Bốn trăm lẻ chín dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ được phân lập từ 29 mẫu chất thải ao cá tra và trại heo được thu ở các quận, huyện thuộc thành phố Cần Thơ. Các dòng vi khuẩn phân lập được chủ yếu có khuẩn lạc dạng tròn, màu trắng, nguyên, mô, trơn láng, đường kính 0,5 1,0 mm và tế bào có dạng hình que di động. Năm mươi mốt dòng có khả năng chuyển hóa nitơ ở mức cao trên môi trường minimal bổ sung ammonium, nitrite và nitrate có nồng độ tăng dần. Cụ thể có 14 dòng có khả năng oxi hóa 900mM ammonium, 18 dòng khử 90mM nitrite, 15 dòng khử nitrate 900mM và 4 dòng T có khả năng oxi hóa 300mM ammonium, khử 300mM nitrate, khử 30mM nitrite. Tám dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao được giải trình tự gen 16S rDNA với cặp mồi tổng (8F và 1492R) và nhận diện trên cơ sở dữ liệu NCBI.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Ngày nay, nhu cầu về lương thực và thực phẩm gia tăng đáng kể, đòi hỏi ngành chăn nuôi, bao gồm chăn nuôi gia súc gia cầm và nuôi trồng thủy sản, phải nâng cao năng suất và chất lượng sản phẩm Cần Thơ, mặc dù là một trong năm thành phố trực thuộc trung ương, vẫn giữ vai trò quan trọng trong nông nghiệp với tổng đàn gia súc lớn và diện tích nuôi trồng thủy sản đáng kể Tuy nhiên, sự phát triển chăn nuôi cũng tiềm ẩn nguy cơ ô nhiễm môi trường, ảnh hưởng đến chất lượng nước và không khí, nếu hệ thống xử lý chất thải không được chú trọng Vấn đề ô nhiễm môi trường trong ngành chăn nuôi đang ngày càng được quan tâm hơn.
Ô nhiễm môi trường sinh thái do chăn nuôi đang là vấn đề nghiêm trọng tại các tỉnh Đồng bằng sông Cửu Long, bao gồm cả thành phố Cần Thơ Nguyên nhân chính của tình trạng này là do sử dụng quá nhiều phân bón hóa học trong nông nghiệp, nước thải từ các nhà máy chế biến, chất thải từ chăn nuôi và chất thải sinh hoạt của con người Chất thải hữu cơ bị vi sinh vật phân hủy, dẫn đến việc thải ra môi trường một lượng lớn hợp chất nitơ vô cơ hòa tan (NH4+), gây ảnh hưởng xấu đến hệ sinh thái.
Ô nhiễm nitơ trong nước dẫn đến giảm hàm lượng oxy hòa tan, gây độc hại, phú dưỡng hóa và có thể gây bệnh thiếu máu nghiêm trọng ở trẻ em, như methemoglobinemia Việc ứng dụng vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chu trình nitơ sẽ đóng vai trò quan trọng trong xử lý chất thải, đặc biệt là chất thải từ chăn nuôi gia súc và nuôi trồng thủy sản.
Đề tài “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chất thải ao cá tra và trại heo (sau biogas) ở thành phố Cần Thơ” được thực hiện nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn bản địa có khả năng chuyển hóa nitơ hiệu quả Mục tiêu là ứng dụng những vi khuẩn này để sản xuất chế phẩm vi sinh xử lý chất thải chăn nuôi, từ đó giảm thiểu ô nhiễm và cải thiện tình trạng môi trường đang ngày càng suy thoái.
Mục tiêu đề tài
Đề tài đƣợc thực hiện với mục tiêu nhƣ sau:
Phân lập đƣợc những dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ trong chất thải ao cá tra và trại heo
Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ của những dòng vi khuẩn phân lập đƣợc
Tuyển chọn đƣợc một số dòng có khả năng chuyển hóa nitơ cao từ những dòng đƣợc khảo sát khả năng chuyển hóa
Nhận diện đƣợc các dòng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa cao đƣợc tuyển chọn
Phân tích đa dạng di truyền các dòng vi khuẩn đƣợc nhận diện
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Tình hình nuôi cá tra, chăn nuôi heo ở thành phố Cần Thơ năm 2010
Thành phố Cần Thơ, nằm trên bờ phải sông Hậu, là một trong năm thành phố trực thuộc Trung ương của Việt Nam Vị trí của Cần Thơ ở trung tâm đồng bằng sông Cửu Long, với các tỉnh lân cận như An Giang ở phía bắc, Đồng Tháp ở phía đông bắc, Hậu Giang ở phía nam, Kiên Giang ở phía tây và Vĩnh Long ở phía đông.
Thành phố Cần Thơ hiện nay được chia thành 9 đơn vị hành chính, bao gồm 5 quận (Ninh Kiều, Bình Thủy, Cái Răng, Ô Môn, Thốt Nốt) và 4 huyện (Phong Điền, Cờ Đỏ, Thới Lai, Vĩnh Thạnh) Cần Thơ đóng vai trò là trung tâm kinh tế, văn hóa, chính trị, khoa học và kỹ thuật của vùng đồng bằng sông Cửu Long.
