Sự hiện diện của lipid trong nước thải rất khó bị loại bỏ và phân giải do chúng không tan trong nước, vì vậy chúng gây nhiều tác động xấu đến môi trường. Việc xử lý lipid trong nước thải bằng phương pháp phân giải vi sinh đang được nghiên cứu và phát triển cũng như trở nên phổ biến trên thế giới. Trong bài nghiên cứu này, một số vi khuẩn phân giải lipid được phân lập từ nước thải của các nhà hàng và quán ăn. Việc khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid của vi khuẩn được thực hiện bằng phương pháp kiểm tra hoạt tính lipase trên môi trường thạch Tween 20 và khả năng tăng sinh của vi khuẩn trong môi trường phân lập. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được dựa trên cơ sở đặc diểm hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn và trình tự 16S rDNA. Cây phả hệ được dựng bằng phương pháp neighbourjoining. Kết quả đạt được là có ba trong tổng số năm dòng vi khuẩn phân lập được tìm thấy có khả năng phân giải lipid nhờ vào hoạt tính lipase của chúng. Các dòng có khả năng sản xuất lipase hình thành các vòng halo trên môi trường thạch Tween 20.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Mỡ, dầu thực vật và dầu nhờn (FOGs) được thải ra từ các khu công nghiệp chế biến thực phẩm, nhà hàng, bếp và các tai nạn tràn dầu, đang gia tăng đáng kể do sự phát triển đô thị hóa Tại quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ, sự xuất hiện ngày càng nhiều của quán ăn, nhà hàng và khu chung cư dẫn đến lượng dầu mỡ thải ra môi trường ngày càng lớn Nếu không được xử lý kịp thời, những chất lipid này sẽ gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến môi trường, vì chúng không tan trong nước, khiến cho việc loại bỏ và phân giải trở nên khó khăn.
Hình 1: Số lƣợng nhà hàng khách sạn qua các năm 2008 – 2011 trên địa bàn quận
Ninh Kiều, Tp.Cần Thơ
(Nguồn: chi cục thống kê quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ)
Hiện tượng tắt nghẽn ống cống thường do sự hiện diện của lipid, gây ra nhiều vấn đề môi trường Các phương pháp vật lý như vớt bỏ và chôn hoặc đốt lipid tuy hiệu quả nhưng lại tạo ra các vấn đề môi trường khác Ngoài ra, lớp váng dầu mỡ tồn tại lâu dài gây ra mùi khó chịu Phương pháp hóa học cũng được áp dụng để xử lý vấn đề này.
2 phương pháp này đạt hiệu quả cao nhưng thường tốn rất nhiều tiền khi áp dụng trên qui mô lớn
Gần đây, kỹ thuật xử lý chất thải bằng vi sinh đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học và xã hội Để đạt được hiệu quả trong xử lý, việc chọn lọc vi sinh vật có khả năng phân giải chất thải ô nhiễm dưới các điều kiện nhiệt độ, pH và dinh dưỡng khác nhau là rất quan trọng Hiện nay, nhiều loại vi sinh vật đã được phát hiện có khả năng phân giải lipid, mở ra triển vọng mới trong việc xử lý chất thải.
Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp và các loại nấm men đã được nghiên cứu trên quy mô phòng thí nghiệm Bacillus subtilis BN 1001 hiện đang được ứng dụng trong hệ thống xử lý nước thải công nghiệp chứa lipid (Akiyama, 1991) Nhiều nghiên cứu trên thế giới, đặc biệt ở Nhật Bản, Anh, Ấn Độ và Iran, đã tập trung vào việc phân lập, tối ưu hóa và ứng dụng các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải lipid Tuy nhiên, tại Việt Nam, các nghiên cứu liên quan đến vấn đề này vẫn còn khá hạn chế.
Với các lý do trên, đề tài “Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật” được thực hiện.
Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số dòng vi khuẩn có khả năng phân giải lipid từ dầu ăn thực vật
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Chất béo
Chất béo là trieste của glixerin với các acid monocacboxylic có số chẵn nguyên tử C (thường từ 12C đến 24C) không phân nhánh, gọi chung là trigliceride
Khi thủy phân chất béo thì thu được glixerin và acid béo (hoặc muối)
Chất béo có công thức chung là:
(R 1 , R 2 , R 3 là các gốc hidrocarbon no hoặc không no, không phân nhánh, có thể giống nhau hoặc khác nhau)
- Acid béo no thường gặp là:
- Acid béo không no thường gặp là:
2.1.2 Tính chất của chất béo a Tính chất vật lí
Các chất béo không hòa tan trong nước do cấu trúc gốc hydrocarbon lớn của các acid béo, điều này làm tăng tính kị nước của các phân tử chất béo Tuy nhiên, chúng có thể hòa tan trong các dung môi hữu cơ như benzene, chloroform và ether dầu hỏa, nhưng lại ít tan trong cồn.
