Vi rút PRRS nhân lên theo cơ chế Ổnẩy chồiỖ, không phá hủy ựồng loạt tế bàọ Ở Việt Nam, chưa có kinh nghiệm nhận biết bệnh tắch của tế bào sau khi gây nhiễm. Do ựó, chúng tôi phải thiết lập phương pháp theo dõi, ựọc kết quả. Trong quá trình phân lập chúng tôi bắt ựầu từ vi rút chuẩn nghiên cứu sự thay ựổi của tế bào gây nhiễm và cách nhận biết.
để thuận tiện cho việc nhận biết bệnh tắch của tế bào (CPE) sau khi gây nhiễm vi rút PRRS, chúng tôi nghiên cứu nuôi tế bào trên la-men sau khi tế bào phủ kắn phiến kắnh, tiến hành gây nhiễm vi rút và tiến hành nhuộm theo quy trình như ựã trình bày trong phần phương pháp, ựây là một trong những kỹ thuật ựặc biệt ựể nuôi cấy tế bào [42]. Việc gây nhiễm ựược tiến hành sau khi tế bào bám 100% vào la-men. Theo dõi sự biến ựổi bệnh tắch của tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Chúng tôi tiến hành thắ nghiệm quan sát bệnh tắch của tế bào mỗi lần cách nhau 24 giờ (24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 96 giờ,120 giờ) ựể có ựược ựầy ựủ hình ảnh bệnh tắch tế bào hàng ngày sau khi gây nhiễm vi rút.
Bắt ựầu theo dõi sau khi gây nhiễm 24 giờ, tế bào chưa có biến ựổị Sau 48 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 1+. Sau 72 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 2+. Sau 96 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy 100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 3+. Sau 120 giờ, ựối chứng tế bào bám ựáy100%, giếng gây nhiễm vi rút có CPE 4+.
Lấy la-men gây nhiễm và la-men ựối chứng ra khỏi giếng nuôi cấy, cố ựịnh tế bào trong Acetone sau ựó gắn la-men trên tiêu bản bằng MoutQuick. Và bảo quản trong tủ âm. Việc nhuộm tiêu bản thực hiện theo quy trình như trong phần phương pháp. Kết quả theo dõi ựược ghi lại trong hình 03-01.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 35
Hình 03-01. Sự biến ựổi của tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h và hình ảnh nhuộm tế bào sau 24h, 48h, 72h, 96h, 120h gây nhiễm vi rút PRRS
[Ghi chú: Cột 01: Tế bàoMarc145 khi quan sát trên kắnh hiển vi; Cột 02:Hình ảnh
vi rút PRRS chủng Việt Nam (PRRS chuẩn do Bộ môn Hóa sinh Miễn dịch Bệnh lý cung cấp) khi quan sát trên kắnh hiển vi; Cột 03:Tế bàoMarc145 sau khi nhuộm bằng dung dịch HE; Cột 04:Hình ảnh vi rút chủng phân lập ở Việt Nam sau khi nhuộm bằng dung dịch Hematoxylin và Eosin.
Từ những hình ảnh về quá trình thay ựổi bệnh biến tế bào gây nhiễm vi rút PRRS có thể ựược tổng hợp ở bảng 03-01.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 36
Bảng 03-01. Kết quả quan sát bệnh tắch tế bào sau khi nhuộm bằng Hematoxylin và Eosin
TT Thời gian (giờ) CPE Kết quả sau nhuộm
1 0 - -
2 24 - -
3 48 + +/-
4 72 2+ Tế bào co cụm lại, nhân tế bào bắt màu ựỏ ựậm
5 96 3+ Dễ quan sát thấy hình ảnh nhân tế bào bắt màu ựỏ ựậm
6 120 4+ Hầu hết tế bào co cụm lại, nhân bắt màu ựỏ ựậm
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Nhận xét: Sự khác nhau ựược quan sát rõ ở tiêu bản nhuộm sau 72 giờ gây nhiễm vi rút. Hình ảnh một số tế bào co cụm lại ở bên trên, nguyên sinh chất của những tế bào ựó bắt màu ựỏ nâu, trong khi ở lô ựối chứng thảm tế bào mịn và ựẹp, không có sự bắt màu trong nguyên sinh chất của tế bàọ Sau 96 giờ gây nhiễm bệnh tắch tế bào dễ quan sát hơn, và ựến 120 giờ sau khi gây nhiễm các tế bào hầu như bị bong ra khỏi ựáy la-men tạo thành chùm, nguyên sinh chất bắt màu ựỏ ựậm ựiển hình. Trái ngược lại ở hình ảnh ựối chứng tế bào, thảm tế bào mọc dày lên, không bị bong tróc bắt màu hồng ựềụ
Sau nhiều lần thực hiện lặp lại thắ nghiệm này cho chúng tôi thấy, nếu sau khi nhuộm nhân của tế bào bắt màu ựỏ nâu ựậm như mô tả trên hình 03- 01, cho phép kết luận có sự phá hủy của vi rút ựối với tế bào gây nhiễm. đây ựược xem như là một thành công trong phương pháp thử nghiệm, phương pháp này ắt tốn kém và dễ thực hiện.
