2.6.1. Nuôi cấy tế bào Marc145
Thực hiện nuôi cấy tế bào theo hướng dẫn của nhà cung cấp (Australian Animal Health Laboratory -AAHL).
Bước 1:
Chuẩn bị ựầy ựủ môi trường, chai nuôi, dụng cụ thắ nghiệm dùng cho nuôi cấy tế bào, buồng cấy, và các máy móc cần thiết trong phòng thắ nghiệm.
Bước 2:
Lấy tế bào từ nitơ lỏng ra, ngâm ngay ống tế bào vào trong cốc nước nóng 370C hoặc nắm chặt trong tay cho tế bào tan rạ Dùng pipet hút hết dung dịch tế bào vào ống corning ựã có sẵn 10 ml môi trường, li tâm 1500 vòng trong 10 phút ựể loại bỏ dung dịch bảo quản. đánh tan cặn tế bào trong 1- 2 ml môi trường, và nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa ựủ 8ml môi trường. Nuôi trong tủ ấm 370C 5% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vi
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 26
2.6.2. Phân lập vi rút PRRS
Theo hướng dần của OIE trong chương 2.08.07 về bệnh rối loạn sinh sản và hô hấp ở lợn trang 1117-1118, Terrestrial Manual 2008 [39].
Tế bào Marc145 nuôi cấy trong chai T75 bám ựáy 100%.
Bước 1:
Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ Cho 15ml MEM 5% FBS.
Bước 2: Gây nhiễm vi rút.
Cho 200ộl huyễn dịch vi rút PRRS vào chai tế bàọ
Bước 3:
Nuôi trong tủ ấm 370C 5% CO2 theo dõi sự phát triển hàng ngàỵ
Bước 4: Thu virrus
Tùy theo ựộc lực của chủng vi rút gây nhiễm mà việc thu huyễn dịch vi rút sẽ ựược thực hiện sau 3- 5 ngàỵ
Thu vi rút vào ống li tâm 15. Bảo quản -800C.
2.6.3. Phản ứng RT-PCR
Mồi ựặc hiệu: để nhân ựoạn gen ORF5 (Glycoprotein 5)
Bảng 02-01. Trình tự nucleotide của primer ựặc hiệu cho PRRS Primer Chiều Trình tự nucleotide 5Ỗ-3Ỗ Sản phẩm khuyếch ựại
F ATGTTGGGGAAATGCTTGACC
F2R2
R GTTCCGCTGAAACTCTGGTTA
462 bp
Chiết tách RNA
Mẫu sử dụng 150ộl huyễn dịch tế bào sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Thêm 850ộl Trizol vào ống Eppendorf ựã có 150ộl mẫu cần chiết tách
Vortex ựều, ựể nhiệt ựộ phòng trong 5 phút
Thêm 200ộl Chloroform, vortex trong 30 giây, ựể nhiệt ựộ phòng 3 phút Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 15 phút ở 40C
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 27
Thu dịch nổi bên trên
Thêm 500ộl Isopropanol, vortex trong 30 giây, ựể nhiệt ựộ phòng trong 10 phút, ly tâm 13000 vòng/ phút trong 10 phút ở 40C
Thu cặn, thêm 1ml Ethanol 80%
Ly tâm 13000 vòng/ phút trong 5 phút ở 40C Thu cặn, spin lại, sau ựó ựể khô
Bảng 02-02. Thành phần phản ứng sinh tổng hợp cDNA
TT Thành phần Nồng ựộ Lượng (ộộộộl)
1 Nuclease-free water 5
2 Random Primer 25pmol/ộl 2
3 RNA 5
4 First strand buffer 5X 4
5 BSA 2.5 mM each 2 6 dNTP 1 7 Reverse Transcriptase 1 Cộng Chạy 370C trong 45 phút Bảng 02-03. Thành phần phản ứng PCR TT Thành phần Nồng ựộ Lượng (ộộộộl) 1 Nuclease-free water 6 4 Master Mix 12.5