- Độ sôi của dầu mở cao, thường trên 300 o C
- Chỉ số khúc xạ vào khoảng 1.4690 đến 1.4771
- Độ nhớt của dầu mỡ cao, từ 0.40 đến 0.92 Poado
Nhiệt độ nóng chảy của dầu mỡ phụ thuộc vào cấu tạo hóa học của chúng, trong đó các acid béo no có nhiệt độ nóng chảy cao hơn so với các acid béo chưa no Đối với acid béo chưa no, nhiệt độ nóng chảy còn phụ thuộc vào số lượng liên kết đôi và cấu trúc không gian (cis hay trans) của chúng Càng nhiều liên kết đôi trong phân tử acid béo không no, nhiệt độ nóng chảy sẽ càng thấp Đồng phân cis có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn so với đồng phân trans; ví dụ, acid oleic (13 °C) có nhiệt độ nóng chảy thấp hơn acid elaidic (51.5 °C).
Phản ứng thủy phân trong môi trường acid:
Phản ứng xà phòng hóa:
- Phản ứng xà phòng hóa xảy ra nhanh hơn phản ứng thủy phân trong môi trường acid và không thuận nghịch
Để đánh giá chất lượng của chất béo, người ta thường dựa vào hai chỉ số quan trọng Thứ nhất, chỉ số acid cho biết số miligram KOH cần thiết để trung hòa hoàn toàn các acid tự do có trong 1 gram chất béo Thứ hai, chỉ số xà phòng hóa là tổng số miligram KOH cần thiết để xà phòng hóa cả chất béo và acid tự do trong 1 gram chất béo.
Chỉ số ester là hiệu số giữa chỉ số xà phòng hóa và chỉ số acid, trong khi chỉ số iod thể hiện lượng gram iod có thể tham gia vào liên kết bội trong chuỗi carbon của 100 gram chất béo.
Phản ứng hidro hóa chất béo làm tang nhiệt độ nóng chảy của chất béo
Nối đôi C=C ở gốc acid không no của chất béo bị oxi hóa chậm bởi oxi không khí, dẫn đến sự hình thành peoxit Chất peoxit này sau đó phân hủy thành andehide, gây ra mùi khó chịu Đây chính là nguyên nhân gây ra hiện tượng dầu mỡ bị ôi thiu.
2.1.3 Sự biến đổi dầu mỡ trong quá trình chiên rán
Rán là phương pháp chế biến thực phẩm bằng cách cho nguyên liệu vào dầu nóng Các loại dầu thường được sử dụng để rán bao gồm dầu lạc, dầu bông, dầu hướng dương, dầu đậu nành và dầu cọ Đối với thịt, có thể sử dụng mỡ động vật để tăng hương vị và độ giòn cho món ăn.
Mục đích khi rán là:
- Tăng giá trị cảm quan của sản phẩm
- Tăng giá trị dinh dưỡng của sản phẩm
- Tiêu diệt hệ thống men và vi sinh vật
Những biến đổi trong quá trình rán:
Trong quá trình rán, dầu bị biến tính do tác động của nhiệt độ cao và thời gian dài, cùng với sự thoát nước từ nguyên liệu Sự hòa lẫn của các gluxit, protein và lipid tạo thành nhũ tương, kết hợp với tiếp xúc với không khí và mặt truyền nhiệt, dẫn đến sự thay đổi chất lượng của dầu.
- Khi rán độ nhớt của dầu tang do các chất dinh dưỡng trong nguyên liệu dịch chuyển vào dầu, dầu bị xẫm màu
Khi dầu được đun ở nhiệt độ cao, nó tiếp xúc với hơi nước và oxy, dẫn đến quá trình thủy phân và oxy hóa, tạo ra acid béo và glixerin Quá trình này tiếp tục hình thành các hợp chất như peoxit, andehide, xeton (có mùi ôi khét) và acrolein, một chất lỏng độc hại, gây ra khói xanh khi chiên, có thể làm cay mắt.
Hiện nay, để ngăn chặn hiện tượng hư hỏng dầu khi rán, biện pháp hiệu quả nhất là duy trì thời gian sử dụng dầu trong lò rán ở mức tối thiểu Ngoài ra, việc bổ sung chất chống oxi hóa vào dầu cũng là một phương pháp giúp bảo vệ dầu khỏi quá trình oxi hóa.