3.2.1. đặc tắnh nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng vi rút phân lập ở Việt Nam
Qua bảng 03-02 cho thấy ở chủng vi rút phân lập ở Việt Nam, sau 48 giờ xuất hiện bệnh biến tế bào rõ và mức ựộ biến ựổi của tế bào tiếp tục tăng ở các thời ựiểm quan sát tiếp theọ đến 120 giờ sau khi phân lập thì CPE ựạt tối ựa, lúc này lượng vi rút có trong huyễn dịch tế bào nhiều nhất.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 37
Bảng 03-02. Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Việt Nam
TT Thời gian (giờ) % tế bào bám ựáy % tế bào co tròn CPE
1 0 100 0 - 2 24 100 5 +/- 3 48 80 20 + 4 72 60 40 2+ 5 96 40 60 3+ 6 120 40 60 3+
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Kết quả theo dõi bệnh biến của tế bào trên kắnh hiển vi cho thấy ở chủng vi rút Việt nam, tế bào có biểu hiện co tròn, tụ lại thành hình chùm nho sau khi phân lập 48 giờ. Các cụm tế bào xuất hiện ngày càng nhiều, tuy nhiên khi nhìn xuống ựáy chai nuôi vẫn còn một lớp tế bào bám ựáy.
Hình 03-02. Hình ảnh bệnh tắch tế bào gây nhiễm chủng vi rút phân lập ở Việt Nam
[Ghi chú:Cột 01: Hình ảnh bệnh tắch tế bào gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h,48h, 72h; Cột 02: Hình ảnh tế bào không gây nhiễm vi rút]
3.2.2. đặc tắnh nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ Bắc Mỹ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 38
Thắ nghiệm ựược thực hiện nhằm giúp cho chúng tôi có ựược những nhận biết và so sánh sự biến ựổi bệnh tắch của tế bào sau khi gây nhiễm chủng vi rút có nguồn gốc khác nhaụ
Bảng 03-03. Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Bắc Mỹ
TT Thời gian (giờ) % tế bào bám ựáy % tế bào co tròn CPE
1 0 100 0 -
2 24 60 40 +
3 48 10 90 2+
4 72 0 100 3+
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Kết quả ở bảng 03-03 gây nhiễm vi rút chủng Bắc Mỹ, bệnh biến tế bào xuất hiện chỉ sau khi gây nhiễm vi rút 24 giờ, sau 48 giờ gây nhiễm lượng tế bào bám ựáy chỉ còn khoảng 10% và ựến 96 giờ lượng tế bào bám ựáy gần như không còn. Kết quả theo dõi quá trình gây nhiễm ựược thể hiện ở hình 03-03:
Hình 03-03. Hình ảnh bệnh tắch tế bào gây nhiễm chủng vi rút Bắc Mỹ
[Ghi chú:Cột 01: hình ảnh bệnh tắch tế bào gây nhiễm vi rút PRRS sau 24h,48h, 72h; Cột 02: Hình ảnh tế bào không gây nhiễm vi rút].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 39
3.2.3. đặc tắnh nhân lên và gây bệnh biến tế bào của vi rút PRRS chủng Châu Âụ
Kết quả gây nhiễm chủng vi rút Châu Âu cho thấy: Sau 48 giờ gây nhiễm CPE xuất hiện rõ, khoảng 20% tế bào co tròn và nổi lên trong môi trường nuôi cấỵ Sau 96 giờ gây nhiễm bệnh biến tế bào xuất hiện nhiều nhất.
Bảng 03-04. Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào (CPE) chủng Châu Âu
TT Thời gian (giờ) % tế bào bám ựáy % tế bào co tròn CPE
1 0 100 0 -
2 24 90 10 +
3 48 80 20 +
4 72 50 50 2+
5 96 10 90 3+
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Kết quả gây nhiễm vi rút chủng Châu Âu ựược thể hiện ở hình 03-04.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 40
[Ghi chú: Cột 01: tế bào Marc145 gây nhiễm vi rút chủng Châu Âu sau 24h, 48h, 72h, 96h; Cột 02:Tế bào Marc145 không gây nhiễm vi rút]
3.2.4. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR RT-PCR
để khẳng ựịnh chắc chắn sự có mặt hay không của vi rút PRRS trong các mẫu gây nhiễm, chúng tôi tiến hành giám ựịnh RNA của vi rút 3 chủng ựại diện bằng phương pháp RT-PCR.