5 Reverse Primer 1R 10 picomol/ộl 2
6 Forward Primer 1F 10 picomol/ộl 2
7 Sợi mẹ 2.5
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 28
Bảng 02-04. Chu trình nhiệt của phản ứng PCR
Giai ựoạn Bước Nhiệt ựộ (oC) Thời gian (giây) Số vòng
1 1 94 600 1 2 1 94 30 2 50 30 3 72 30 40 3 1 72 420 1 2 4 hold điện di
Cho 12ộl sản phẩm PCR vào mỗi giếng của gel agarose (2% agarose
trong 1x TAE), so sánh với ADN chuẩn (10 ộl 100 bp lađer). điện di gel
ựược thực hiện ở 100v trong 30 phút. Gel ựược nhuộm trong Ethidium Bromide 10 phút và chụp ảnh trên hộp ựèn tử ngoạị
2.6.4. Phản ứng IPMA (Immuno Peroxidase Monolayer Assay)
Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc145 trên ựĩa 96 giếng
Chuẩn bị huyễn dịch tế bào Marc145 trong môi trường 5% huyết thanh (mật ựộ tế bào: 5x104 tế bào/ml)
Chia 100 ộl tế bào ựã chuẩn bị ở trên vào mỗi giếng
Nuôi trong tủ ấm 370C từ 1- 2 ngày (ựến khi tế bào mọc thành 1 lớp)
Bước 2. Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS
Pha loãng vi rút với liều 500TCID50/ml Thêm 100ộl huyễn dịch vi rút vào mỗi giếng Nuôi trong tủ ấm 370C trong 2 ngàỵ
Bước 3. Cố ựịnh tế bào gây nhiễm
Loại bỏ môi trường nuôi cấy, ựập nhẹ nhàng ựĩa trên giấy thấm.
Thêm 100ộl dung dịch cố ựịnh (10% Formalin và 1%NP40 trong PBS).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
Rửa ựĩa 2 lần với dung dịch 0,5% Tween 80 trong PBS.
Bước 4. Kháng thể 1 (huyết thanh):
Pha loãng huyết thanh với dung dịch 0.5% tween 80 và 3% skim milk trong PBS trên ựĩa 96 giếng khác (tuỳ theo mục ựắch của phản ứng: đối với mục ựắch sàng lọc pha loãng ở 1/160; và ựối với mục ựắch chuẩn ựộ huyết thanh pha 4 lần ở các ựộ pha loãng khác nhau: 1/40; 1/160; 1/640;1/2560).
Loại bỏ dung dịch cố ựịnh, ựập nhẹ trên giấy thấm tránh ựể quá khô. Rửa thảm tế bào 200ộl/1giếng 2 lần bằng dung dịch rửa PBS 0.5% tween. Chuyển 50ộl huyết thanh ựã pha loãng sang ựĩa tế bào tương ứng. để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Rửa ựĩa 3 lần với dung dịch rửa PBS có chứa 0.5% tween.
Bước 5. Kháng thể 2: Rabbit anti pig IgG (HRP)
Pha conjugate 1/50-1/1600 với washing buffer. Loại bỏ huyết thanh, ựập nhẹ trên giấy thấm. để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS có chứa 0.5% tween 80.
Bước 6. Cơ chất
Pha có chất: 14ml acetate bufer pH 5.2, 1ml AEC (3-Amino -9- Ethycarbazone), 15ộl H2O2 vortex ựềụ
Loại bỏ conjugate, ựập nhẹ trên giấy thấm.
Rửa tế bào 200ộl/1giếng 3 lần bằng dung dịch PBS 0.5% tween 80.
Cho 50ộl dung dịch AEC/1giếng
để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Bước 7. Quan sát tế bào và ựọc kết quả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30
Mẫu âm tắnh: đám tế bào bắt ựồng ựều màu hơi hồng.
