Phân lập và nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật

Sự hiện diện của lipid trong nước thải rất khó bị loại bỏ và phân giải do chúng không tan trong nước, vì vậy chúng gây nhiều tác động xấu đến môi trường. Việc xử lý lipid trong nước thải bằng phương pháp phân giải vi sinh đang được nghiên cứu và phát triển cũng như trở nên phổ biến trên thế giới. Trong bài nghiên cứu này, một số vi khuẩn phân giải lipid được phân lập từ nước thải của các nhà hàng và quán ăn. Việc khảo sát sơ bộ khả năng phân giải lipid của vi khuẩn được thực hiện bằng phương pháp kiểm tra hoạt tính lipase trên môi trường thạch Tween 20 và khả năng tăng sinh của vi khuẩn trong môi trường phân lập. Nhận diện các dòng vi khuẩn phân lập được dựa trên cơ sở đặc diểm hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn và trình tự 16S rDNA. Cây phả hệ được dựng bằng phương pháp neighbourjoining. Kết quả đạt được là có ba trong tổng số năm dòng vi khuẩn phân lập được tìm thấy có khả năng phân giải lipid nhờ vào hoạt tính lipase của chúng. Các dòng có khả năng sản xuất lipase hình thành các vòng halo trên môi trường thạch Tween 20.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC PHÂN LẬP VÀ NHẬN DIỆN VI KHUẨN PHÂN GIẢI LIPID TỪ DẦU ĂN THỰC VẬT Cần Thơ, năm 2013 TÓM LƢỢC Tên đề tài: “Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật” Sự diện lipid nước thải khó bị loại bỏ phân giải chúng khơng tan nước, chúng gây nhiều tác động xấu đến môi trường Việc xử lý lipid nước thải phương pháp phân giải vi sinh nghiên cứu phát triển trở nên phổ biến giới Trong nghiên cứu này, số vi khuẩn phân giải lipid phân lập từ nước thải nhà hàng quán ăn Việc khảo sát sơ khả phân giải lipid vi khuẩn thực phương pháp kiểm tra hoạt tính lipase mơi trường thạch Tween 20 khả tăng sinh vi khuẩn môi trường phân lập Nhận diện dòng vi khuẩn phân lập dựa sở đặc diểm hình thái khuẩn lạc, tế bào vi khuẩn trình tự 16S rDNA Cây phả hệ dựng phương pháp neighbour-joining Kết đạt có ba tổng số năm dịng vi khuẩn phân lập tìm thấy có khả phân giải lipid nhờ vào hoạt tính lipase chúng Các dịng có khả sản xuất lipase hình thành vịng halo mơi trường thạch Tween 20 Đường thằng tương quan dựng thể mối quan hệ thời gian đường kính vịng halo kết tủa Kết đo OD môi trường phân lập chủng dòng vi khuẩn phân lập tăng 96 AL1 MT8 có tương đồng cao (ở mức 99%) với hai loài Acinetobacter baumanii Bacillus cereus, qua phân tích BLAST N Cây phả hệ mơ tả chúng có quan hệ gần gũi với Từ khóa: nước thải, phân giải lipid, Tween 20, vòng halo i MỤC LỤC Trang TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG .v DANH SÁCH HÌNH .vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài .2 CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Chất béo 2.1.1 Khái niệm 2.1.2 Tính chất chất béo 2.1.3 Sự biến đổi dầu mỡ trình chiên rán .5 2.2 Vi sinh vật phân giải lipid: .6 2.3 Xác định sinh trƣởng vi sinh vật .7 2.3.1 Xác định khối lượng tế bào 2.4 Nhận diện vi khuẩn kỹ thuật sinh học phân tử 2.4.1 Trình tự 16S rRNA 2.4.2 Mồi cặp mồi tổng 2.4.3 Kỹ thuật PCR .10 2.4.4 Kỹ thuật giải trình tự DNA 10 ii 2.4.5 Công cụ BLAST 11 2.4.6 Phân tích phát sinh lồi 12 CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 14 3.1 Phƣơng tiện nghiên cứu .14 3.1.1 Dụng cụ, thiết bị 14 3.1.2 Nguyên vật liệu 15 3.1.3 Hóa chất .15 