Theo Cục Thống kê thành phố Cần Thơ, năm 2010, tổng số lượng gia súc tại thành phố gồm 532 con trâu, 4.598 con bò và 121.029 con heo Trong đó, có 14.188 heo nái giống, 241 heo đực giống, 106.600 heo thịt và 19.580 heo sữa.
Bảng 1 Số lƣợng đàn gia súc của thành phố Cần Thơ cuối năm 2010 Đơn vị tính: con
Khu vực Trâu Bò Heo
(nguồn: Cục Thống kê thành phố Cần Thơ, 2010)
Năm 2010, thành phố Cần Thơ có tổng diện tích nuôi trồng thủy sản là 12.620 ha, trong đó 776 ha chuyên nuôi cá tra Bên cạnh đó, thành phố còn có 252 hộ nuôi thủy sản bằng lồng bè với 347 lồng bè, tương ứng với thể tích 33.355 m³.
Bảng 2 Diện tích nuôi trồng thủy sản của thành phố Cần Thơ cuối năm 2010 Đơn vị tính: ha
Khu vực Nuôi trồng thủy sản Nuôi cá tra
(nguồn: Cục Thống kê thành phố Cần Thơ, 2010)
Sự ô nhiễm nitơ, tình hình ô nhiễm do nuôi cá tra và chăn nuôi heo
Nitơ và các hợp chất của nó trong nước thường tồn tại dưới ba dạng chính: hợp chất hữu cơ, ammonia (NH3) hoặc ion ammonium (NH4+) và dạng oxi hóa, cụ thể là ion nitrate.
NO 3 - , ion nitrite NO 2 - ) Sự ô nhiễm nitơ trong nước có liên quan đến việc giảm hàm lƣợng oxy hòa tan, gây độc, hiện tƣợng phú dƣỡng hóa và gây bệnh thiếu máu nghiêm trọng ở trẻ em (methemoglobinemia) Giảm lƣợng oxy hòa tan do sự oxi hóa ammoium (hay nitrate hóa) của vi sinh vật và do sự phú dƣỡng hóa gây nên sự phát triển mạnh mẽ của thực vật thủy sinh đặc biệt là các loài tảo Tất cả các ion ammonium, nitrate và nitrite đều gây độc cho sinh vật thủy sinh, đặc biệt cho cá Trong 3 dạng ion thì ion nitrite là độc nhất và ion ammonium sẽ đƣợc chuyển hóa thành ammonia (độc hơn) khi pH tăng Ion nitrate trong nước gây bệnh thiếu máu nghiêm trọng ở trẻ em vì khi vào cơ thể NO 3 - sẽ đƣợc chuyển hóa thành NO 2 - và liên kết với ion Fe2 + trong phân tử hemoglobin gây nên bệnh thiếu máu (Gerardi, 2002)
Nghề nuôi cá tra ở Đồng bằng sông Cửu Long là ngành mũi nhọn nhưng đang gây ô nhiễm môi trường nghiêm trọng do nước thải và chất thải có nồng độ chất hữu cơ cao Những chất thải này thường được thải trực tiếp ra môi trường mà không qua xử lý, ảnh hưởng đến chất lượng nước và hệ thủy sinh vật Đặc biệt, các mô hình nuôi thâm canh và công nghiệp với mật độ nuôi lớn thải ra lượng nước ô nhiễm lớn hơn Nước thải từ ao nuôi cũng mang nhiều vi sinh vật gây bệnh, là nguyên nhân lan truyền dịch bệnh cho các trại nuôi lân cận Theo nghiên cứu của Lâm Minh Triết và Lê Đức Khải (2008), dịch bệnh trên cá và tôm nuôi diễn ra phức tạp, gây thiệt hại cho người nuôi Do đó, cần áp dụng biện pháp quản lý hiệu quả và tiến bộ khoa học kỹ thuật trong sản xuất để nâng cao hiệu quả nuôi trồng và xử lý chất thải trước khi thải ra môi trường.
Chăn nuôi gia súc, đặc biệt là chăn nuôi heo, đóng góp vào ô nhiễm môi trường thông qua việc phát sinh chất thải như phân, rác, lông và nước rửa chuồng Hàng năm, các khu vực chăn nuôi tạo ra hơn 100 triệu tấn phân và một lượng lớn nước thải, gây mất vệ sinh và ô nhiễm (Nguyễn Thị Hoa Lý, 2005) Chất thải chăn nuôi heo có giá trị dinh dưỡng cao nhưng cũng là nguồn ô nhiễm nghiêm trọng nếu không được quản lý hiệu quả Hậu quả của chất thải này thường là mùi hôi, bụi bẩn và thu hút côn trùng như ruồi, muỗi Nếu không được xử lý đúng cách, chất thải có thể gây ô nhiễm không khí, đất và nước, ảnh hưởng đến sức khỏe con người (Phan Thị Giác Tâm, 2001).
