Chúng tôi tiến hành gộp mẫu ựể phân lập, mỗi nhóm từ 2-5 mẫu phủ tạng ựược nghiền với thủy tinh thạch anh theo tỷ lệ 1/10 trong môi trường nuôi cấy và thực hiện phân lập như trong phần thiết lập phương pháp.
Bảng 03-08. Kết quả theo dõi bệnh tắch tế bào (CPE) phân lập vi rút từ phủ tạng
TT Nguồn gốc Số mẫu phân lập Số có CPE Tỷ lệ (%)
1 Hải Dương 32 8 25.00
2 Bắc Giang 11 3 27.27
3 Quảng Nam 45 8 17.77
Tổng 88 19 21.59
Những chai có biến ựổi (CPE) sẽ ựược tiến hành phân lập riêng rẽ từng mẫu trong nhóm. Sau 3- 5 ngày mẫu gây nhiễm vi rút ựược thu và ựông tan 3 lần, và tiến hành giám ựịnh sự có mặt của vi rút bằng các phương pháp khác.
Nhận xét: Tổng số mẫu phủ tạng sử dụng ựể phân lập là 88 mẫu, trong ựó ở Bắc Giang có 3/11 mẫu có biểu hiện bệnh biến tế bào ựạt tỷ lệ 27,27%, ựây là tỉnh cho tỷ lệ phân lập cao nhất, tiếp ựến là tỉnh Hải Dương có 8/32 mẫu xuất hiện CPE chiếm tỷ lệ 25%, và cuối cùng là tỉnh Quảng Nam tỷ lệ mẫu phân lập có CPE là 17,77%. Tỷ lệ xuất hiện CPE trung bình khi phân lập vi rút từ phủ tạng ựạt 21,59% ắt hơn so với tỷ lệ trung bình khi phân lập từ mẫu huyết thanh (34,09%). Kết quả phân lâp của chúng tôi cũng tương tự kết quả phân lập của một số tác giả khác trên thế giới [21,34,48,54].
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 51
3.4.3. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR
Áp dụng theo các bước như trong quy trình, sau khi phân lập xong ựể khẳng ựịnh chắc chắn sự có mặt hay không của vi rút PRRS trong mẫu phân lập, chúng tôi tiến hành giám ựịnh RNA của vi rút chủng phân lập bằng phương pháp RT-PCR. Mẫu sau khi phân lập quan sát hàng ngày trên kắnh hiển vi, nếu có xuất hiện CPE sẽ ựược thu sau 3 ựến 5 ngày, sau ựó ựông tan tế bào 3 lần và tiến hành làm phản ứng RT-PCR.
Kết quả thực hiện PCR ựược thể hiện ở bảng 03-09
Bảng 03-09. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR TT Nguồn gốc Số mẫu HT có CPE Dương tắnh PCR Tỷ lệ % Số mẫu PT có CPE Dương tắnh PCR Tỷ lệ (%) 1 Hải Dương 10 10 100.00 8 8 100,00 2 Bắc Giang 6 6 100.00 3 3 100,00 3 Quảng Nam 8 8 100.00 8 7 87,50 Tổng 24 24 100.00 19 18 94,73
[Ghi chú: HT: Huyết thanh; PT: Phủ tạng]
Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp RT-PCR cho thấỵ Tỷ lệ dương tắnh RT-PCR trung bình khi phân lập vi rút từ huyết thanh ựạt 24/24 chiếm 100 %, và từ phủ tạng ựạt 18/19 chiếm 94,73%.
3.4.4. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA
Ngoài phương pháp RT-PCR chúng tôi tiến hành phương pháp thứ 2 ựó là phương pháp IPMA ựể xác ựịnh sự có mặt của vi rút dựa vào cơ sở miễn dịch học. Phản ứng IPMA có ựộ nhạy và ựộ ựặc hiệu cao, phương pháp này thường chỉ ựược sử dụng trong các phòng thắ nghiệm có ựiều kiện nuôi cấy tế bào và gây nhiễm vi rút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 52
Các bước tiến hành cố ựịnh tế bào và thực hiện phản ứng theo trình tự các bước như trong phần phương pháp. Huyết thanh ựược pha loãng theo tỷ lệ 1/40, 1/160, 1/640, 1/1280, kết quả thắ nghiệm ựược trình bày ở bảng 03-10.