Vi sinh vật phân giải lipid
Vi sinh vật có khả năng phân hủy và loại bỏ lipid trong nước thải đóng vai trò quan trọng trong việc xử lý ô nhiễm Chúng không chỉ giúp giảm thiểu chất thải mà còn góp phần cải thiện chất lượng nước, mang lại lợi ích cho môi trường Sử dụng vi sinh vật trong các quy trình xử lý nước thải là một giải pháp hiệu quả và bền vững.
Nghiên cứu về sự phân giải các loại dầu mỡ ăn được từ vi sinh vật đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học, bao gồm Okuda và cộng sự (1991), Bednarski (1994), Wakelin và Forster (1997), Matsumiya (2007), cùng với Sugimori và Utsue (2011, 2012).
Hiện nay, các dòng vi khuẩn như Acinetobacter sp SOD-1 đã được phát hiện từ nghiên cứu của Sugimori và các đồng sự vào năm 2002 Ngoài ra, Rhodotorula pacifica ST3411 và Cryptococcus laurentii ST3412 cũng được tìm thấy trong nghiên cứu của Sugimori vào năm 2009.
Acinetobacter sp SS-192 và Pseudomonas aeruginosa SS-219 của Sugimori và Utsue vào năm 2012 có khả năng phân giải lipid
Various microorganisms are capable of producing extracellular lipase enzymes, which convert triglycerides— the primary components of vegetable oils and animal fats— into fatty acids and glycerol Examples of such microorganisms include Pseudomonas fluorescens, Chromobacterium vinosum, and fungi like Aspergillus niger, Humicola lanuginose, and Rhizopus delemar.
Candida rugosa Chúng đều tiết ra 1,3-regiospecific lipase enzyme vào môi trường nuôi dưỡng để di hóa cho việc phân giải lipid
Khả năng phân giải lipid từ dầu ăn của một số chủng vi khuẩn được thể hiện qua bảng sau:
Bảng 1: So sánh khả năng phân giải lipid của các dòng vi khuẩn
Chủng Lipid Nhiệt độ ủ và thời gian
Hỗn hợp môi trường của C cylindracea SL1B1 và B arboris SL1B1
8,000 ppm dầu ăn 3,000 ppm dầu salad
Xác định sự sinh trưởng của vi sinh vật
2.3.1 Xác định khối lượng tế bào
Sự sinh trưởng của vi sinh vật không chỉ thể hiện qua số lượng tế bào mà còn qua tổng khối lượng tế bào Để xác định trọng lượng khô của tế bào, cần ly tâm để thu nhận sinh khối, rửa sạch và sau đó làm khô trong lò sấy trước khi cân Phương pháp này rất phù hợp cho việc xác định sự sinh trưởng của nấm, tuy nhiên, nó tốn thời gian và không mẫn cảm Đối với vi khuẩn, do trọng lượng từng cá thể rất nhỏ, cần phải ly tâm từ vài trăm ml để có đủ số lượng cho việc xác định trọng lượng sinh khối khô.
Phương pháp đo độ đục bằng tán xạ ánh sáng là cách nhanh chóng và nhạy cảm để xác định nồng độ tế bào Mức độ tán xạ ánh sáng tỷ lệ thuận với nồng độ vi khuẩn trong dịch nuôi cấy Khi nồng độ vi khuẩn đạt 10^7 tế bào/ml, dịch nuôi cấy sẽ trở nên vẩn đục; nồng độ càng cao thì độ đục càng tăng.
Độ tán xạ ánh sáng trong dịch nuôi vi sinh vật có thể được đo bằng quang phổ kế, với mối quan hệ tuyến tính giữa nồng độ tế bào và giá trị hấp thụ ánh sáng ở mức độ hấp thụ thấp Khi nồng độ vi sinh vật đạt mức đo được, phương pháp đo độ đục trên quang phổ kế có thể xác định sự sinh trưởng của chúng Nếu hàm lượng một số chất trong tế bào tương đồng, tổng lượng chất đó sẽ tương quan trực tiếp với tổng sinh khối vi sinh vật Ví dụ, thu tế bào từ dịch nuôi cấy, rửa sạch và đo tổng lượng protein hoặc nitrogen cho thấy sự tăng trưởng của quần thể vi sinh vật tương ứng với sự gia tăng tổng lượng protein hoặc nitrogen Tương tự, tổng lượng chlorophyll có thể được dùng để đo sinh khối tảo, trong khi hàm lượng ATP giúp xác định sinh khối của vi sinh vật sống.