Bước 8. Phụ lục chuẩn bị hóa chất
PBS 1X NaCl: 8g KCl: 0.2g Na2HPO4: 1.15g K2HPO4: 0.2g Nước cất: 1000ml Hấp 1210C trong 20 phút.
500ml fixing solution PBS 10% formalin 1% NP40
PBS : 450ml Formalin: 50ml NP40: 5ml
Washing buffer PBS 0.5% tween 80
PBS: 1000ml Tween 80: 5ml
Pha dung dịch PBS 0.5% tween 80 và 3% skim milk:
PBS 0.5% tween 80: 50ml Skim milk: 1.5g
2.6.5. Chuẩn ựộ vi rút PRRS
đĩa 96 giếng tế bào bám ựáy 100%.
Bước 1: Pha loãng vi rút
Pha loãng vi rút từ 10-1-10-8.Cho 900ộl MEM 5% FBS vào 8 ống. Cho
100ộl huyễn dịch vi rút vào ống thứ nhất, vortex. Chuyển 100ộl sang ống thứ 2.Thực hiện lần lượt cho ựến ống thứ tám (thay ựầu type khi chuyển từ nồng ựộ này sang nồng ựộ khác).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 31
Bước 2: Gây nhiễm vi rút
Chuyển 100ộl huyễn dịch vi rút ựã pha loãng vào ựĩa theo sơ ựồ sau:
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 A đC đC đC đC đC đC đC B đC 10-3 10-3 10-3 10-3 10-3 đC C đC 10-4 10-4 10-4 10-4 10-4 đC D đC 10-5 10-5 10-5 10-5 10-5 đC E đC 10-6 10-6 10-6 10-6 10-6 đC F đC 10-7 10-7 10-7 10-7 10-7 đC G đC 10-8 10-8 10-8 10-8 10-8 đC H đC đC đC đC đC đC đC
Bước 3: Nuôi trong tủ 370C 3% CO2.
Theo dõi sự phát triển của tế bào trong 5 ngàỵ đọc kết quả sau 5 ngàỵ
Cách ựánh giá kết quả:
Âm tắnh: Nếu ở ựộ pha loãng ựó tế bào phát triển bình thường, không có bệnh tắch tế bào (Giống giếng chỉ có tế bào).
Dương tắnh: Nếu ở ựộ pha loãng ựó xuất hiện bệnh tắch trên tế bào (giống như giếng ựối chứng có gây nhiễm vi rút).
2.6.6. Nhuộm tế bào nuôi cấy trên phiến kắnh mỏng
Nhân tế bào Marc 145 trên phiến kắnh mỏng (la- men) trong 2 ựĩa 6 giếng
Bước 1:
Chai T75 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Bước 2: Trypsin
Cho 3ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ để tế bào rong tủ ấm 370C
cho tế bào tách nhau hoàn toàn
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 32
Bước 3: đánh tan tế bào
Cho 10 ml MEM 5% FBS ựánh tan cặn tế bàọ
Cho 10 ml huyễn dịch tế bào trong 30ml MEM 5% FBS
Ra ựĩa 6 giếng có la-men trong từng giếng 3ml huyễn dịch tế bào/giếng
Bước 4: Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2 sau 2 ngày bám ựáy 100% dùng nhân giống PRRS.
Nhân giống vi rút PRRS
Tế bào Marc 145 nuôi cấy trong 2 ựĩa 6 giếng bám ựáy 100%.
Bước 1: Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ Bước 2: Gây nhiễm vi rút.
Cho 50ộl huyễn dịch vi rút PRRS /giếng theo sơ ựồ:
1 2 3
A đC đC đC
B PRRS PRRS PRRS
Bước 3:
Nuôi trong tủ ấm 370C 3%CO2 theo dõi sự phát triển hàng ngàỵ
Bước 4: Theo dõi sự biến ựổi của tế bào
Sau 24 h, 48 h, 72h, 96h, 120h
Sử dụng dung dịch Hematoxylin và Eosin ựể nhuộm
Tế bào Marc 145 gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h.