Bảng 03-10. Kết quả xác ựịnh sự có mặt của vi rút PRRS bằng phương pháp IPMA TT Nguồn gốc Số mẫu HT có CPE Dương tắnh IPMA Tỷ lệ (%) Số mẫu PT có CPE Dương tắnh IPMA Tỷ lệ (%) 1 Hải Dương 10 10 100.00 8 8 100,00 2 Bắc Giang 6 6 100.00 3 3 100,00 3 Quảng Nam 8 8 100.00 8 7 87,50 Tổng 24 24 100.00 19 18 94,73
[Ghi chú: HT: Huyết thanh; PT: Phủ tạng]
Nhận xét: (1) Qua bảng 03-10 cho thấy tỷ lệ dương tắnh ựối với vi rút PRRS khi thực hiện phản ứng IPMA ựối với các mẫu phân lập vi rút từ huyết thanh ựạt 24/24 chiếm 100%, và tỷ lệ dương IPMA ựối với mẫu bệnh phẩm phân lập từ phủ tạng là 94,73%. Từ kết quả trên cho thấy, khi thực hiện phương pháp này tỷ lệ mẫu phân lập dương tắnh tương tự với khi xác ựịnh bằng phương pháp RT-PCR [11].
(2) Phản ứng IPMA cho kết quả dương tắnh ựối với mẫu huyết thanh dương chuẩn của vi rút PRRS chứng tỏ kháng nguyên (vi rút) sử dụng ựể gây nhiễm tế bào là vi rút PRRS.
3.4.5. Chuẩn ựộ vi rút PRRS trên môi trường tế bào Marc 145
Việc chuẩn ựộ vi rút PRRS ựược thực hiện theo hướng dẫn của OIE và tắnh liều gây nhiễm 50% tế bào (TCID50) theo phương pháp Read Muench. Phương pháp chuẩn ựộ ựược tiến hành trên ựĩa nhựa 96 giếng ựã có tế bào Marc145 phủ ựáy 100%. Vi rút ựược pha loãng theo cơ số 10, mỗi nồng ựộ
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 53
thực hiện trên 5 giếng, mỗi giếng 100 ộl. Phản ứng thực hiện theo ựúng như trong phần phương pháp.
Mức ựộ bệnh biến tế bào khác nhau tùy theo ựịa danh ựể ựánh giá chắnh xác mức phá hủy tế bào bằng chỉ số TCID50 chúng tôi tiến hành thắ nghiệm chuẩn ựộ vi rút với những mẫu ựã xác ựịnh có RT-PCR hoặc IPMA dương tắnh. Kết quả chuẩn ựộ ựược thể hiện ở bảng 03-11.
Bảng 03-11. Kết quả chuẩn ựộ vi rút PRRS chủng phân lập
TT Nguồn gốc Dương tắnh RT-PCR/IPMA TCID50/ml
1 Hải Dương 1 107.7
2 Bắc Giang 1 108
3 Quảng Nam 1 104.9
Nhận xét: Kết quả chuẩn ựộ vi rút phân lập ựược ở 3 ựịa phương khác nhau cho thấy: Các chủng phân lập ở các ựịa phương khác nhau có mức ựộ bệnh biến trên tế bào khác nhau, tuy nhiên sự khác nhau rõ hơn khi 2 chủng ựược phân lập từ 2 vùng cách xa nhaụ Bắc Giang: 108TCID50 /ml trong khi chủng vi rút phân lập ựược ở Quảng Nam 104.9 TCID50 /ml
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 54
KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên cho phép chúng tôi có những kết luận sau:
1. đã xác ựịnh ựược ựặc tắnh nhân lên và gây bệnh biến tế bào của ba chủng vi rút PRRS ựại diện cho các chủng ở: Châu Âu, Bắc Mỹ và Việt Nam.