Hình 2: Đo số lượng vi sinh vật bằng phương pháp đo độ đục
Việc đo độ hấp thụ ánh sáng giúp xác định sinh khối vi sinh vật, với sự gia tăng số lượng tế bào dẫn đến tăng độ đục và mức độ tán xạ ánh sáng Quang phổ kế sẽ ghi nhận sự tăng lên của trị số hấp thụ ánh sáng, trong đó có hai thang chia độ: trị số hấp thụ ánh sáng ở phía dưới và mức độ thấu quang ở phía trên Khi trị số hấp thụ ánh sáng tăng, mức độ thấu quang sẽ giảm xuống.
(Nguồn: http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vsv14.htm, ngày 11/03/2009)
Nhận diện vi khuẩn bằng kỹ thuật sinh học phân tử
16S rRNA (RNA ribosome 16S) là thành phần quan trọng của tiểu đơn vị 30S trong ribosome của tế bào sơ hạch, với độ dài khoảng 1542 nucleotide Các gen mã hóa cho 16S rRNA được gọi là 16S rDNA và thường được sử dụng để xây dựng cây phả hệ Trong tế bào vi khuẩn, có thể tồn tại nhiều chuỗi 16S rRNA khác nhau (Case et al., 2007).
16S rRNA có vai trò quan trọng trong cấu trúc ribosome, hoạt động như giàn giáo để xác định vị trí các phân tử protein Đầu 3’ của 16S rRNA chứa trình tự anti-Shine-Dalgarno, giúp liên kết với bộ ba mã mở đầu (AUG) trên mRNA Nó tương tác với 23S rRNA để hỗ trợ hình thành liên kết giữa hai bán đơn vị 30S và 50S Ngoài ra, 16S rRNA còn ổn định liên kết chính xác giữa bộ ba mã hóa và bộ ba đối mã tại vị trí A thông qua việc hình thành liên kết hydro giữa nguyên tử N2 của Adenin tại vị trí 1492 và 1493 với gốc 2’OH của mRNA.
Trình tự gen 16S rRNA chứa các vùng siêu biến, cho phép xác định vi khuẩn một cách chính xác Phân tích trình tự gen này đã trở thành phương pháp phổ biến để định danh vi khuẩn nhanh chóng và hiệu quả.
Wose là người tiên phong trong việc ứng dụng gen 16S rRNA, một công cụ quan trọng trong nghiên cứu phát sinh loài (Weisburg et al., 1991) Gen này có tính bảo tồn cao giữa các loài vi khuẩn và cả cổ khuẩn, điều này giúp nó trở thành một chỉ thị lý tưởng cho các nghiên cứu phân loại và tiến hóa (Coenye và Vandamme, 2003).
2.4.2 Mồi và cặp mồi tổng
Mồi (primer) là các đoạn DNA ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn, giúp DNA polymerase nối dài mồi để tạo thành mạch mới Các loại mồi bao gồm mồi xuôi (forward primer) và mồi ngược (reverse primer) [Trần Linh Thước, 2005].
Cặp mồi tổng (Universal primer) là công cụ quan trọng trong phản ứng PCR, được sử dụng để khuếch đại gen 16S rRNA Những mồi này tập trung vào các gen có trình tự bảo tồn cao, giúp khuếch đại hiệu quả các gen mục tiêu với đoạn ngắn.
Thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi tổng nhằm khuếch đại gen 16S rRNA là phương pháp quan trọng để định danh và nghiên cứu thông tin di truyền phả hệ Cặp mồi phổ biến nhất được sử dụng là 27F và 1492R, được thiết kế bởi Weisburg et al (1991).
Kỹ thuật PCR (Polymerase chain reaction) là phương pháp nhân nhanh DNA do Mullis phát minh vào năm 1985 Kỹ thuật này cho phép nhân một đoạn phân tử DNA trong phòng thí nghiệm (in vitro) và hiện nay được ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực sinh học, đặc biệt là sinh học phân tử.
PCR là phương pháp tạo dòng trong in vitro, không cần hiện diện của tế bào
Kỹ thuật PCR (Phản ứng chuỗi polymerase) là phương pháp tổng hợp mạch DNA mới từ mạch khuôn bằng enzyme polymerase và mồi chuyên biệt, giúp khuếch đại một trình tự DNA ban đầu thành hàng triệu bản sao Quá trình này diễn ra nhờ sự hiện diện của nucleotide tự do, dung dịch đệm và các chu kỳ nhiệt, tạo ra một chuỗi phản ứng liên tiếp Số lượng DNA bản sao tăng theo cấp số nhân (2^n), cho phép nghiên cứu và phân tích DNA một cách hiệu quả.
Mỗi chu kỳ phản ứng PCR gồm 3 bước: (Trần Linh Thước, 2005):
Biến tính DNA là quá trình mà mạch đôi DNA tách ra thành hai mạch đơn khi nhiệt độ vượt quá nhiệt nóng chảy (Tm) của phân tử, thường diễn ra ở nhiệt độ từ 90°C đến 95°C trong khoảng thời gian 30 đến 60 giây.