Bước 1: Cố ựịnh tiêu bản
Sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h lấy la-men gây nhiễm và la-men ựối chứng ra khỏi giếng nuôi cấỵ
Cố ựịnh tế bào trong Acetone trong 10 phút.
Gắn tế bào-la-men trên lam kắnh bằng MoutQuick. Bảo quản trong tủ âm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 33
Bước 2: Nhuộm tiêu bản
Tiêu bản lấy từ tủ âm rạ
Nhúng tiêu bản qua hệ thống cồn 100% (1), 100% (2), 90%, 80%, 70%. Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 10 phút.
Nhuộm Heamatoxyline trong 15 phút. Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 5 phút. Nhuộm Eosin trong 5 phút.
Rửa tiêu bản bằng nước cất trong 5 phút.
Nhúng tiêu bản qua hệ thống cồn 70%, 80%, 90%, 100% (1), 100% (2). Chuyển nhanh tiêu bản qua Xylen.
Gắn phủ lên la-men ựã nhuộm bằng la- men khác. để khô tự nhiên và soi kắnh.
2.6.7. Cách tắnh tắnh giá trị TCID50/ml và ựọc kết quả
Tắnh TCID50 theo phương pháp Read Muench [59].
Log ID50= log A + X1*logF (1) Hoặc:
Log ID50= LogB+X2*logF (2)
Ghi chú: A: là liều gây chết cận trên 50% tắnh theo ựộ pha loãng vi rút B là liều gây chết cận dưới 50% tắnh theo ựộ pha loãng vi rút
F là hệ số pha loãng bậc 10
X1, X2 là khoảng cách cân ựối tắnh theo: X1 = (AỖ - 50)/(AỖ-BỖ); X2= (BỖ-50)/(AỖ-BỖ) AỖ là tỷ lệ phôi chết cận trên50%
BỖ là tỷ lệ phôi chết cận dưới 50%
Số liệu thu thập ựược ghi chép theo bảng số liệụ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 34
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả nghiên cứu ựặc tắnh nhân lên của vi rút RRRS trên tế bào Marc 145 Marc 145
Vi rút PRRS nhân lên theo cơ chế Ổnẩy chồiỖ, không phá hủy ựồng loạt tế bàọ Ở Việt Nam, chưa có kinh nghiệm nhận biết bệnh tắch của tế bào sau khi gây nhiễm. Do ựó, chúng tôi phải thiết lập phương pháp theo dõi, ựọc kết quả. Trong quá trình phân lập chúng tôi bắt ựầu từ vi rút chuẩn nghiên cứu sự thay ựổi của tế bào gây nhiễm và cách nhận biết.
để thuận tiện cho việc nhận biết bệnh tắch của tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm vi rút PRRS, chúng tôi nghiên cứu nuôi tế bào trên la-men sau khi tế bào phủ kắn phiến kắnh, tiến hành gây nhiễm vi rút và tiến hành nhuộm theo quy trình như ựã trình bày trong phần phương pháp, ựây là một trong những kỹ thuật ựặc biệt ựể nuôi cấy tế bào [42]. Việc gây nhiễm ựược tiến hành sau khi tế bào bám 100% vào la-men. Theo dõi sự biến ựổi bệnh tắch của tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Chúng tôi tiến hành thắ nghiệm quan sát bệnh tắch của tế bào mỗi lần cách nhau 24 giờ (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ,120 giờ) ựể có ựược ựầy ựủ hình ảnh bệnh tắch tế bào hàng ngày sau khi gây nhiễm vi rút.