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu .16 3.2.1 Thu mẫu .17 3.2.2 Phân lập vi khuẩn phân giải lipid 17 3.2.3 Khảo sát sơ khả phân giải lipid: 19 3.2.4.Nhận diện (indentification) vi khuẩn 20 3.2.5 Phân tích quan hệ di truyền .24 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 25 4.1 Kết thu mẫu chất thải 25 4.2 Kết phân lập vi khuẩn phân giải lipid .25 4.3 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc dịng vi khuẩn phân lập 26 4.4 Đặc điểm tế bào dòng vi khuẩn phân lập .27 4.5 Khảo sát sơ khả phân giải lipid dòng vi khuẩn phân lập .27 4.5.1 Kiểm tra hoạt tính lipase dịng vi khuẩn phân lập 27 4.5.2 Khảo sát khả phân giải lipid chủng vi khuẩn phân lập 28 4.5.3 Khảo sát mức độ sinh trưởng tế bào vi khuẩn phân lập 30 4.6 Nhận diện dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid .31 iii 4.6.1 Kết điện di sản phẩm PCR 31 4.6.2 Kết giải trình tự nhận diện vi khuẩn 31 4.7 Phân tích quan hệ di truyền dòng vi khuẩn phân lập đƣợc với dịng vi khuẩn tƣơng đồng trình tự 16S rDNA NCBI 33 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 35 5.1 Kết luận 35 5.2 Đề nghị 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO 36 PHỤ LỤC .1 Phụ lục Kết Bảng Kết đo bán kính vòng halo (cm) Bảng 10: Kết đo OD dòng vi khuẩn nuôi môi trường quan sát bước sống 660nm Phụ lục Kết thống kê Bảng kết phân tính phương sai hai nhân tố lần lặp lại thí nghiệm đo OD Phụ lục 3: Kết giải trình tự Kết giải trình tự 16S rDNA dòng vi khuẩn nhận diện iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: So sánh khả phân giải lipid dòng vi khuẩn Bảng 2: Trình tự primer dùng nhận diện vi khuẩn phân giải lipid (dựa vùng 16S rDNA) 21 Bảng 3: Thành phần hóa chất cho phản ứng PCR với thể tích 25 µl 21 Bảng 4: Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA vi khuẩn 23 Bảng 5: Danh sách mẫu chất thải thu nhà hàng, quán ăn địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ 26 Bảng 6: Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập 27 Bảng 7: Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập quan sát kính hiển vi độ phóng đại 400 lần 28 Bảng 8: Kích thước đoạn gen 16S rDNA giải trình tự dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid 32 v DANH SÁCH HÌNH Trang Hình Số lượng nhà hàng khách sạn qua năm 2008 – 2011 địa bàn quận Ninh Kiều, Tp.Cần Thơ .1 Hình Đo số lượng vi sinh vật phương pháp đo độ đục .8 Hình Kỹ thuật cấy ria tách ròng 18 Hình Tạo giếng đĩa môi trường Tween20 20 Hình Cài đặt chu kỳ gia nhiệt phản ứng PCR với cặp mồi tổng 23 Hình 6: Quan sát khuẩn lạc sau cấy trãi 27 Hình 7: Khuẩn lạc dòng vi khuẩn phân lập 28 Hình 8: Kiểm tra hoạt tính lipase dịng vi khuẩn mơi trường Tween20 29 Hình 9: Sự tương quan đường kính halo thời gian ủ dòng vi khuẩn phân lập 30 Hình 10: Khảo sát halo xung quanh giếng thạch Tw20 dòng vi khuẩn MT8 30 Hình 11: Phổ điện di sản phẩm PCR nhân lên từ đoạn gen 16S rDNA dòng vi khuẩn cần nhận diện 32 Hình 12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền ba dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid dầu ăn thực vật 35 vi TỪ VIẾT TẮT BLAST Basic Local Alignment Search Tool BLAST N Nucleotide BLAST BSA Bovine Serum Albumin Acetyllated CTAB Cetyl Trimethyl Ammonium Bromide ddNTP Dideyribonucleoside Triphosphate DNA Deoxyribose Nucleic Acid EDTA Ethylene Diamin Tetra Acetic Acid EtBr Ethidium