- Bắt cặp (annealing): Nhiệt độ hạ thấp hơn Tm của mồi, cho phép các mồi chuyên biệt bắt cặp với trình tự DNA khuôn Nhiệt độ 40 0 C – 70 0 C trong 30 –
Kéo dài (elongation) là giai đoạn trong quá trình tổng hợp DNA, khi DNA polymerase bắt đầu tổng hợp mạch mới từ mồi đã bắt cặp Nhiệt độ được nâng lên 72°C để tối ưu hóa hoạt động của DNA polymerase chịu nhiệt Thời gian kéo dài có thể thay đổi từ 30 giây đến vài phút, tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA cần khuếch đại.
2.4.4 Kỹ thuật giải trình tự DNA
Kỹ thuật giải trình tự DNA (DNA sequencing) là phương pháp xác định các nucleotide cấu thành nên phân tử DNA cụ thể Hiện nay, có hai phương pháp chính để thực hiện giải trình tự DNA, bao gồm phương pháp hóa học và phương pháp dideoxy.
Phương pháp giải trình tự DNA hóa học do Maxam và Gilbert phát triển vào năm 1977, thường được gọi là phương pháp Maxam-Gilbert, dựa trên việc cắt hóa học tại các vị trí đặc biệt của các base Phương pháp này tạo ra các phân tử DNA được đánh dấu ở đầu, cho phép xác định trình tự DNA thông qua kết quả của các "ladder" hay còn gọi là "sequencing ladder" (Nguyễn Thị Lang và Bùi Chí Bửu, 2005).
Giải trình tự DNA bằng phương pháp dideoxy là kỹ thuật do Sanger et al
Phương pháp dideoxy, được phát minh vào năm 1977, dựa trên hoạt động của enzyme DNA polymerase trong tổng hợp DNA Enzyme này xúc tác việc gắn các nucleotide vào mạch đơn DNA tại vị trí 3’OH; khi gặp nucleotide thiếu nhóm 3’OH, phản ứng sẽ bị dừng lại một cách ngẫu nhiên Đặc trưng của phương pháp dideoxy là các phản ứng được thực hiện riêng rẽ với thành phần bao gồm DNA khuôn, DNA mồi, đầy đủ các loại dNTP, enzyme Tag DNA polymerase, dung dịch đệm và điều kiện thích hợp, cùng với khoảng 1% mỗi loại ddNTP (dideoxynucleotide: ddATP, ddGTP, ddCTP và ddTTP) Kết quả của phản ứng tổng hợp tạo ra các đoạn oligonucleotide có độ dài khác nhau, có thể được nhận diện thông qua phương pháp điện di.
Ngày nay, việc sử dụng máy giải trình tự gen tự động đã trở nên phổ biến trong nghiên cứu gen Nguyên tắc hoạt động của máy dựa trên phương pháp dideoxy, cho phép đọc trình tự trên cả hai mạch đơn của DNA, giúp phát hiện và giảm thiểu sai sót kỹ thuật Để thực hiện quá trình này, hai loại mồi, bao gồm mồi xuôi và mồi ngược, được sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA Quá trình biến tính DNA diễn ra trong môi trường có urea và ở nhiệt độ cao.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện nghiên cứu
Dụng cụ thu và trữ mẫu nước thải: o Muỗng, hủ nhựa có nắp
Dụng cụ phân lập và nuôi cấy vi khuẩn bao gồm các thiết bị như đĩa petri, ống nghiệm, que cấy, que gạt thủy tinh, đèn cồn, bình tam giác, lam, lamen, ống tuýp chạy PCR, bọc nylon cùng với chai đựng mẫu đất và mẫu nước.
Dụng cụ pha chế môi trường: o Bình tam giác, ống đong, cốc đong (10 ml, 100 ml, 500 ml, )
Các dụng cụ khác: o Micropipette (P20, P50, P200, P1000) [Gibson – Đức] o Eppendorf o Lame, lamelle, … Thiết bị:
Trong quá trình phân lập vi khuẩn, các thiết bị cần thiết bao gồm tủ an toàn sinh học (Esco – Singapore), tủ ủ (Binder – Đức), nồi khử trùng nhiệt ướt (Pbinternational và Tuttnauer – Đức), cân điện tử với độ chính xác 0,01 g (Shimadzu – Nhật Bản), kính hiển vi (Olympus – Nhật Bản), máy đo pH (Eutech – Malaysia), máy lắc vòng, máy khuấy từ và máy vortex Những thiết bị này đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo quy trình phân lập và phân tích vi khuẩn diễn ra an toàn và hiệu quả.