2. đặc ựiểm của chủng PRRS ở Việt Nam bao gồm: Tế bào sau 48-96 giờ gây nhiễm vi rút bệnh biến là hình ảnh các tế bào co cụm lại hình chùm nho, và hầu như tế bào không bị phá hủỵ
3. đã xác lập ựược quy trình phân lập vi rút PRRS trong phòng thắ nghiệm ở Việt Nam, áp dụng phù hợp với các chủng hiện lưu hành ở một số ựịa phương của Việt Nam. Một chủng phân lập ựược xác nhận nếu có bệnh biến tế bào co cụm hình chùm nho, nguyên sinh chất của tế bào bắt màu ựỏ ựậm khi thực hiện phương pháp nuôi cấy và gây nhiễm vi rút trên la-men, nhuộm bằng dung dịch Hematoxyline và Eosin và có kết quả RT-PCR dương tắnh hoặc IPMA dương tắnh.
4. đã áp dụng phân lập lại thành công và phân lập ựược 35 chủng vi rút PRRS từ các ựịa phương như: Hải Dương, Bắc Giang, Quảng Nam.
5. Các chủng phân lập ở Hải Dương và Bắc Giang có mức ựộ bệnh biến tế bào gần như nhau, cao hơn so với chủng phân lập ở Quảng Nam.
đỀ NGHỊ
1.đề nghị áp dụng phương pháp phân lập ựã ựược thiết lập trong phòng
thắ nghiệm Việt Nam ựể phân lập vi rút PRRS ở Việt Nam, nhằm tắch lũy chủng và biến chủng theo thời gian.
2.Nghiên cứu sâu hơn về sinh học phân tử ựể có cơ sở khoa học giải thắch về sự khác nhau giữa các chủng vi rút.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 55
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng việt
1. Cục thú y (2007), ỘBệnh tai xanh-bệnh bắ hiểm ở lợn, ựôi ựiều cần biếtỢ. vietnamnet 22/4/2007.
2. JennyG.Cho (2007), ỘVirus gây hội chứng RLSS và hô hấp ở lợnỢ, Tạp chắ KHTY,14 (5) tr 74-80.
3. M.W.Eastaught (2001), ỘBệnh hô hấp của lợn tổng quanỢ.Tạp chắ KHTY, 3, tr 76-82.
4. Nguyễn Ngọc Hải và cs (2007), ỘChẩn ựoán vi rút gây hội chứng RLSS và hô hấp trên heo bằng kỹ thuật RT-PCRỢ. Tạp chắ KHTY, 14(5), tr 5-12.
5. Tô Long Thành (2007), ỘHội chứng rối loạn sinh sản và hô hấp cuả
lợnỢ,Tạp chắ KHTY, 14 (3), tr 81-88.
6. Tô Long Thành và cs (2008), ỘKết quả chẩn ựoán và nghiên cứu gây
hội chứng RLSS và hô hấp trên lợn ở Việt nam từ tháng 3/2007 ựến 5/2008Ợ, Tạp chắ KHTY, 15(5), tr 5-13.
7. Trần Thị Bắch Liên và cs (2007), ỘKhảo sát sự biến ựộng của kháng
thể mẹ truyền trên heo con của nái nhiễm PRRSỢ. Tạp chắ KHTY, 14(2), tr 5-10.
8. Trần Thị Bắch Liên và cs (2007), ỘXác ựịnh tỷ lệ nhiễm và chủng virus PRRS tại một số cơ sở chăn nuôi heo miền ựông nam bộỢ. Tạp chi KHTY, 14(6), tr 5-9.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 56
Tiếng anh
9. . Ạ Bụtner, B. Strandbygaard, K.J. Sụrensen, M.B. Oleksiewicz and T. Storgaard, (2000), ỘDistinction between infections with European and American/vaccine type PRRS virus after vaccination with a modified-live PRRS virus vaccineỢVet. Res. (31) 1, pp. 72-72.
10.Allende R, Lewis TL, Lu Z, Rock DL, Kutish GF, et al. (1999) ỘNorth American and European porcine reproductive and respiratory syndrome viruses differ in non-structural protein coding regionsỢ. J Gen Virol, 80(Pt 2), pp. 307-315.
11.Anette botner (1997), ỘDiagnosis of PRRSỢ, Veterinary
Mycrobiology, 55, pp. 295-301.
12.Barbara Ẹ Straw, Jeffery J. Zimm, Sylvie DỖAllaire, David J. Taylor, (2006), Diseases of swine, Blackwell, Blackwell Publishing Professional 2121 State Avenue, Ames, Iowa 50014, USAerman.