Bromide LB Lauria Bertani NCBI The National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PHYLIP Phylogeny Inference Package SDS Sodium Dodecyl Sulfate Taq Thermus aquaticus TBE Tris Boric EDTA TE Tris EDTA Tm Melting temperature Tween 20 Polysorbate 20 vii CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Mỡ, dầu thực vật dầu nhờn (Fats, oils and greases – FOGs) thải ngồi mơi trường với nước thải xuất phát từ khu công nghiệp chế biến thực phẩm, nhà hàng, bếp tai nạn tràn dầu Lượng nước thải giàu lipid ngày tăng năm phát triển đô thị hóa Đặc biệt, địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ, ngày xuất nhiều thêm quán ăn, nhà hàng khu chung cư lượng dầu mỡ thải ngày tăng Nếu không xử lý, chúng ảnh hưởng lớn đến mơi trường lipid khơng khơng tan nước nên khó loại bỏ hay phân giải chúng Hình 1: Số lƣợng nhà hàng khách sạn qua năm 2008 – 2011 địa bàn quận Ninh Kiều, Tp.Cần Thơ (Nguồn: chi cục thống kê quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ) Hiện tượng tắt nghẽn ống cống hay ống nước thải thường xuyên xảy diện lipid Hiện có nhiều phương pháp áp dụng để loại váng dầu mỡ phương pháp vật lý, vớt bỏ lớp váng khỏi nước thải đem chơn lịng đất đem đốt, hiệu Tuy nhiên, việc đốt hay chôn lipid lại gây vấn đề ảnh hưởng môi trường khác (Sugimori et al., 2002) Hơn nữa, lớp váng dầu mỡ tồn bên môi trường thời gian dài thường gây mùi khó chịu Phương pháp hóa học áp dụng vào việc xử lý vấn đề Mặc dù hai phương pháp đạt hiệu cao thường tốn nhiều tiền áp dụng qui mô lớn Trong thời gian gần đây, kỹ thuật xử lý chất thải vi sinh thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học xã hội Để việc xử lý thành công, điều cần thiết phải chọn lọc vi sinh vật có khả phân giải chất thải gây ô nhiễm điều kiện nhiệt độ, nồng độ pH dinh dưỡng khác Hiện nay, có nhiều vi sinh vật phát có khả phân giải lipid Pseudomonas aeruginosa, Bacillus sp loại nấm men qui mơ phịng thí nghiệm Ngoài ra, Bacillus subbtilis BN 1001 sử dụng hệ thống xử lý nước thải công nghiệp có chứa lipid (Akiyama, 1991) Các đề tài nghiên cứu phân lập, tối ưu hóa áp dụng chủng vi khuẩn có khả phân giải lipid thực nhiều giới, đặc biệt nước Nhật Bản, Anh, Ấn Độ Iran Ở Việt Nam, nghiên cứu vấn đề cón Với lý trên, đề tài “Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số dòng vi khuẩn có khả phân giải lipid từ dầu ăn thực vật Đường kính (mm) 1 Thời gian ủ Hình 9: Sự tƣơng quan đƣờng kính nhân rộng halo thời gian ủ dòng vi khuẩn phân lập (Hệ số tương quan r ba đường gần 1; đường kính nhân rộng halo = tổng đường kính halo – đường kính giếng ) halo Hình 10: Khảo sát halo xung quanh giếng thạch Tw20 dịng vi khuẩn MT8 Nhận xét: Hoạt tính lipase tăng kèm theo đường kính halo xuất xung quanh khuẩn lạc tăng, việc sử dụng kỹ thuật áp dụng để khảo sát sơ khả phân giải lipid vi sinh vật (M Samad et al., 1988) Dịng MT9 có hoạt tính lipase cao trội so với dòng MT8 AL1 29 4.5.3 Khảo sát mức độ sinh trưởng tế bào vi khuẩn phân lập Kết đo OD dòng vi khuẩn phân lập bảng phân tích anova phần phụ lục Sau phân tích phương sai hai nhân tố lần lặp lại phần mềm excel 2010, kết có sau: • Bảng ANOVA: Cột nguồn biến động: - Sample: Biến động nhân tố dòng vi khuẩn tạo nên (do xếp theo hàng) - Columns: Biến động nhân tố thời gian tạo nên (do xếp theo cột) - Interaction: Tác động qua lại - Within: Biến