Thiết bị dùng trong trích DNA và PCR
Trong lĩnh vực nghiên cứu và phân tích sinh học, các thiết bị quan trọng bao gồm máy li tâm của hãng Heraus (Đức), bộ điện di và máy đọc, chụp ảnh gel từ Biorad (Mỹ), cùng với máy PCR đến từ Perkin Elmer và Biorad (Mỹ) Ngoài ra, máy sấy chân không và bể nước cũng là những thiết bị không thể thiếu trong quá trình thí nghiệm.
- Mẫu nước thải ở ống thoát nước, nơi ứ đọng hàm lượng dầu loang cao, tại các quán ăn trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ
- Dầu ăn thực vật Cooking oil của công ty cổ phần dầu thực vật Tân Bình – Nakydaco
- Primer dùng trong kỹ thuật PCR để nhận diện vi khuẩn phân lập được
3.1.3 Hóa chất a Các hóa chất pha môi trường phân lập và nuôi cấy vi khuẩn
Môi trường phân lập: 10 g dầu thực vật; 0,5 g (NH4) 2 SO 4 ; 5 g MgSO 4 7H 2 O; 1 g KH 2 PO 4
Môi trường Tween20 được chuẩn bị theo công thức gồm 10 g peptone, 5 g NaCl, 0.1 g CaCl2.2H2O và 20 g agar trong 1 l nước Sau đó, bổ sung 1% Tween20 và điều chỉnh pH về 7.5 Tween20 cần được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121°C trong 20 phút trước khi thêm vào môi trường.
● Môi trường Luria Bertani (LB) (Bennasar et al., 1998): 10 g peptone, 5 g yeast extract, 5 g NaCl, 20g agar trong 1L nước b Dùng để trích DNA vi khuẩn phân giải lipid:
- TE pH 8,0 hòa tan DNA
- Sodium dodecyl sulfate (SDS) 10% hòa tan DNA và giúp proteinase K hoạt động tách protein khỏi DNA hiệu quả hơn
- Proteinase K (20 mg/ml) để loại bỏ protein hoặc polysaccharide khỏi DNA
Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1) nhằm tủa protein và tạo màng ngăn giữa DNA và protein
- Nước cất hai lần vô trùng
● 100 àl TE dựng trớch DNA vi khuẩn gồm: 10 mM Tris-HCl [pH 7,6]; 1mM EDTA (Bennasar et al., 1998) c Dùng để chạy PCR nhận diện vi khuẩn phân giải lipid
- deoxyribonucleoside triphosphate (dNTPs) gồm dATP, dTTP, dCTP, dGTP
Phương pháp nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu được thực hiện tuần tự theo các bước sau:
2) Phân lập vi khuẩn phân giải lipid
3) Mô tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào các dòng phân lập
4) Khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid
5) Nhận diện vi khuẩn o Trích DNA, PCR, giải trình tự và BLAST N
6) Phân tích quan hệ di truyền
Thời gian thực hiện đề tài 3 tháng kể từ ngày đề cương được duyệt Địa điểm
Chúng tôi đã thu thập mẫu từ các cống thoát nước và những khu vực xả thải dầu mỡ trực tiếp tại các quán ăn ở quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ Các địa điểm này là nơi tập trung nhiều quán ăn, nơi có nguy cơ ô nhiễm môi trường do việc xả thải không đúng cách.
Dựa trên khảo sát thực tế, bài viết giới thiệu 17 mẫu thiết kế dành cho các quán ăn, nhà hàng và căn tin tại khu vực tập trung đông đúc của trường đại học Cần Thơ.
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm vi sinh vật và phòng sinh học phân tử thuộc Viện Nghiên cứu và phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Chọn địa điểm lấy mẫu từ các hố ga tại khu vực rửa chén của quán ăn, nơi trực tiếp xả thải dầu mỡ, hoặc khu vực tích tụ dầu mỡ trong nước thải từ các quán ăn ở ao hồ.
