Bước 1: Chuẩn bị tế bào Marc145 trên ựĩa 96 giếng
Chuẩn bị huyễn dịch tế bào Marc145 trong môi trường 5% huyết thanh (mật ựộ tế bào: 5x104 tế bào/ml)
Chia 100 ộl tế bào ựã chuẩn bị ở trên vào mỗi giếng
Nuôi trong tủ ấm 370C từ 1- 2 ngày (ựến khi tế bào mọc thành 1 lớp)
Bước 2. Gây nhiễm tế bào với vi rút PRRS
Pha loãng vi rút với liều 500TCID50/ml Thêm 100ộl huyễn dịch vi rút vào mỗi giếng Nuôi trong tủ ấm 370C trong 2 ngàỵ
Bước 3. Cố ựịnh tế bào gây nhiễm
Loại bỏ môi trường nuôi cấy, ựập nhẹ nhàng ựĩa trên giấy thấm.
Thêm 100ộl dung dịch cố ựịnh (10% Formalin và 1%NP40 trong PBS).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 29
Rửa ựĩa 2 lần với dung dịch 0,5% Tween 80 trong PBS.
Bước 4. Kháng thể 1 (huyết thanh):
Pha loãng huyết thanh với dung dịch 0.5% tween 80 và 3% skim milk trong PBS trên ựĩa 96 giếng khác (tuỳ theo mục ựắch của phản ứng: đối với mục ựắch sàng lọc pha loãng ở 1/160; và ựối với mục ựắch chuẩn ựộ huyết thanh pha 4 lần ở các ựộ pha loãng khác nhau: 1/40; 1/160; 1/640;1/2560).
Loại bỏ dung dịch cố ựịnh, ựập nhẹ trên giấy thấm tránh ựể quá khô. Rửa thảm tế bào 200ộl/1giếng 2 lần bằng dung dịch rửa PBS 0.5% tween. Chuyển 50ộl huyết thanh ựã pha loãng sang ựĩa tế bào tương ứng. để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Rửa ựĩa 3 lần với dung dịch rửa PBS có chứa 0.5% tween.
Bước 5. Kháng thể 2: Rabbit anti pig IgG (HRP)
Pha conjugate 1/50-1/1600 với washing buffer. Loại bỏ huyết thanh, ựập nhẹ trên giấy thấm. để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Rửa tế bào 3 lần bằng dung dịch PBS có chứa 0.5% tween 80.
Bước 6. Cơ chất
Pha có chất: 14ml acetate bufer pH 5.2, 1ml AEC (3-Amino -9- Ethycarbazone), 15ộl H2O2 vortex ựềụ
Loại bỏ conjugate, ựập nhẹ trên giấy thấm.
Rửa tế bào 200ộl/1giếng 3 lần bằng dung dịch PBS 0.5% tween 80.
Cho 50ộl dung dịch AEC/1giếng
để tủ ấm 370C trong 30 phút.
Bước 7. Quan sát tế bào và ựọc kết quả
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ nông nghiệp ... 30
Mẫu âm tắnh: đám tế bào bắt ựồng ựều màu hơi hồng.
Bước 8. Phụ lục chuẩn bị hóa chất
PBS 1X NaCl: 8g KCl: 0.2g Na2HPO4: 1.15g K2HPO4: 0.2g Nước cất: 1000ml Hấp 1210C trong 20 phút.
500ml fixing solution PBS 10% formalin 1% NP40
PBS : 450ml Formalin: 50ml NP40: 5ml
Washing buffer PBS 0.5% tween 80
PBS: 1000ml Tween 80: 5ml
Pha dung dịch PBS 0.5% tween 80 và 3% skim milk:
PBS 0.5% tween 80: 50ml Skim milk: 1.5g