động ngẫu nhiên - Total: Biến động n giá trị quan sát Từ kết cho thấy: o FSample = 53.34 > F0.05 = 3.4; Vậy dòng vi khuẩn phân giải lipid dầu ăn thực vật khác có tốc độ tăng trưởng khác o FColumns = 1017.39 > F0.05 = 3.01; Trong khoảng thời gian 96 đồng hồ, tốc độ sinh trưởng vi khuẩn thay đổi o FInteraction = 181.91 > F0.05 = 2.5; Cả hai nhân tố dòng vi khuẩn thời gian tác động đến số đo OD660  Qua đây, mức độ tăng trưởng dịng vi khuẩn mơi trường phân lập có nguồn cung cấp carbon từ dầu ăn thực vật, đánh giá theo thứ tự dựa tổng giá trị trung bình nghiệm thức: MT9 ˃ MT8 ˃ AL1 mặt thống kê 30 4.6 Nhận diện dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid 4.6.1 Kết điện di sản phẩm PCR 4 1.500 bp Hình 11: Phổ điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ đoạn gen 16S rDNA dòng vi khuẩn cần nhận diện (Giếng (1): thang chuẩn 100bp plus, (2): dòng AL1, (3): dòng MT8, (4): dòng MT9, (5): đối chứng âm) Hình 10 trình bày kết điện di sản phẩm PCR khuếch đại trình tự gen 16S rDNA dòng vi khuẩn cần nhận diện Qua phổ điện di cho thấy sản phẩm PCR có chiều dài khoảng 1500bp khơng có sản phẩm phụ 4.6.2 Kết giải trình tự nhận diện vi khuẩn Kết giải trình tự dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid trình bày phụ lục Chiều dài đoạn gen 16S rDNA giải trình tự dịng vi khuẩn nhận diện trình bày bảng sau: Bảng 8: Kích thƣớc đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid Kí hiệu Chiều dài đoạn gen 16S rDNA giải trình tự Dòng AL1 1384 nucleotide Dòng MT8 1418 nucleotide Dòng MT9 1375 nucleotide 31  Kết BLAST N dòng AL1 sở liệu NCBI: Dòng AL1 có trình tự 16S rDNA tương đồng 99% với trình tự dòng Acinetobacter baumannii (KF055001 JN162444)  Kết BLAST N dòng MT8 sở liệu NCBI: Dịng MT8 có trình tự 16S rDNA tương đồng 99% với trình tự dịng Bacillus cereus Bacillus thuringiensis (GU122949 JX010983)  Kết BLAST N dòng MT9 sở liệu NCBI: 32 Dịng MT9 có trình tự 16S rDNA tương đồng 99% với trình tự dịng Acinetobacter bereziniate (JX035952 HE651922) Như vậy, qua BLAST N sở liệu NCBI tạm khẳng định dòng vi khuẩn phân giải lipid phân lập dòng Acinetobacter sp Bacillus sp Theo Sugimori Utsue (2012), Acinetobacter vi khuẩn gram âm, hiếu khí, tế bào dạng cầu (spheroid) có đường kính 0.8 – 0.9 µm, di động; có khuẩn lạc màu kem Hai dòng vi khuẩn AL1 MT9 phân lập có đặc điểm phù hợp với mơ tả nghiên cứu Theo Nur Hidayat (2011), Bacillus cereus N-09 vi khuẩn có khả phân giải lipid, phân lập đường ống thoát nước nhà hàng Bacillus cereus có vi khuẩn dạng que, có kích thước lớn so với vi khuẩn khác, 1× 3-4 µm, gram dương hình thành nội bào tử (theo microbewiki.kenyon.edu) Các đặc điểm nguồn gốc phân lập tương đồng với dòng MT8 4.7 Phân tích quan hệ di truyền dịng vi khuẩn phân lập đƣợc với dòng vi khuẩn tƣơng đồng trình tự 16S rDNA NCBI Từ phả hệ hình 11, nhận xét thấy N1 (tương ứng với dòng vi khuẩn AL1) nhánh với dòng Acinetobacter baumannii (KF055001 JN162444) với độ tương đồng trình tự nucleotide 98% Điều phù hợp với kết luận ban đầu qua kết BLAST N Tương tự với N2 (tương ứng với dòng vi khuẩn MT8) Bacillus cereus GU122949 Với dòng vi khuẩn N5 (tương ứng với dòng vi khuẩn MT9) nhánh với dòng Acinetobacter baumannii mức độ tương đồng trình tự nucleotide 33 47% có khoảng cách xa với nhánh dịng Acinetobacter berezinieae JXD35952 HE651922, kết khơng