Chuẩn bị RNA bằng phương pháp Trizol
Chuẩn bị cDNA bằng phương pháp sử dụng random primer PCR sử dụng cặp mồi (primer) F2R2 với ựộ dài là 462bp Kết quả thực hiện PCR ựược thể hiện ở hình 03-05
Hình 03-05. Hình ảnh ựiện di agarose gel sản phẩm PCR, nhuộm Ethidium bromide
[Ghi chú: Cột 01: vi rút PRRS chủng Châu Âu (EU); côt 02: thang chuẩn DNA (marker), vạch 100bp; cột 03: vi rút PRRS chủng Việt nam (VN); cột 04: ựối chứng âm (không có vi rút, chỉ có tế bào marc145); cột 05: ựối chứng dương; cột 06: vi rút PRRS chủng Bắc Mỹ (NA)].
EU MK VN Ctrl- Ctrl+ NA
462bp
EU MK VN Ctrl- Ctrl+ NA
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 41
Nhận xét: Qua hình ảnh chạy ựiện di sản phẩm PCR cho thấy mẫu ựối chứng âm không lên vạch, mẫu ựối chứng dương cho vạch 462bp. Chủng vi rút VN (do bộ môn HSMDBL cung cấp) và 2 chủng vi rút PRRS có nguồn gốc từ Bắc Mỹ và Châu Âu ựều cho vạch ựặc hiệu 462 bp khi sử dụng cặp mồi (primer) F2R2 của bộ môn Hóa sinh- Miễn dịch - Bệnh lý, Viện Thú ỵ Chứng tỏ việc gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào Marc145 thành công.
3.2.5. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA
Ngoài phương pháp RT-PCR chúng tôi tiến hành phương pháp thứ 2 ựó là phương pháp IPMA ựể xác ựịnh sự có mặt của vi rút dựa vào cơ sở miễn dịch học. Phản ứng IPMA có ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu cao, phương pháp này thường chỉ ựược sử dụng trong các phòng thắ nghiệm có ựiều kiện nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút.
Mẫu vi rút phân lập ựã ựược chuẩn ựộ ựể biết liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50). Trong phản ứng này chúng tôi sử dụng liều 500TCID50/ml gây nhiễm trên ựĩa tế bào Marc145 (100ộl/giếng, ựĩa 96 giếng), 2 ngày sau khi gây nhiễm vi rút xuất hiện bệnh tắch trên tế bào gây nhiễm. Chúng tôi tiến hành cố ựịnh tế bào và thực hiện phản ứng theo trình tự các bước như trong phần phương pháp. Trong thắ nghiệm này chúng tôi bố trắ mẫu ựối chứng huyết thanh dương và mẫu ựối chứng huyết thanh âm (do chuyên gia FAO cung cấp). Huyết thanh ựược pha loãng theo tỷ lệ 1/40, 1/160, 1/640, 1/1280, 1/2560 kết quả thắ nghiệm ựược trình bày hình 03-06.
Nhận xét: (1) đối chứng dương có ựám tế bào bắt màu ựỏ ựậm nhân từ trong nguyên sinh chất. Lượng tế bào bắt màu ựậm trong nguyên sinh chất giảm dần từ khi ựộ pha loãng huyết thanh tăng lên. Phản ứng IPMA hợp cách. đối chứng âm các tế bào bắt màu hồng ựều, rải rác có ựám tế bào bắt mà ựậm nhưng không bắt mầu ựậm ở trong nguyên sinh chất. Vì vậy ựược ựánh giá âm tắnh. Mẫu xét nghiệm bắt màu giống ựối chứng dương, tuy
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 42
nhiên mức ựộ dương tắnh ựạt ở các ựộ pha loãng vi rút khác nhau tùy theo từng chủng vi rút.
Hình 03-06. Kết quả thực hiện phản ứng IPMA ựối với 3 chủng ựại diện
[Ghi chú: Cột 1: Gây nhiễm vi rút chủng Việt Nam; Cột 2: Gây nhiễm vi rút chủng Châu Âu; cột 3: gây nhiễm vi rút chủng Bắc Mỹ; cột 4: ựối chứng âm; cột 05: ựối chứng dương].
(2) Qua hình 03-06 cho thấy: đối với vi rút chủng Việt Nam kết quả IPMA ựạt 1/1280, tương ựương với kết quả khi thực hiện ựối với vi rút chủng Bắc Mỹ. Ngược lại kết quả IPMA ựối với vi rút chủng Châu Âu chỉ ựạt 1/640. Tuy nhiên, cả 3 chủng vi rút ựại diện ựều cho kết quả IPMA dương tắnh khi sử dụng huyết thanh chuẩn hay nói cách khác việc gây nhiễm vi rút PRRS trên tế bào Marc145 thành công.
