 10%.
Ly tâm 13000 vòng trong 10 phút ở 40C (hoặc lọc qua filter 0,45 ộm). Thu huyễn dịch phắa trên vào Eppendorf, loại bỏ cặn.
Một phần sử dụng ựể phân lập còn 1 phần dán nhãn thông tin bệnh phẩm. Bảo quản -300C.
Trường hợp mẫu bệnh phẩm là máu thì phải chắt huyết thanh sau ựó gây nhiễm như bình thường.
Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS
Soi kắnh kiểm tra tế bào trước khi gây nhiễm phải ựảm bảo tế bào mọc dày thành 1 lớp
Loại bỏ môi trường cũ
Thêm 200ộl huyễn dịch vi rút vào mỗi T25
Nuôi trong tủ ấm 370C, 3% CO2 theo dõi bệnh biến tế bào hàng ngày trong 5-7 ngàỵ
Bước 3: Quan sát tế bào và ựọc kết quả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 48
Tùy theo từng chủng vi rút phân lập ựược mà bệnh biến tế bào xuất hiện khác nhau: (1) Có nhiều ựám tế bào co cụm; hoặc (2) Tế bào bị phá hủy hoàn toàn.
Mẫu âm tắnh: Tế bào mọc thành một lớp.
Bước 4: Thu vi rút
Việc thu huyễn dịch vi rút sẽ ựược thực hiện sau 3- 5 ngày, tùy theo mức ựộ hủy hoại tế bào của chủng vi rút có trong bệnh phẩm.
Thu vi rút vào ống ly tâm 15. Bảo quản -800C.
Bước 5: Xác ựịnh lại sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR hoặc IPMA
để khẳng ựịnh lại chắc chắn sự có mặt của vi rút PRRS trong mẫu phân lập, cần thiết sau khi thu hoạch vi rút phải ựược kiểm tra lại bằng phản ứng RT-PCR hoặc IPMA (các bước thực hiện 2 phương pháp này ựã ựược trình bày trong phân phương pháp nghiên cứu).
Nhận xét: Hầu hết các ựiều kiện trong quy trình phân lập vi rút PRRS mà chúng tôi thiết lập trong ựược trong khi tối ưu hóa ở ựiều kiện phòng thắ nghiệm Việt Nam ựều phù hợp với hướng dẫn của OIE, tuy nhiên có một số thay ựổi ựể phù hợp với ựiều kiện phòng thắ nghiệm Việt Nam như : điều
chỉnh lượng CO2 từ 5% xuống 2,5-3%, sau quá trình tripsin hóa không có
bước ly tâm ựể loại bỏ tripsin vì lượng tripsin ựã ựược bỏ bớt sau khi láng mặt thảm tế bào ...