tương đồng với kết BLAST N 98 KF055001_Acinetobacter_baumannii_strain_IARI-JR-51 100 47 JN162444_Acinetobacter_baumannii_strain_MMG_5b N1 N5 24 N2 100 GU122949_Bacillus_cereus_strain_DBT3ST4 JX010983_Bacillus_thuringiensis_strain_B62 JX035952_Acinetobacter_bereziniae_strain_JDG127 HE651922_Acinetobacter_bereziniae_strain_ATCC_17924 46 0.5 Hình 12: Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền ba dòng vi khuẩn có khả phân giải lipid dầu ăn thực vật (Cây phả hệ vẽ theo phương pháp Neighbour-joining dựa vào trình tự 16S rDNA, nút giá trị bootstrap sở 1500 lần lặp lại) 34 CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận  Chọn ba chủng vi khuẩn khuẩn có khả phân giải lipid tổng số chủng vi khuẩn phân lập  Dựa vào đánh giá sơ khả phân giải lipid qua phương pháp đo đường kính vịng halo kết tủa mơi trường Tween20, MT9 xem dịng có hoạt tính lipase cao so với hai dòng AL1 MT8  AL1 MT8 xác định thuộc dịng Acinetobacter baumannii Bacillus cereus có độ tương đồng trình tự 16S rDNA quan hệ gần gũi thể phả hệ mức 99% Kết xác định dịng MT9 chưa có thống hai phương pháp, nhiên xác định sơ MT9 thuộc loài Acinetobacter dựa kết ghi nhận 5.2 Đề nghị - Khảo sát tốc độ phân giải lipid dòng phân lập điều kiện mơi trường khác để có kết luận xác khả phân giải lipid - Tối ưu hóa điều kiện sản xuất lipase dòng phân lập - Khảo sát khả phân giải lipid nước thải dòng phân lập 35 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Hồ Huỳnh Thùy Dương 2002 Sinh học phân tử (tái lần 2) Nxb Giáo dục, chương 14 Khuất Hữu Thanh 2003 Cơ sở di truyền phân tử kỹ thuật gen Nxb Khoa học kỹ thuật Hà Nội, trang 137-139 Nguyễn Thị Lang Bùi Chí Bửu 2005 Sinh học phân tử Giới thiệu phương pháp ứng dụng Nxb Nơng nghiệp Tp.Hồ Chí Minh, trang 107-114 Phạm Thành Hổ 2005 Nhập môn công nghệ sinh học Nxb Giáo dục, chương Trần Linh Phước 2005 Phương pháp phân tích vi sinh vật, Nxb Giáo dục Trịnh Lê Hùng 2006 Cơ sở hóa sinh Nxb Giáo dục Hà Nội Tiếng Anh Altschul S.F., W Gish, W Miller, E.W Myers and D.J Lipman 1990 Basic local alignment search tool J Mol Biol., 215(3): 403-410 Akiyama S 1991 Present situation and prospect of recovered oil use Degradation of fat and oil by “Bacillus subtilis BN 1001” Yushi, 44:46-51 Bednarski W., Adamczak M., Kowalewska-Piontas J and Zadernowski R 1994 Biotechnological methods for the up-grading and modification of animal waste fats Acta Biotechnol, 14(4):387-393 Bennasar A., C Guasp and J Lalucat 1998 Molecular methods for the detection and identification of Pseudomonas stutzeri in pure culture and environmental samples Microd Ecol, 35:22-33 Breugelmans P and M Uyttebroek 2004 Protocol for DNA extraction and purification Laboratory of soil and water management,K.U Leuven Brinkman F.S.L and D.D Leipe 2001 Bioinformatics: A Practical Guide to the Analysis of Genes and Proteins, Second Edition: Phylogenetic Analysis John Wiley & Sons, Inc 36 Clarridge J.E 2004 Impact of 16S rRNA Gene Sequence Analysis for Identificaiton of Bacteria on Clinical Microbiology and Infectious Diseases, Clin Microbiol Rev., 17:840-862 Coenye T and P Vandamme 2003 Intragenomic heterogentic between multiple 16S ribosomal RNA operons in sequenced bacterial genomes FEMS Microbiol., 228(1): 45-54 E El-Bestawy, M H El-Masry and N El-Adl 2005 The potentiality of free Gramnegative bacteria