3.2.6. So sánh ựặc tắnh nhân lên và gây bệnh trên tế bào của 3 chủng vi rút ựại diện
Kết quả theo dõi bệnh biến tế bào sau gây nhiễm của 3 chủng ựại diện ựược thể hiện trong bảng 03-05.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 43
Bảng 03-05. kết quả so sánh bệnh biến tế bào các chủng ựại diện
TT Thời gian (giờ) Tỷ lệ % có CPE
(Chủng Châu Âu) Tỷ lệ % có CPE (Chủng Bắc Mỹ) Tỷ lệ % có CPE (Chủng Việt Nam) 1 0 0 0 0 2 24 10 40 5 3 48 20 90 20 4 72 50 100 40 5 96 100 60 6 120 60
Ghi chú:Thời gian (giờ): Thời gian sau khi gây nhiễm vi rút PRRS
Nhận xét:
(1) Qua các thắ nghiệm trên cho thấy sự khác biệt về bệnh biến tế bào giữa chủng phân lập ở Việt Nam và 2 chủng vi rút tham chiếu (chủng vi rút Châu Âu và chủng vi rút Bắc Mỹ) là: Sự phá hủy tế bào hoàn toàn ở 2 chủng tham chiếụ Có 100% tế bào bị phá hủy ở ngày thứ 3 ựối với chủng vi rút Bắc Mỹ và khoảng 90% tế bào bị phá hủy khi gây nhiễm chủng vi rút có nguồn gốc từ Châu Âụ Trong khi ựó chủng vi rút ở Việt Nam gây biến ựổi tế bào theo kiểu các tế bào tụ lại thành chùm nho nổi cộm lên nhưng không bị bong ra khỏi ựáy chai nuôi và ở phắa dưới vẫn còn lớp tế bào bám ựáỵ
(2) Các chủng Bắc Mỹ và Châu Âu ựược phân lập lại từ những chủng vi rút vac-xin, các chủng này ựã thắch ứng trên tế bào, gây bệnh biến có tắnh chất phá hủy tế bào sau gây nhiễm 24 - 48 giờ. Ngược lại, chủng ựược phân lập tại Việt Nam chưa qua nhiều lần tiếp ựời trên tế bào nên bệnh biến chủ yếu quan sát ựược là hình ảnh tế bào co cụm sau gây nhiễm 48 - 96 giờ. Sự phá hủy có thể nhanh hay chậm hoặc không có tùy ựộc lực. Chủng do phòng thắ nghiệm cung cấp là chủng có ựộc lực cao có tác dụng phá hủy tế bào ở 48 giờ sau gây nhiễm. Nhưng trong thực tế có thể hoàn toàn không nhận thấy sự phá hủy của tế bào sau 5 ngày vì vậy việc nhận biết chủ yếu dựa vào dấu hiệu các tế bào co cụm sau khi gây nhiễm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 44
3.3. Quy trình phân lập vi rút ở ựiều kiện Việt Nam. Chuẩn bị tế bào: Chuẩn bị tế bào:
Mở giống tế bào:
Bước 1: Chuẩn bị ựầy ựủ môi trường, chai nuôi, dụng cụ thắ nghiệm dùng cho nuôi cấy tế bào, buồng cấy, và các máy móc cần thiết trong phòng thắ nghiệm.
Bước 2: Lấy tế bào từ nitơ lỏng ra, ngâm ngay ống tế bào vào trong cốc
nước nóng 370C hoặc nắm chặt trong tay cho tế bào tan rạ Dùng pipet hút
hết dung dịch tế bào vào ống ly tâm ựã có sẵn 10 ml môi trường, ly tâm 1500 vòng trong 10 phút ựể loại bỏ dung dịch bảo quản. đánh tan cặn tế bào trong 1- 2 ml môi trường, và nuôi vào chai nuôi T25 bổ sung vừa ựủ 8ml môi trường. Nuôi trong tủ ấm 370C 3% CO2. Theo dõi tế bào hàng ngày trên kắnh hiển vị
Nhân giống tế bào Marc145 trên chai nuôi (T25, T75, T150...)
Bước 1:Rửa tế bào
Chai T25 tế bào bám ựáy 100%. Hút bỏ môi trường nuôi cấỵ
Bước 2: Trypsin hóa
Cho 2ml Trypsin 1X tráng ựều mặt tế bàọ Hút bỏ 1ml Trypsin. để tế bào trong tủ ấm 370C cho tế bào tách nhau hoàn toàn.
Vỗ nhẹ chai ựể tế bào bong hoàn toàn.