Chu trình nitơ
Chu trình nitơ là quá trình chuyển đổi nitơ giữa các dạng hóa học như nitrate (NO3-), nitrite (NO2-) và ammonium (NH4+), diễn ra qua cả quá trình sinh học và phi sinh học Tương tự như các chu trình khí khác, nitơ được sinh vật sản xuất hấp thụ và đồng hóa, sau đó chuyển qua các nhóm sinh vật tiêu thụ, và cuối cùng bị phân hủy, trả lại nitơ phân tử cho môi trường Các quá trình chính trong chu trình nitơ bao gồm cố định nitơ, đồng hóa, amon hóa, nitrate hóa, khử nitrate và anammox.
Sự cố định nitơ (Nitrogen fixation)
Cố định nitơ trước hết đòi hỏi sự hoạt hoá phân tử nitơ tách thành 2 nguyên tử
Nitơ (N) kết hợp với hydro để tạo thành ammonia (NH3) thông qua quá trình cố định nitơ, trong đó enzyme nitrogenase và hydrogenase đóng vai trò điều hòa quan trọng Các sinh vật có khả năng cố định nitơ chủ yếu là vi khuẩn và tảo.
Sự amon hoá (Ammonification) hay khoáng hoá (Mineralization)
Quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ giàu nitơ, như xác động thực vật và chất thải động vật, thành ammonium (NH4+) diễn ra nhờ sự hoạt động của vi khuẩn dị dưỡng và nấm trong đất và nước.
Quá trình chuyển đổi từ NH3 hoặc NH4+ thành NO2- và từ NO2- thành NO3- được gọi là quá trình nitrite hóa và nitrate hóa, thường được gọi chung là quá trình nitrate hóa Quá trình này diễn ra qua hai bước chính: đầu tiên là oxi hóa ammonium thành nitrite, sau đó là oxi hóa nitrite thành nitrate (Gerardi, 2002).
Hình 2 Quá trình nitrate hóa với sự tham gia của vi khuẩn
Trong điều kiện không có oxy, các dạng nitơ hợp chất (NO3 -
Quá trình khử nitrate, diễn ra khi NO2- bị chuyển hóa thành N2 hoặc các sản phẩm trung gian bởi vi khuẩn khử nitrate, đóng vai trò quan trọng trong việc hoàn thiện vòng tuần hoàn nitơ Mặc dù quá trình này có thể gây hại bằng cách loại bỏ nitơ cố định khỏi môi trường, nhưng nó lại có lợi trong xử lý nước thải, giúp loại bỏ nitrate và giảm thiểu sự phát triển của tảo khi nước được thải ra ao hồ và sông ngòi (Prescott et al., 2005).
Vi khuẩn oxi hóa ammonium
Vi khuẩn oxi hóa nitrite
Hình 3 Các phản ứng trong quá trình khử nitrate
Sự đồng hóa nitơ là quá trình mà nitrate hoặc ammonium được hấp thụ và chuyển đổi thành các dạng nitơ hữu cơ như amino acid và nucleic acid trong cơ thể sinh vật, chủ yếu là ở thực vật.
Sự anammox (anaerobic ammonium oxidation)
Anammox là một quá trình mới được phát hiện, trong đó ammonium được oxy hóa trong điều kiện kỵ khí Quá trình này cho phép nitrite và ammonium chuyển đổi trực tiếp thành nitơ phân tử khi thiếu oxy (Reginatto et al., 2005).
Hình 4 Các phản ứng trong quá trình chuyển hóa nitơ
Khử nitrous oxide Oxi hóa nitrite Oxi hóa ammonium
Như vậy, quá trình phân hủy các hợp chất chứa nitơ hay chuyển hóa nitơ (hình 4) bao gồm:
Chất thải của sự sống đƣợc phân hủy tạo ra NH 4 + ,
Một phần NH 4 + sinh ra đƣợc thực vật thủy sinh hấp thu,
Phần NH 4 + còn lại đƣợc vi khuẩn hiếu khí oxi hóa tạo ra NO 2 - ,
NO 2 - tạo ra đƣợc oxi hóa cho ra NO3 -
NO 3 - đƣợc hấp thu bởi thực vật thủy sinh,
Phần NO 3 - còn lại đƣợc khử bởi vi khuẩn kỵ khí, tạo ra N 2 O và N 2
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Quá trình nitrate hóa trải qua 2 giai đoạn với sự tham gia của các loài vi sinh vật khác nhau (có cả tự dƣỡng và dị dƣỡng)
Các chi vi khuẩn tự dƣỡng oxi hóa ammonium nhƣ Nitrosomonas Nitrosococcus,
Nitrosolobus,… (Watson et al., 1989) và các chi vi khuẩn tự dƣỡng khử nitrite nhƣ Nitrobacter, Nitrospira, Nitrococcus,… (Nguyễn Lân Dũng, 1983; Gerardi, 2002)
Với những thách thức trong việc phân lập và nhân giống các chi vi khuẩn tự dưỡng, nghiên cứu về vi khuẩn dị dưỡng nitrate hóa đang ngày càng gia tăng Bên cạnh đó, nhiều loại nấm cũng có khả năng nitrate hóa Các báo cáo đã chỉ ra rằng các chi vi khuẩn dị dưỡng có khả năng nitrate hóa cao bao gồm Alcaligenes, Bacillus, Thiosphaera, và Arthrobacter.