for removing oil and grease from containing industrial effluents.World Journal of Microbiology and Biotechnology, 21:815-822 Efron B 1979 Bootstrapping methods: Another look at the jackknife Ann Stat., 7:126 Felsenstein J.1985 Confidence intervals on phyenies: An approach using the bootstrap Evolution., 39:783-791 Hallin S and Lindgren P 1999 PCR detection of genes encoding nitrite reductase in denitrifying bacteria Appl Environ Microbiol., 65(4):1652-1657 Lane D.J 1991 16S/23S rRNA sequencing Nucleic acid techniques in bacterial systematics, pp 115-175 Edited by E Stackebrandt and M.Goodfellow New York: Wiley Matsumiya Y, Wakita D, Kimura A, Sanpa S, Kubo M 2007 Isolation and characterization of a lipid-degrading bacterium and its application to lipidcontaining wastewater treatment Journal of Bioscience and Bioengineering, 103(4):325-330 Mohd Y A Samad, C Nyonya A Razak, Abu B Salleh, W.M Zin Wan Yunus, Kamaruzaman Ampon Mahiran Basri 1988 A plate assay for primary screening of lipase activity Journal of Microbiological Methods, 9: 51-56 Nur Hidayat 2011 Optimization of pH, temperature and agitation rate on biodegradation of lipids and detergents in food wastewater by Bacillus sp N-09 Journal of Agriculture and Food Technology, 1(5): 59-62 Sanger F., S Nicklen, A.R Coulson 1977 DNA sequencing with chain-terminating inhibitors Proc Natl Acad Sci U.S.A., 74(12): 5463-5470 37 Saitou, N Nei, M 1987 The neighbor-joining method: a new method for reconstruciting phylogenetic trees Mol Biol Evol., 4:406-425 Sikorski J., R Rossello- Mora and M G Lorenz 1999 Analysis of genomic diversity and relationships among Pseudomonas stutzeri strains by PCR based genomic fingerpringting and multilocus enzyme electrophoresis, Syst Appl Microbiol., 22:393-402 Sugimori D., Nakamua M., Tusbochi N., Tusbochi K., Obata T., Uzura K and Miyazaki K 2002 Treatment of lipid contaminated wastewater by lipiddegrading microbial preparation Seibutsu-kogaku, 80:559-562 Sugimori D and Utsue T 2012 A study of the efficiency of edible oils degraded in alkaline conditions by Pseudomonas aeruginosa SS-219 and Acinetobacter sp SS-192 bacteria isolated from Japanese soil World J Microbiol Biotechnol, 28:841-848 Paparaskevas D., Christakpoulas P., Kekos D and Macris J.B 1992 Optimization production of extracellular lipase from Rhodotorula glutinis, Biotechnology Letters, 14:397-402 Turner S., Pryer K.M., Miao V.P.W and Palmer, J.D 1999 Investigating deep phylogenetic relationships among cyanobacteria and plastids by small subunit rRNA sequence analysis Journal of Eukaryotic Microbiology 46:327-338 Vilma C, Saulius G and Egidijus B 2009 Selection of fat-degrading microorganisms for the treatment of lipid-contaminated environment Biologija, 55:84-92 Weisburg, W.G., S.M Barns, D.A Pelletier and D.J Lane 1991 16S ribosomal DNA amplification for phylogenetic study J.Bacteriol., 173(2): 697-703 Trang Web http://vietsciences.free.fr/khaocuu/nguyenlandung/vsv14.htm, ngày 11/03/2009 http://microbewiki.kenyon.edu/index.php/Bacillus_cereus, ngày 22/04/2011 38 PHỤ LỤC Phụ lục Kết Bảng Kết đo bán kính vịng halo (cm) AL MT8 MT9 24 48 72 96 12 16 19 24 12 15 18 23 12 16 19 24 12 16 21 25 12 16 21 25 13 17 22 28 13 20 29 38 13 19 28 40 14 21 30 42 Bảng 10: Kết đo OD dòng vi khuẩn nuôi môi trường quan sát bước sống 