13.Brian WJ Mahy, Hillar 0 Kangro, (1996), Virology methods
manual,US Edition published by Academic press INC.San Diego, CA 92101.
14.Cavanagh D. Nidovirales. (1997), ỘA new order comprising
Coronaviridae and ArteriviridaeỢ, Arch Virol,142, pp. 629-633.
15.Cinta Prietọ,(2003), ỘTemporal localization of porcine reproductive and respiratory syndrome virus in reproductive tissues of
experimentally infected boarsỢ, Theriogenology, 125, pp. 1505-1514.
16.Dea S, Gagnon CA, Mardassi H, Pirzadeh B, Rogan D.(2000)
ỘCurrent knowledge on the structural proteins of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: comparison of the North American and European isolatesỢ. Arch Virol, 145, pp. 659-688.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 57
17.ẸAlbinạ (1998), ỘImmune responses in pigs infected with PRRSỢ, Veterinary Immunology and Immunopathology, 61, pp. 49-66.
18.ẸWeiland. (1999), ỘMonoclonal antibodies to the GP5 of porcine reproductive and respiratory syndrome virus are more effective in virus neutralization than monoclonal antibodies to the GP4Ợ, Veterinary Microbiology, 10, pp. 171-186.
19.Gonnie Nodelijk. (1996), ỘComparison of commercila ELISA and
immunoperoxidase monolayer assay to detect antibodies directed against PRRSỢ Veterinary Microbiology, 49, pp. 285-295.
20.Grebennikova TV, Clouser DF, Vorwald AC, Musienko MI,
Mengeling WL, et al. (2004), ỘGenomic characterization of virulent, attenuated, and revertant passages of a North American porcine reproductive and respiratory syndrome virus strainỢ. Virology, 324, pp. 383Ờ390.
21.Hyun-Soo Kim, Sin- Koog Kong. (1999), ỘIsolation and identification
of porcine reproductive and respiratory syndrome virus from serum sample collect from swine farms-KoreanỢ, J Vet Serv, 22 (4): pp. 363-370.
22.H.S.Joọ (1997), ỘIndirect fluorescent IgM antibody responese of pig
infected with PRRSỢ , Veterinary Microbiology, 55, pp. 303-307.
23.ỊF.ẠvanderLinden. (2003), ỘVirological kinetics and immunological
responses to a porcine reproductive and respiratory syndrome virus infection of pigs at different agesỢ, Vaccine, 112, pp. 1952-1957.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 58
24.Ishizaka Mayumi, Nakane Takashi, Saik, et al. (1997), ỘIsolation of PRRS virus and Detection of Viral RNA by PCR from Fetuses and neonatal Pigs assocated with abnormal DeliveriesỢ, Bulletin of Chiba Prefectural Institute of Animal Health, 25, pp. 44-48.
25.Jian Chen. (2006), ỘGenetic Variation of Chinese PRRSV Strains Based Biochemical GeneticsỢ, Veterinary Microbiology, 142, pp. 425-435.
26.J.Plana Duran. (1997), ỘEfficacy of inactivated vaccin for prevention
of reproductive failure induced by PRRSỢ, Veterinary
Microbiology,55, pp. 361-370.
27.Kegong Tian et al. (2007), ỘEmergence of Fatal PRRSV Variants: Unparalleled Outbreaks of Atypical PRRS in China and Molecular Dissection of the Unique HallmarkỢ, PLoS ONE journal.pone, 2(6): pp. 526-533.
28.K.G.Madsen. (1998), ỘSequence analysis of porcine reproductive and
respiratoryỢ, Arch Virol, 143, pp. 1683-1700.
29.Kritien van Reeth. (1996), ỘDual infection of feeder pig with PRRS followed by PRCV or SIV aclinical and virological studyỢ, Veterinery Microbiology, 48, pp. 325-335.
30.LIU Cai-gen, HE Hou-jun, LUO Yong-mei, WU Xiang-dong, PAN
Jin-fạ (2007), ỘEstablishment of RT-PCR for Detection of Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus RNA from Pig FecesỢ, [J];Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis, 12, pp. 89-95
31.L. Kirk. Clark. (1996), ỘEpidemeology and managerment of selected
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 59
32.Martha Fuentes de Abin, Gordon Spronk, Mark Wagner. (2009),
ỘComparative infection efficciency of Porcine reproductive and respiratory syndrome virus field isolates on MA 104 cells and porcine alveoolar marcrophagesỢ, the canadian journal of veterinary research,73, pp.200-204.