- Mẫu bao gồm nước thải, bùn hay các vết cặn bám xung quanh nơi lấy mẫu
- Mẫu được thu và trữ trong các hũ nhựa có nắp và được xử lý ngay trong ngày
3.2.2 Phân lập vi khuẩn phân giải lipid a Phân lập (isolation)
- 0.15 g mẫu đất hay 1ml nước thải cho vào 5 ml nước cất và khuấy đều
- Rút 1% huyền phù chuyển vào 5 ml môi trường phân lập sau đó đem ủ ở 30 o C và
- Dựng micropipette P200 hỳt 100 àl từ cỏc mẫu mụi trường phõn lập được chọn nhỏ lên môi trường thạch LB
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch
- Đĩa môi trường đã trãi mẫu được ủ ở 30 o C trong tủ ủ vi sinh vật từ 1 – 2 ngày để vi sinh vật phát triển
- Chọn các khuẩn lạc khác nhau phát triển trên môi trường trên cấy chuyển nhiều lần sang môi trường LB mới đến khi các khuẩn lạc rời ra
Kỹ thuật tách ròng vi khuẩn
Trong quá trình phân lập, vi khuẩn cần được tách rời từng tế bào để phát triển thành các khuẩn lạc độc lập Kỹ thuật cấy ria tách ròng được sử dụng để thực hiện việc tách rời các tế bào vi khuẩn.
Hình 3: Kỹ thuật cấy ria tách ròng
- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dưới kính hiển vi quan học Mỗi khuẩn lạc được xem là một chủng
- Mỗi chủng phân lập được cấy vào môi trường phân lập mới và ủ ở 30 o C và 180 rpm trong 24 tiếng
Để chuẩn bị tiêu bản, trước tiên, khử trùng lam kính và lamen bằng cồn và để cồn khô Tiếp theo, nhỏ 5 µl nước cất vào lam kính Sử dụng que cấy đã khử trùng trên ngọn lửa đèn cồn để lấy một ít khuẩn lạc rời và trải đều lên giọt nước trên lam kính Đặt lamen lên giọt nước bằng cách nghiêng lamen 45 độ để tiếp xúc với lam kính, hạ lamen xuống nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí Cuối cùng, quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu dưới kính hiển vi với độ phóng đại 400 lần, đồng thời mô tả dạng tế bào và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
- Cuối cùng chuyển một khuẩn lạc rời (xem như một chủng – isolate) vào ống nghiệm chứa môi trường để trữ mẫu ròng
19 c Nuôi sinh khối vi khuẩn
- Cấy chuyển khuẩn lạc đã kiểm tra độ ròng vào ống nghiệm có chứa môi trường nuôi
LB và đặt lên máy lắc để qua đêm nhằm thu sinh khối chuẩn bị mẫu tiến hành trích DNA
Các chủng vi khuẩn đã được phân lập và nuôi cấy sẽ được bảo quản trong dung dịch glycerol 15% (Hallin và Lindgren, 1999) hoặc glycerol 10% (Sikorski et al., 2002) cho đến khi cần thiết để trích xuất DNA.
3.2.3 Khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid:
Để kiểm tra hoạt tính lipase của các chủng vi khuẩn phân lập, tiến hành cấy kim vào khuẩn lạc và chuyển cấy theo đường thẳng trên đĩa môi trường Tween20 Sau đó, ủ ở nhiệt độ 30°C và quan sát sự phát triển của khuẩn lạc trong khoảng thời gian từ 2 đến 5 ngày.
- Khảo sát khả năng phân giải lipid của các chủng vi khuẩn: o Tạo giếng trên đĩa môi trường Tween20
Cắt đầu cole 1ml thành đầu có đường kính 6mm
Khử trùng đầu cole, đặt đầu cole và khoét vào đĩa môi trường Tween20
Dùng kim cấy ghim vào phần agar bị khoét và bỏ ra ngoài đĩa o Nhỏ 10 àl dịch vi khuẩn phõn lập, nuụi trong mụi trường LB lỏng trong
Trong thí nghiệm này, mẫu được ủ ở 30°C trong 24 giờ, và sau đó tiến hành quan sát và đo đường kính các vòng halo tại các mốc thời gian 24h, 48h, 72h và 96h Thí nghiệm được lặp lại ba lần để đảm bảo độ chính xác Kết quả thu được sẽ được ghi nhận và xử lý bằng phần mềm Excel 2010.
Hình 4: Tạo giếng trên đĩa môi trường Tween20
Khảo sát tốc độ sinh trưởng của các tế bào vi khuẩn phân lập được thực hiện bằng cách nuôi 1ml dịch vi khuẩn trong 100ml môi trường LB lỏng, lắc ủ ở 30°C và 140 rpm Mức độ sinh trưởng của vi khuẩn được đo bằng hấp thụ quang học (OD) ở bước sóng 660 nm theo phương pháp của Matsumiya và cộng sự (2007) Thí nghiệm được lặp lại 3 lần trong vòng 120 giờ để ghi nhận kết quả chính xác.
Phương pháp xử lý số liệu:
Sau khi ghi nhận các số liệu, chúng sẽ được xử lý bằng phần mềm Excel 2010 để kiểm tra hệ số tương quan, thực hiện phân tích phương sai và tạo biểu đồ trực quan.