Under anaerobic conditions, certain bacterial genera can utilize nitrate as electron acceptors to metabolize other organic compounds These include Gram-negative bacteria such as Pseudomonas, Paracoccus, Clostridium, and Alcaligenes, as well as Gram-positive bacteria like Bacillus Additionally, halophilic archaea such as Haloferax denitrificans and chemolithoautotrophic bacteria like Thiobacillus denitrificans and Thiomicrospira denitrificans also exhibit this capability.
Bảng 3 Các chi vi khuẩn khử nitrate (nguồn: Gerardi, 2002)
Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn chuyển hóa nitơ
2.5.1 Nghiên cứu và ứng dụng trên thế giới
Nghiên cứu của Gunner (1963) cho thấy đa dạng vi sinh vật có khả năng oxi hóa các hợp chất chứa nitơ, bao gồm vi khuẩn dị dưỡng và nấm Cụ thể, vi khuẩn Arthrobacter globiformis và nấm Aspergillus flavus có thể oxi hóa ammonia thành hydroxylamine và nitrite Theo Bothe (2000), vi khuẩn nitrate hóa cũng rất phổ biến trong môi trường đất, nước ngọt và biển.
Vào năm 1972, Verstraete và Alexander đã nghiên cứu cơ chế nitrate hóa của vi khuẩn Arthrobacter, trong đó quá trình này diễn ra qua hai bước chính Quá trình nitrate hóa bao gồm sự tham gia của hai nhóm vi khuẩn: vi khuẩn oxi hóa ammonium và vi khuẩn khử nitrite.
1998 phân lập đƣợc Arthrobacter globiformis (một loài vi khuẩn dị dƣỡng nitrate hóa) có thể chịu đựng đƣợc 1M nitrate Dòng Arthrobacter oxydans CH8 (Chung et al.,
1997) có thể xử lý ô nhiễm ammonia đạt hiệu quả 97% và công suất 36 L/h và dòng
Arthrobacter sp 9006, isolated from lake water, can accumulate nitrite levels of up to 15 mg N/L (Karl and Hans, 1979) This bacterium has been genetically sequenced for nirS and nirK, confirming its ability to reduce nitrite and nitrate (Verbaendert et al., 2011) Additionally, various other heterotrophic bacteria, such as Alcaligenes (Castigneti and Hollocher, 1982; 1984; Wen and Wei, 2011) and Bacillus (Kim et al., 2005; Lin et al., 2005), also exhibit nitrate-reducing capabilities.
In 2007, research highlighted the capabilities of Thiosphaera pantotropha, while Verstraete and Alexander (1972) also contributed to understanding its role Alcaligenes denitrificans WY200811, isolated by Wen and Wei in 2011 from an aerobic/anaerobic treatment system, demonstrated the ability to directly convert ammonium into nitrogen gas.
Theo Gerardi (2002), nhiều loài vi khuẩn kỵ khí tùy nghi, chẳng hạn như Alcaligenes, có khả năng khử nitrate thành nitơ phân tử mà không tích lũy qua các dạng trung gian.
Bacillus, Paracoccus, and Pseudomonas are key bacterial genera studied for nitrate reduction Research by Gamble et al (1977), Ehrenreich et al (2000), Brettar et al (2001), Joseph et al (2003), and Mami et al (2006) utilized traditional culturing methods to investigate these nitrate-reducing bacteria.
Năm 2008, Acidovorax caeni sp Nov, một loài vi khuẩn gram âm mới có khả năng khử nitrate, đã được mô tả Ngoài ra, Klebsiella oxytoca (Pinar et al., 1997) cũng cho thấy khả năng loại bỏ nitơ ở nồng độ cao trong nước thải công nghiệp, từ 0,5 đến 1M Vi khuẩn Pseudomonas sp (Su et al.) cũng được nghiên cứu trong lĩnh vực này.
Năm 2006, một chủng vi sinh vật được phân lập từ bùn hoạt tính trong hệ thống xử lý nước thải chăn nuôi heo tại Đài Loan đã cho thấy tiềm năng ứng dụng cao trong việc xử lý nước thải từ chuồng trại trong tương lai.
Pseudomonas stutzeri đã được phân lập từ nhiều nguồn khác nhau, bao gồm hệ thống xử lý hiếu khí/kỵ khí (Frette et al., 1997; Wen et al., 2010), nước thải chăn nuôi (Su et al., 2001; Su et al., 2006; Miyahara et al., 2010), và môi trường đất cũng như bùn biển (Sikorski et al., 2005).
According to Robertson et al (1988), heterotrophic nitrate-reducing bacteria possess the ability to reduce nitrate Notable examples of these bacteria include Thiosphaera pantotropha, Paracoccus denitrificans, Alcaligenes faecalis, and Comamonas sp (Ahn, 2006; Su et al., 2001; von).
Munch et al (1996) and Theo Castigneti and Hollocher (1982, 1984) identified various nitrate-reducing and denitrifying bacteria, including Alcaligenes sp., Pseudomonas denitrificans, P aeruginosa, P fluorescens, and P aureofaciens Additionally, Liang et al (2011) successfully isolated strains from activated sludge.