660nm AL MT8 MT9 24 g 48 g 72 g 96 g 0.209 0.259 0.467 0.565 0.257 0.255 0.473 0.561 0.214 0.271 0.474 0.571 0.124 0.142 0.349 1.135 0.135 0.155 0.363 1.117 0.142 0.167 0.353 1.131 0.359 0.425 0.559 0.695 0.282 0.305 0.552 0.666 0.353 0.343 0.573 0.689 Phụ lục Kết thống kê Bảng kết phân tính phương sai hai nhân tố lần lặp lại thí nghiệm đo OD SUMMARY 24h 48h 72h 96h Total Count 3 3 12 Sum 0.68 0.785 1.414 1.697 4.576 Average 0.226667 0.261667 0.471333 0.565667 0.381333 Variance 0.000696 6.93E-05 1.43E-05 2.53E-05 0.022052 Count 3 3 12 Sum 0.401 0.464 1.065 3.383 5.313 Average 0.133667 0.154667 0.355 1.127667 0.44275 Variance 8.23E-05 0.000156 5.2E-05 8.93E-05 0.178797 Count 3 3 12 Sum 0.994 1.073 1.684 2.05 5.801 Average 0.331333 0.357667 0.561333 0.683333 0.483417 Variance 0.001834 0.003761 0.000114 0.000234 0.024257 AL MT8 MT9 Total Count 9 9 Sum 2.075 2.322 4.163 7.13 Average 0.230556 0.258 Variance 0.007988 0.008731 0.008071 0.065977 0.462556 0.792222 ANOVA Source of Variation SS df MS F P-value F crit Sample 0.063387 0.031694 53.34373 1.47E-09 3.402826 Columns 1.813417 0.604472 1017.392 2.04E-25 3.008787 Interaction 0.648492 0.108082 181.9136 8.6E-19 2.508189 Within 0.014259 24 0.000594 Total 2.539555 35 Phụ lục 3: Kết giải trình tự Kết giải trình tự 16S rDNA dịng vi khuẩn nhận diện Trình tự 16S rDNA dòng AL (1384 nu): GGCGGCAGGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGGGGGAAGGTAGCTTGCTACCGGACCTAGCGGCGGACG GGTGAGTAATGCTTAGGAATCTGCCTATTAGTGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCA TACGTCCTACGGGAGAAAGCAGGGGATCTTCGGACCTTGCGCTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAG CTAGTTGGTGGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACA CTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAA CCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGA GGCTACTCTAGTTAATACCTAGGGATAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGC CAGCAGCCGCGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGC GGCTTATTAAGTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGTGAGCTAG AGTATGGGAGAGGATGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCG ATGGCGAAGGCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATT AGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGCCTTTGAGGCTTTAGTGGC GCAGCTAACGCGATAAGTAGACCGCCTGGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGAC GGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGGGGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGCCT TGACATACTAGAAACTTTCCAGAAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAATCTAGATACAGGTGCTGCATGG CTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAAGGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTTTCCTTACT TGCCAGCATTTCGGATGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGGAGGAAGGCGGGGGACGA CGTCAAGTCATCATGGCCCTTACGGCCAGGGCTACCCCCGTGCTACAATGGGCCGGTACAAAGGGTTG CTACCCAGCGATTTGATGCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTAGTCCGGATTGGAGTCTGGCAACTCGAC TCCATGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGT AACACCGCCCGTCCCACATTGAGA Trình tự 16S rDNA dòng MT8 (1418 nu): TGGCGGCGTGCCTATACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGG ACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATAC CGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACC CGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGG GTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCC GCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTG TTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACG GCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAA AGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAA ACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATAT GGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGA GCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTTAGAGGGTTTC CGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAAC TCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAA CCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGAAAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACA GGTTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAAC CTTTGATCTTAGTTGCCATCATTAAGTTGGGCACTCTTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAA AAGGGGGGGGATGACGTCAAATCATCATGGCCCCTTATTGACCTGGGCCTACACACGTGCTTACAATG GGACGGTGCAAAAGGCTTGCAAAACCCCCAGGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCCGG ATTGTAGGCTGCAACTCGCCTCCATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATGCGGGATCAGCATGCCGCGGTG AAAACATTCCCCGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTACCCCCC Trình tự 16S rDNA dòng MT9 (1375 nu): GCTTACCATGCAGTCGAGCGGGGGAGGTTGCTTCGGTAACTGACCTAGCGGCGGACGGGTGAGTAATA CTTAGGAATCTGCCTATTAATGGGGGACAACATCTCGAAAGGGATGCTAATACCGCATACGCCCTACG GGGGAAAGCAGGGGATCACTTGTGACCTTGCGTTAATAGATGAGCCTAAGTCGGATTAGCTAGTTGGT GGGGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCGGGTCTGAGAGGATGATCCGCCACACTGGGACTG AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGGACAATGGGGGGAACCCTGATCC AGCCATGCCGCGTGTGTGAAGAAGGCCTTATGGTTGTAAAGCACTTTAAGCGAGGAGGAGGCTCTTTT GGTTAATACCCAAGATGAGTGGACGTTACTCGCAGAATAAGCACCGGCTAACTCTGTGCCAGCAGCCG CGGTAATACAGAGGGTGCGAGCGTTAATCGGATTTACTGGGCGTAAAGCGTGCGTAGGCGGCTTTTTA AGTCGGATGTGAAATCCCCGAGCTTAACTTGGGAATTGCATTCGATACTGGGAAGCTAGAGTATGGGA GAGGATGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGATGGCGAAG GCAGCCATCTGGCCTAATACTGACGCTGAGGTACGAAAGCATGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCT GGTAGTCCATGCCGTAAACGATGTCTACTAGCCGTTGGGGTCTTTGAGACTTTAGTGGCGCAGCTAAC GCGATAAGTAGACCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGC ACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGTCTTGACATAGTAA GAACTTTCCAGAGATGGATTGGTGCCTTCGGGAACTTACATACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCT CGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCTTTTCCTTACTTGCCAGCATTTCGG ATGGGAACTTTAAGGATACTGCCAGTGACAAACTGGAGGAAGGCGGGGACGACGTCAAGTCATCATGG CCCTTACGACCAGGGCTACACCCTTGCTACAATGGTCGGTACAAAGGGTTGCTACCTACCGATAGGAT GCTAATCTCAAAAAGCCGATCGTATTTCCGGATTGGAGTCTGCAACTCGACTCCATGAAATCGGAATC GCTAGGAATCGCGGATCAGAATGCCGCGGTGAATACGTTCACCGGGCTTGAACACCCGCCCTAAACAT TGGGATTGTTGCCCC ... Với lý trên, đề tài ? ?Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số dịng vi khuẩn có khả phân giải lipid từ dầu ăn thực vật CHƢƠNG LƢỢC KHẢO... ? ?Phân lập nhận diện vi khuẩn phân giải lipid từ dầu ăn thực vật? ?? Sự diện lipid nước thải khó bị loại bỏ phân giải chúng không tan nước, chúng gây nhiều tác động xấu đến môi trường Vi? ??c xử lý lipid. .. dòng vi khuẩn phân lập .27 4.5 Khảo sát sơ khả phân giải lipid dòng vi khuẩn phân lập .27 4.5.1 Kiểm tra hoạt tính lipase dịng vi khuẩn phân lập 27 4.5.2 Khảo sát khả phân giải lipid