33.Meulenberg JJ, Hulst MM, de Meijer EJ, Moonen PL, den Besten A,
et al. (1993), ỘLelystad virus, the causative agent of porcine epidemic abortion and respiratory syndrome (PEARS), is related to LDV and EAVỢ. Virology, 192, pp. 62Ờ72.
34.Michael ÓConnor, Michael Fallon and Patrick J. ÓReillỵ (2002), ỘDetection of antibody to porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus: reduction of cut-off value of an ELISA, with confirmation by immunoperoxidase monolayer assayỢ Irish Veterinary Journal, Vol 55, pp.245-253.
35.Michael OỖConnor_Irish. (2002), ỘDetection of antibody to PRRS virus by ELISA and IPMAỢ, Veterinary Journal, 120, pp. 73 -75.
36.M.H.Verheijẹ (2003), ỘSafety and protective efficacy of porcine reproductive and respiratory syndrome recombinant virus vaccines in young pigsỢ, Vaccine, 125, pp. 2556Ờ2563.
37.Murakami Y, Kato A, Tsuda T, Morozumi T, Miura Y, Sugimura T.
(1994), ỘIsolation and serological characterization of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) viruses from pigs with reproductive and respiratory disorders in JapanỢ, JVet Med Scị, 56(5), pp. 891-894.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 60
38.Nelsen CJ, Murtaugh MP, FabergKS. (1999) ỘPorcine reproductive and respiratory syndrome virus comparison: divergent evolution on two continentsỢ. J Virol, 73, pp. 270Ờ280.
39.OIE Terrestrial Manual. (2008) ỘPorcine reproductive and respiratory syndromeỢ, Manual of Diagnostic Tests and Vaccines for Terrestrial Animals, chapter 2.8.7, pp. 1116-1127.
40.P.L.Delputtẹ (2004), ỘEffect of virus specific antibodies on
attachment internalization and infection of porcine reproductive and respiratoryỢ, Veterinary Immunology and Immunopathology, 142, pp. 179-188.
41.P. Suárez, R. Zardoya, C. Prieto, Ạ Solana, Ẹ Tabarés, J. M. Bautista and J. M. Castrọ (1994), ỘDirect detection of the porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus by reverse polymerase chain reaction (RT-PCR)Ợ Arch Virol,135, pp. 89-99.
42.R.Ian Freshneỵ (2000), Culture of animal Cells, A John wiley & sons, inc., publiccation.
43.R.W.Wills. (1997), ỘPRRS a persistent infectionỢ, Veterinary
Microbiology, 55, pp. 231-240.
44.Sol M.Cancel-Tiradoạ (2004),ỘMonoclonal antibody analysis of PRRS epitopes associated with antibody-dependent enhancement and neutralization of virus infectionỢ, Veterinary Immunology and Immunopathology, 142, pp. 249-262.
45.Susy Carman, S. Ernest Sanford. (1995), ỘIsolation of a distinct serotype of porcine reproductive and respiratory syndrome (PRRS) virus in On tarioỢ, Can Vet J Vol 36, pp. 232-240.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 61
46.Thiel HJ, Meyers G, Stark R, Tautz N, Rumenapf T, et al. (1993), ỘMolecular characterization of positivestrand RNA viruses: pestiviruses and the porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV)Ợ. Arch Virol Suppl, 7, pp. 41-52.
47.Trevor W. Drew. (2000), ỘA review of evidence for
immunosuppression due to Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome VirusỢ, Vet. Res. 31, pp. 27-39.
48.W. G. Van Alstine, C. L. Kanitz, G. W. Stevenson. (1993), ỘTime and
temperature survivability of PRRS virus in serum and tissuesỢ, J Vet Diagn Invest 5, pp. 621-622.
49.William A Cafrunỵ (2006), ỘPRRS infection spreads by cell-to-cell transfer in cultured MARC-145 cells is dependent on an intact cytoskeleton, and is suppressed by drug-targeting of cell