Paracoccus denitrificans DL-23 có khả năng khử nitrate và nitrate hóa cao trong điều kiện hiếu khí Nghiên cứu của Khardenavis et al (2007) đã chỉ ra sự đồng thời giữa nitrate hóa và khử nitrate của Diaphorobacter sp Nhiều loài thuộc chi Bacillus, đặc biệt là Bacillus hiếu khí, cũng thể hiện khả năng nitrate hóa và khử nitrate mạnh mẽ (Kim et al., 2005; Lin et al., 2007) Bacillus subtilis A1 (Yang et al., 2011) cho thấy khả năng nitrate hóa và khử nitrate hiếu khí cao gấp đôi so với các dòng Bacillus khác Bacillus coagulans YX-6 (Wang và Zhao, 2012) đã giảm nồng độ NH4+ từ 1,7 mg/L xuống 0,35 mg/L và NO2- từ 0,64 mg/L xuống 0,05 mg/L Bacillus halodenitrificans sp nov (Denariaz et al., 1989), phân lập từ ruộng muối, có khả năng tích lũy nitrite và nitrate với nồng độ cao.
Nghiên cứu của Rossello et al (1994) và Ginard et al (1997) đã chỉ ra sự đa dạng về kiểu gen và kiểu hình của vi khuẩn Pseudomonas stutzeri Gần đây, các gene như amo, hao, nap, nar, nor, nir, và nos đã được áp dụng để phát hiện vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ (Moir et al., 1993).
A series of studies conducted by Berks et al (1995), Fujiwara and Fukumori (1996), Stouthamer et al (1997), Braker et al (1998), Scala and Kerkhof (2000), Bothe et al (2000), Rasmussen et al (2002), Qiu et al (2004), Rich and Myrold (2004), and Horn et al (2006) have contributed significantly to the understanding of [insert specific topic or field] These research efforts collectively highlight the advancements and findings that have shaped current knowledge in this area.
Quá trình khử nitrate bằng vi sinh vật đang được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi, đặc biệt trong lĩnh vực xử lý nước thải, nhờ vào chi phí thấp và tính thân thiện với môi trường Mặc dù quá trình này diễn ra chậm, nhưng có khả năng xử lý nước thải công nghiệp với nồng độ nitrate cao (Foglar et al., 2005) Các nghiên cứu gần đây tập trung vào việc tăng tốc phản ứng xử lý bằng cách cải thiện sự tiếp xúc giữa vi khuẩn và nitrate trong nước, thông qua việc sử dụng các đệm nhồi (Daniel et al., 2009), thiết bị tiếp xúc sinh học xoay (Teixeira et al., 2001) và bình phản ứng với màng lọc sinh học dạng sợi (Wang et al., 2009) Ayyasamy et al (2007) đã chứng minh hiệu quả cao trong xử lý nước ngầm bằng hệ thống sinh học kết hợp hóa học sử dụng Pseudomonas sp., cho thấy tiềm năng ứng dụng lớn.
Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
16S rRNA (RNA ribosome 16S) là thành phần quan trọng của tiểu đơn vị 30S trong ribosome của tế bào sơ hạch, với chiều dài khoảng 1542 nucleotide Các gen mã hóa cho 16S rRNA được gọi là 16S rDNA và chúng được sử dụng để xây dựng cây phả hệ vi sinh vật Trong tế bào vi khuẩn, có thể tồn tại nhiều chuỗi 16S rRNA khác nhau (Case et al., 2007).
16S rRNA đóng vai trò quan trọng trong cấu trúc ribosome, tương tự như 23S rRNA, bằng cách hoạt động như giàn giáo giúp xác định vị trí cho các phân tử protein ribosome Đầu 3’ của 16S rRNA chứa trình tự anti-Shine-Dalgarno, cho phép nó liên kết với bộ ba mã mở đầu AUG trên mRNA Nó cũng tương tác với 23S rRNA để hỗ trợ hình thành liên kết giữa hai bán đơn vị 30S và 50S Hơn nữa, 16S rRNA giúp ổn định liên kết chính xác giữa bộ ba mã hóa và bộ ba đối mã tại vị trí A thông qua việc hình thành liên kết hydro giữa nguyên tử N1 của Adenin ở vị trí 1492 và 1493 với gốc 2’OH của mRNA.
Trình tự gen 16S rRNA chứa các vùng siêu biến, cung cấp trình tự đặc hiệu cho việc định danh vi khuẩn, trở thành phương pháp phổ biến và chính xác (Clarridge, 2004) Woese là người tiên phong trong việc ứng dụng 16S rRNA, và gen này được sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu cây phát sinh loài nhờ tính bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn và cổ khuẩn (Weisburg et al., 1991; Coenye và Vandamme, 2003).
2.6.2 Mồi và cặp mồi tổng
Mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, giúp DNA polymerase nối dài mồi để tạo ra mạch mới Trong quá trình này, có hai loại mồi chính: mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) [Trần Linh Thước, 2005].
Cặp mồi tổng (Universal primer) là công cụ quan trọng trong phản ứng PCR, được sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA Những mồi này tập trung vào các gen có trình tự bảo tồn cao, giúp khuếch đại các gen mục tiêu với độ dài đoạn ngắn, mang lại hiệu quả cao trong nghiên cứu di truyền.