Bắt ựầu theo dõi sau khi gây nhiễm 24 giờ, tế bào chưa có biến ựổị Sau 48 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 1+. Sau 72 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 2+. Sau 96 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 3+. Sau 120 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 4+.
Lấy la-men gây nhiễm và la-men ựối chứng ra khỏi giếng nuôi cấy, cố ựịnh tế bào trong Acetone sau ựó gắn la-men trên tiêu bản bằng MoutQuick. Và bảo quản trong tủ âm. Việc nhuộm tiêu bản thực hiện theo quy trình như trong phần phương pháp. Kết quả theo dõi ựược ghi lại trong hình 03-01.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 35
Hình 03-01. Sự biến ựổi của tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h và hình ảnh nhuộm tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h gây nhiễm vi rút PRRS
[Ghi chú: Cột 01: Tế bàoMarc145 khi quan sát trên kắnh hiển vi; Cột 02:Hình ảnh
vi rút PRRS chủng Việt Nam (PRRS chuẩn do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp) khi quan sát trên kắnh hiển vi; Cột 03:Tế bàoMarc145 sau khi nhuộm bằng dung dịch HE; Cột 04:Hình ảnh vi rút chủng phân lập ở Việt Nam sau khi nhuộm bằng dung dịch Hematoxylin và Eosin.
Từ những hình ảnh về quá trình thay ựổi bệnh biến tế bào gây nhiễm vi rút PRRS có thể ựược tổng hợp ở bảng 03-01.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 36
Bảng 03-01. Kết quả quan sát bệnh tắch tế bào sau khi nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin
TT Thời gian (giờ) CPE Kết quả sau nhuộm
1 0 - -
2 24 - -
3 48 + +/-
4 72 2+ Tế bào co cụm lại, nhân tế bào bắt màu ựỏ ựậm
5 96 3+ Dễ quan sát thấy hình ảnh nhân tế bào bắt màu ựỏ ựậm
6 120 4+ Hầu hết tế bào co cụm lại, nhân bắt màu ựỏ ựậm
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Nhận xét: Sự khác nhau ựược quan sát rõ ở tiêu bản nhuộm sau 72 giờ gây nhiễm vi rút. Hình ảnh một số tế bào co cụm lại ở bên trên, nguyên sinh chất của những tế bào ựó bắt màu ựỏ nâu, trong khi ở lô ựối chứng thảm tế bào mịn và ựẹp, không có sự bắt màu trong nguyên sinh chất của tế bàọ Sau 96 giờ gây nhiễm bệnh tắch tế bào dễ quan sát hơn, và ựến 120 giờ sau khi gây nhiễm các tế bào hầu như bị bong ra khỏi ựáy la-men tạo thành chùm, nguyên sinh chất bắt màu ựỏ ựậm ựiển hình. Trái ngược lại ở hình ảnh ựối chứng tế bào, thảm tế bào mọc dày lên, không bị bong tróc bắt màu hồng ựềụ
Sau nhiều lần thực hiện lặp lại thắ nghiệm này cho chúng tôi thấy, nếu sau khi nhuộm nhân của tế bào bắt màu ựỏ nâu ựậm như mô tả trên hình 03- 01, cho phép kết luận có sự phá hủy của vi rút ựối với tế bào gây nhiễm. đây ựược xem như là một thành công trong phương pháp thử nghiệm, phương pháp này ắt tốn kém và dễ thực hiện.
3.2.1. đặc tắnh nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng vi rút phân lập ở Việt Nam
Qua bảng 03-02 cho thấy ở chủng vi rút phân lập ở Việt Nam, sau 48 giờ xuất hiện bệnh biến tế bào rõ và mức ựộ biến ựổi của tế bào tiếp tục tăng ở các thời ựiểm quan sát tiếp theọ đến 120 giờ sau khi phân lập thì CPE ựạt tối ựa, lúc này lượng vi rút có trong huyễn dịch tế bào nhiều nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 37
Bảng 03-02. Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Việt Nam