3.2.4.Nhận diện (indentification) vi khuẩn
Chọn chủng vi khuẩn có khả năng tăng sinh khối tốt và phân giải lipid hiệu quả để trích ly DNA Sau đó, tiến hành giải trình tự 16S rDNA và so sánh kết quả với dữ liệu trên GenBank thông qua phần mềm BLAST của NCBI.
Qui trình li trích DNA:
Sau khi nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường LB để thu sinh khối, sẽ tiến hành trích DNA của vi khuẩn với các bước sau:
- Chuyển 4 ml dịch vi khuẩn từ ống nghiệm nuôi cấy sáng 2 tuýp Eppendorf 2 ml
- Ly tâm tuýp Eppendorf trên ở 13,000 vòng trong 5 phút Loại bỏ phần nước
- Hỳt 250 àl dung dịch TE pH=8.0 cho vào tuýp trờn Dựng tay đỏnh tan sinh khối
- Thờm vào 50 àl SDS 10% để hũa tan DNA
- Tiếp theo thờm 5 àl proteinase K (10mg/ml) để tỏch protein khỏi DNA
- Đem ủ ở 65 o C trong 20 phút, 5 phút đảo ngược tuýp 1 lần
- Thờm vào 400 àl CTAB 10% 0.7M NaCl
- Thờm vào 600 àl Chloroform: Isoamyl alcohol để tủa protein và tạo màng ngăn giữa DNA và protein, mang khẩu trang cẩn thận vì hóa chất độc
- Đem ly tâm ở 12,000 vòng trong 10 phút Loại bỏ phần nước
- DNA được rửa với 1 ml ethanol 70% (2 lần) Mỗi lần rửa sẽ đem ly tâm ở 12,000 vòng trong 5 phút
- Đem ly tâm chân không trong 15 – 20 phút ở 4 o C để loại bỏ hết ethanol
- Hũa tan trong 100 àl nước cất (Bi nước)
Khuếch đại trình tự 16S rDNA:
Sử dụng DNA của các dòng vi khuẩn làm khuôn trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi tổng 27F – 1492R (Lane et al., 1991; Turner et al.,
Bảng 2 Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn phân giải lipid (dựa trên vùng
Primer Trình tự primer (5’ – 3’) Tham khảo
AGA GTT TGA TCC TGG CTC GGC TAC CTT TGT TAC GAC TT
Lane et al., 1991 Turner et al., 1999
Bảng 3 Thành phần húa chất cho một phản ứng PCR với thể tớch 25 àl
Thành phần Nồng độ Thể tích
Nước cất 2 lần khử ion
- Thực hiện các bước tiếp theo của chu kỳ phản ứng PCR
Hình 5 Cài đặt chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR với cặp mồi tổng
Bảng 4 Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn
Bước phản ứng Tên bước Số lượng chu kỳ
Biến tính Biến tính Dán mạch Kéo dài Kéo dài
(Nguồn: chu kỳ phản ứng PCR dựa trên 16S rDNA theo Bennasar et at., 1998)
- Cuối cùng đem trữ sản phẩm khuếch đại ở 4 0 C cho đến khi dùng
Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR
Quy trình điện di được thực hiện theo các bước sau:
Để chuẩn bị khay điện di, trước tiên, đặt khay ở một đầu và đảm bảo nó nằm trên bề mặt phẳng và cân bằng Tiếp theo, cân 0,2 g agarose cho vào bình có nắp dung tích 250 ml, sau đó thêm 20 ml dung dịch TBE 1X Đặt bình vào lò vi sóng và nấu trong khoảng 2-3 phút cho agarose hoàn toàn tan chảy Khi hỗn hợp nguội xuống khoảng 65 độ C, thêm 1 µl EthBr và khuấy đều Cuối cùng, đổ nhẹ hỗn hợp vào khay điện di và để yên trong khoảng 60 phút để đông đặc.
90 phút mới đem sử dụng
Lấy lược ra khỏi khay điện di và đặt vào bể điện di Hãy trộn 10 µl hỗn hợp mẫu PCR với dung dịch loading buffer, sau đó nạp mẫu và thang chuẩn vào các giếng trên gel Bật máy điện di với hiệu điện thế 100V và chạy trong khoảng 60 – 90 phút Cuối cùng, lấy gel ra khỏi bể điện di, chụp hình dưới tia UV và quan sát các band xuất hiện trên gel.
Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng, không hiện băng phụ, …
Sản phẩm PCR đã được tinh sạch và gửi đến công ty MACROGEN tại Hàn Quốc để tiến hành giải trình tự, nhằm thu được chuỗi nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