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi tổng 27F và 1492R để khuếch đại gen 16S rRNA, giúp định danh và nghiên cứu di truyền phả hệ Cặp mồi này được thiết kế bởi Weisburg et al (1991) và hiện đang được sử dụng phổ biến trong nghiên cứu di truyền.
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp nhân nhanh một đoạn DNA in vitro, được phát minh bởi Kary Mullis vào năm 1985 Hiện nay, kỹ thuật này được áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học, đặc biệt là trong sinh học phân tử.
PCR là phương pháp tạo dòng DNA in vitro, không cần tế bào, dựa trên khả năng tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn nhờ enzyme DNA polymerase và mồi chuyên biệt Kỹ thuật này cho phép khuếch đại một trình tự DNA ban đầu thành hàng triệu bản sao thông qua enzyme polymerase, cặp mồi đặc hiệu, nucleotide tự do, dung dịch đệm và các chu kỳ nhiệt Phản ứng PCR diễn ra qua nhiều chu kỳ nối tiếp nhau, với số lượng DNA bản sao được tạo ra tăng theo cấp số nhân (2^n).
Mỗi chu kì phản ứng PCR gồm 3 bước (Trần Linh Thước, 2005):
Biến tính (denaturation) là quá trình mà phân tử DNA bị tách rời thành hai mạch đơn do tác động của nhiệt độ cao, thường là từ 94°C đến 95°C trong khoảng thời gian 30 đến 60 giây, vượt quá nhiệt độ nóng chảy (Tm) của phân tử.
Bắt cặp (anealing): Nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của mồi, cho phép các mồi chuyên biệt bắt cặp với trình tự DNA khuôn Nhiệt độ 40 0 C – 70 0 C trong 30 –
Kéo dài (elongation) là quá trình mà DNA polymerase tổng hợp mạch mới từ mồi đã bắt cặp Nhiệt độ được nâng lên 72°C để tối ưu hóa hoạt động của DNA polymerase chịu nhiệt Thời gian kéo dài phụ thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại, có thể dao động từ 30 giây đến vài phút.
2.6.4 Kỹ thuật giải trình tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là phương pháp xác định các thành phần nucleotide cấu tạo nên phân tử DNA cụ thể Hiện nay, có hai phương pháp chính để thực hiện giải trình tự DNA, bao gồm phương pháp hóa học và phương pháp dideoxy.
Giải trình tự DNA bằng phương pháp hóa học do Maxam và Gilbert đề xuất năm
Phương pháp Maxam và Gilbert, được phát triển vào năm 1977, dựa trên nguyên tắc phân cắt hóa học tại các vị trí đặc biệt của các base trong DNA Phương pháp này tạo ra một phân tử DNA có đầu được đánh dấu bằng một base cụ thể (A, G, C hoặc T), từ đó cho phép đọc trình tự DNA thông qua các "ladder" hay còn gọi là "sequencing ladder".
Giải trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy là kỹ thuật do Sanger et al
Phương pháp dideoxy, được phát minh vào năm 1977, dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA Enzyme này xúc tác việc gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA tại vị trí 3’OH, và khi gặp nucleotide không có nhóm 3’OH, phản ứng tổng hợp sẽ dừng lại Phương pháp này thực hiện các phản ứng riêng rẽ với thành phần bao gồm DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Taq DNA polymerase, dung dịch đệm và khoảng 1% mỗi loại ddNTP (dideoxynucleotide) Kết quả là các đoạn oligonucleotide có độ dài khác nhau, có thể được nhận biết qua phương pháp điện di.
Ngày nay, máy giải trình tự tự động đã trở thành công cụ phổ biến trong việc giải trình tự gen Nguyên tắc hoạt động của máy dựa trên phương pháp dideoxy, cho phép đọc trình tự trên cả hai mạch đơn của DNA, giúp phát hiện và giảm thiểu sai sót kỹ thuật Để thực hiện quá trình này, hai loại mồi (mồi xuôi và mồi ngược) được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA, trong khi DNA được biến tính trong môi trường có urea và nhiệt độ cao.
Khi nhiệt độ đạt 55 độ C, các mạch đơn DNA sẽ tách rời và không tái kết hợp Sử dụng chùm tia laser, các nhà nghiên cứu có thể đánh dấu vị trí và thời gian di chuyển của các nucleotide, từ đó tổng hợp được trình tự gen một cách chính xác (Khuất Hữu Thanh, 2006).
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Thời gian và địa điểm
3.1.1 Thời gian Đề tài đƣợc thực hiện trong tám tháng từ tháng 10/2011 đến tháng 05/2012 3.1.2 Địa điểm
Các mẫu chất thải đƣợc thu ở ao cá tra và trại heo ở các quận, huyện thuộc thành phố Cần Thơ
Việc phân lập và nhận diện vi khuẩn sẽ được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh vật môi trường và phòng thí nghiệm sinh học phân tử của Viện nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học thuộc Trường đại học Cần Thơ.
Phương tiện nghiên cứu
Mẫu chất thải từ ao nuôi cá tra công nghiệp, bao gồm bùn đáy và nước, cùng với chất thải sau biogas từ các trại chăn nuôi heo, đã được thu thập tại một số quận và huyện của thành phố Cần Thơ Cụ thể, các địa điểm thu thập bao gồm quận Ô Môn, Bình Thủy, Cái Răng, Thốt Nốt và các huyện Vĩnh Thạnh, Cờ Đỏ, Phong Điền, Thới Lai.
Dụng cụ thu và trữ mẫu chất thải o Dụng cụ thu mẫu bùn o Keo nhựa, …
Dụng cụ phân lập, nuôi cấy vi khuẩn o Đĩa petri o Ống nghiệm o Que cấy o Đèn cồn
Dụng cụ pha chế môi trường o Bình tam giác o Ống đong, cốc đong (10ml, 100ml, 500ml, …)
Các dụng cụ khác o Micropipette (P20, P50, P200, P1000) [Gibson - Đức] o Eppendorf o Lame, lamelle, …
Trong quá trình phân lập vi khuẩn, các thiết bị quan trọng bao gồm tủ an toàn sinh học (Esco - Singapore), tủ ủ (Binder - Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational - Đức, Tuttnauer - Đức), và cân điện tử với độ chính xác 0,001g (Sartorius - Đức) cũng như 0,01g (Shimadzu - Nhật Bản) Ngoài ra, kính hiển vi (Olympus - Nhật Bản), máy đo pH (Eutech – Malaysia), máy lắc vòng, máy khuấy từ và máy vortex cũng là những công cụ cần thiết để đảm bảo quy trình phân lập vi khuẩn hiệu quả và chính xác.
Trong quá trình trích xuất DNA và thực hiện PCR, các thiết bị cần thiết bao gồm máy li tâm của hãng Heraus (Đức), bộ điện di và máy đọc, chụp ảnh gel từ BioRad (Mỹ), máy PCR từ Perkin Elmer và BioRad (Mỹ), máy sấy chân không, cùng với bồn nước (water bath).
Hóa chất pha môi trường: NaCl, Na 2 HPO 4 12H 2 O, KH 2 PO 4 , vi lượng (MgSO 4 7H 2 O, MnSO 4 , H 3 BO 3 , FeSO 4 7H 2 O, CaCl 2 ), NH 4 Cl, NaNO 2 , NaNO 3 , glucose, agar (theo Zhao et al., 2010)
The DNA extraction chemicals include LB (Laura Bertani medium), TE (pH 8), 10% SDS, proteinase K at 10 mg/ml, 10% CTAB with 0.7M NaCl, and a chloroform: isoamyl alcohol mixture in a 24:1 ratio Additionally, isopropanol, 70% ethanol, and double-distilled deionized water are utilized, as outlined by Breugelmans and Uyttebroek in 2004.
Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer [10X Taq buffer
(NH 4 ) 2 SO 4 ], polymerisation MgCl 2 (25mM), dNTPs, BSA (10 mg/ml),
Taq DNA polymerase (500u, 5 u/μl), nước cất 2 lần khử ion
Hóa chất dùng trong điện di sản phẩm PCR: agarose, TAE buffer 1X, loading buffer, ethidium bromide, thang chuẩn 100bp plus
Thu và bảo quản mẫu chất thải
Phân tích mẫu chất thải (Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ, pH)
Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào các dòng phân lập
Khảo sát khả năng chuyển hóa và tuyển chọn các dòng có khả năng cao
Nhận diện vi khuẩn đƣợc chọn
(Trích DNA, PCR, giải trình tự, BLAST N)
Phân tích phát sinh loài các dòng vi khuẩn đƣợc nhận diện
Hình 6 Sơ đồ qui trình thực hiện đề tài
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu đƣợc thực hiện tuần tự theo sơ đồ hình 6
3.3.1 Thu và bảo quản mẫu chất thải
Mẫu chất thải từ ao cá tra và trại heo sau biogas được thu thập từ các trại chăn nuôi heo ở các quận, huyện của thành phố Cần Thơ Số lượng mẫu được phân phối dựa trên diện tích nuôi trồng thủy sản và số lượng đàn gia súc theo dữ liệu của Cục Thống kê thành phố Cần Thơ năm 2010.
Thu mẫu chất thải trại heo (sau biogas)
Mẫu chất thải được thu thập từ đầu ra của hệ thống hầm ủ hoặc túi ủ biogas tại các trại heo Để thu thập mẫu, trước tiên cần tráng dụng cụ chứa bằng chất thải từ ống thải, sau đó tiến hành hứng chất thải, đậy nắp, ghi nhãn, và bảo quản trong điều kiện lạnh trước khi mang về phòng thí nghiệm.
Thu mẫu chất thải ao nuôi cá tra
Chỉ thu mẫu ở các ao cá tra nuôi trên 3 tháng do giai đoạn này có nguy cơ ô nhiễm ammonia từ thức ăn thừa bị phân hủy bởi vi sinh vật Mỗi ao sẽ được thu 2 loại mẫu, bao gồm mẫu nước và mẫu bùn.
Để thu mẫu nước, trước tiên cần tráng dụng cụ chứa bằng nước ao Sau đó, đậy nắp và ấn dụng cụ xuống dưới mặt nước khoảng 0,2 – 0,3m, cách bờ từ 2 – 3m Mở nắp dụng cụ để nước chảy vào từ từ; khi không thấy bọt khí nổi lên, tức là nước đã đầy Cuối cùng, đậy nắp, ghi nhãn và bảo quản mẫu nước.
Mẫu bùn đáy ao được thu thập bằng dụng cụ lấy mẫu chuyên dụng, sau đó cho vào bình chứa có nắp đậy Mẫu cần được ghi nhãn rõ ràng và bảo quản trong điều kiện lạnh trước khi mang về phòng thí nghiệm để phân tích.
Do không thể thu thập tất cả các mẫu chất thải cùng một lúc, các mẫu này được bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh ở nhiệt độ từ 2 đến 8 độ C tại phòng thí nghiệm Mỗi mẫu chất thải được mã hóa theo định dạng X.Y1.
Mẫu chất thải được phân loại theo hai yếu tố chính: X, loại chất thải (CT cho chất thải ao cá tra hoặc TH cho chất thải trại heo) và Y, tên viết tắt của quận, huyện (ví dụ: CD cho huyện Cờ Đỏ, PD cho huyện Phong Điền, OM cho quận Ô Môn) Số thứ tự của mẫu sẽ được ghi theo từng quận, huyện, chẳng hạn như CT.TN1 đại diện cho mẫu chất thải ao cá tra thứ nhất của quận Thốt Nốt.
3.3.2 Phân tích mẫu chất thải
Bài viết phân tích các mẫu chất thải dựa trên hai chỉ tiêu chính là pH và mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ, bao gồm vi khuẩn oxi hóa ammonium, vi khuẩn khử nitrite, vi khuẩn khử nitrate và vi khuẩn T, loại vi khuẩn có khả năng phát triển trong môi trường chứa cả ammonium, nitrite và nitrate.
Để xác định pH của các mẫu chất thải, sử dụng máy đo pH Eutech từ Malaysia Trước khi tiến hành đo, các mẫu chất thải cần được lắc đều Đối với mẫu chất thải cá tra, cần lắc đều nước và bùn tại cùng một địa điểm theo tỉ lệ 1:1, tức là 5g bùn kết hợp với 5ml nước.
Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mật số tế bào vi khuẩn được xác định bằng phương pháp đếm sống nhỏ giọt (drop plate) theo Hoben và Somasegaran (1982), dựa vào sự hình thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập có chứa agar.
Phương pháp gồm các công đoạn: pha loãng, nhỏ giọt, đếm khuẩn lạc và tính kết quả (hình 7)
Hình 7 Pha loãng và nhỏ giọt trong phương pháp đếm sống nhỏ giọt
Tiến trình thực hiện nhƣ sau:
Lắc đều mẫu chất thải từ trại heo hoặc hỗn hợp chất thải từ ao cá tra, bao gồm 5g bùn và 5ml nước Sau đó, hút 1ml chất thải và cho vào 99ml nước cất đã được vô trùng ở 121°C trong 20 phút Cuối cùng, lắc đều để thu được dịch pha loãng với nồng độ 10^2.
Để pha loãng, lắc đều dung dịch pha loãng 10^2, sau đó hút 1ml và cho vào 9ml nước cất vô trùng, lắc đều để thu được dung dịch pha loãng 10^3 Tiếp tục thực hiện tương tự cho các độ pha loãng tiếp theo.
Lắc đều các dung dịch pha loãng và hút 20µl từ mỗi độ pha loãng, sau đó nhỏ giọt lên đĩa petri chứa môi trường phân lập, thực hiện thao tác này 3 lần để tạo ra 3 giọt Cuối cùng, ủ đĩa ở nhiệt độ 30°C trong 48 giờ để quan sát kết quả.
Sau khi ủ, chọn đĩa petri với độ pha loãng có số lƣợng khuẩn lạc rời có thể đếm đƣợc
Tiến hành đếm số khuẩn lạc và tính kết quả theo công thức:
Mật số tế bào vi khuẩn = n v D (cfu/ml)
(n - Số khuẩn lạc trung bình trên một giọt v - Thể tích mỗi giọt dịch mẫu được nhỏ giọt D – Độ pha loãng)
3.3.3 Phương pháp xử lý số liệu
Số liệu phân tích được xử lý bằng phương pháp thống kê mô tả (Descriptive Statistics).
3.3.4 Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Nghiên cứu của Zhao et al (2010) đã sử dụng bốn loại môi trường phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ, hay còn gọi là môi trường phân lập, với các thành phần hóa chất được trình bày chi tiết trong bảng 4.
Môi trường nuôi cấy vi sinh vật được phân loại dựa trên các thành phần bổ sung: môi trường O2 với nitrite, môi trường O3 với nitrate, môi trường H4 với ammonium, và môi trường T với cả ba thành phần Sau khi pha chế, môi trường này được tiệt trùng ở nhiệt độ 121°C trong 20 phút trước khi được phân phối vào đĩa petri hoặc ống nghiệm.
