PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ CÀNH NON CÂY MĂNG CỤT TRỒNG TẠI HUYỆN CHỢ LÁCH TỈNH BẾN TRE

Nấm mốc là một trong những vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Chính vì vậy, từ lâu nấm mốc đã trở thành đối tượng để các nhà khoa học nghiên cứu và sản xuất ra chất kháng sinh với mục đích chữa bệnh. Đề tài “Phân lập một số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non cây Măng cụt trồng tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre” nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao. Trong phạm vi khảo sát của đề tài đã phân lập được 34 chủng nấm mốc trên môi trường Potato Dextrose Agar. Trong đó có 2 dòng được phân lập tại xã Phú Phụng, 4 dòng tại xã Hưng Khánh Trung B, 5 dòng tại xã Vĩnh Thành, 7 dòng tại xã Long Thới, 8 dòng tại xã Sơn Định và 8 dòng tại xã Tân Thiềng.

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH VI SINH VẬT HỌC PHÂN LẬP MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC CÓ HOẠT TÍNH KHÁNG KHUẨN TỪ CÀNH NON CÂY MĂNG CỤT TRỒNG TẠI HUYỆN CHỢ LÁCH, TỈNH BẾN TRE Năm 2016 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ TÓM TẮT Nấm mốc vi sinh vật có khả sinh kháng sinh có ý nghĩa quan trọng mặt lịch sử lẫn y học Chính vậy, từ lâu nấm mốc trở thành đối tượng để nhà khoa học nghiên cứu sản xuất chất kháng sinh với mục đích chữa bệnh Đề tài “Phân lập số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non Măng cụt trồng huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre” nhằm mục đích phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao Trong phạm vi khảo sát đề tài phân lập 34 chủng nấm mốc môi trường Potato Dextrose Agar Trong có dịng phân lập xã Phú Phụng, dòng xã Hưng Khánh Trung B, dòng xã Vĩnh Thành, dòng xã Long Thới, dòng xã Sơn Định dòng xã Tân Thiềng Các dòng nấm mốc sau phân lập tiến hành khảo sát khả sinh hoạt tính kháng khuẩn với dòng vi sinh vật gây bệnh Bằng phương pháp thử nghiệm khối thạch có 20 chủng nấm có khả tạo vịng vơ khuẩn đĩa Petri với vi sinh vật gây bệnh, dựa vào kích thước vịng vơ khuẩn sơ tuyển 11 chủng nấm, tiếp tục khảo sát hoạt tính kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch chọn chủng nấm có khả kháng khuẩn tương đối cao Từ khóa: Kháng khuẩn, kháng sinh, cành Măng cụt, nấm mốc, phân lập Chuyên ngành Vi sinh vật học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC TÓM TẮT ii MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vi CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Măng cụt 2.2 Sơ lược nấm mốc 2.2.1 Đặc điểm nấm mốc 2.2.2 Hình thái, cấu tạo 2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 2.2.4 Phân loại nấm mốc 2.2.5 Vai trò nấm mốc 2.3 Kháng sinh từ nấm mốc 10 2.3.1 Lịch sử tìm kháng sinh 10 2.3.2 Ứng dụng chất kháng sinh từ nấm mốc 13 2.4 Tình hình nghiên cứu chất kháng sinh Măng cụt 17 2.4.1 Nghiên cứu nước 17 2.4.2 Nghiên cứu nước 18 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 3.1 Phương tiện thí nghiệm 19 3.1.1 Địa điểm thời gian nghiên cứu 19 3.1.2 Vật liệu thí nghiệm 19 Chuyên ngành Vi sinh vật học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ 3.1.3 Dụng cụ, thiết bị 19 3.1.4 Hóa chất 20 3.2 Phương pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Phân lập nấm mốc 20 3.2.3 Kiểm tra khả sinh chất kháng khuẩn nấm mốc 22 3.3 Sơ tuyển nấm mốc 24 3.4 Nhận diện dòng nấm sợi phương pháp sinh học phân tử 24 3.4.1 Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc nấm mốc 24 3.4.2 Phản ứng PCR 25 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 26 4.1 Kết phân lập chủng nấm mốc từ cành Măng cụt 26 4.1.1 Kết quan sát khuẩn lạc 26 4.1.2 Kết quan sát kính hiển vi 29 4.2 Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 31 4.2.1 Kết thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn 31 4.2.2 Tuyển chọn dòng nấm có khả tạo hoạt tính kháng khuẩn cao 36 4.3 Kết giải trình tự số dịng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn cao 37 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 40 5.1 Kết luận 40 5.2 Kiến nghị 40 TÀI LIỆU THAM KHẢO 41 PHỤ LỤC Chuyên ngành Vi sinh vật học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng 1: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) 20 Bảng 2: Môi trường Luria Bertani (LB) 20 Bảng 3: Công thức phản ứng PCR với thể tích 50μL/phản ứng 25 Bảng 4: Các giai đoạn phản ứng PCR 25 Bảng 5: Đặc điểm khuẩn lạc chủng nấm mốc phân lập 26 Bảng 6: Đặc điểm vi thể dòng nấm phân lập 29 Bảng 7: Kết thí nghiệm theo dõi khả kháng vi sinh vật gây bệnh môi trường LB phương pháp khối thạch 32 Bảng 8: Kết thí nghiệm theo dõi khả kháng vi sinh vật gây bệnh môi trường LB phương pháp khuếch tán qua giếng thạch 34 Bảng 9: Các chủng nấm mốc vịng vơ khuẩn mơi trường LB 36 Bảng 10: Kết giải trình tự đoạn gen 18S rRNA dịng nấm mốc 39 Chuyên ngành Vi sinh vật học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình 1: Măng cụt .3 Hình 2: Sợi nấm cấu tạo vách tế bào sợi nấm Hình 3: Khuẩn lạc nấm mốc Hình 4: Một số dạng khuẩn lạc nấm Hình 5: Cấu trúc sợi nấm Hình 6: Khuẩn lạc CL12C (ngày 18/9/2016) 28 Hình 7: Khuẩn lạc CL13C (ngày 18/9/2016) 29 Hình 8: Khuẩn ty bào tử chủng nấm CL03C (ngày 18/9/2016) .31 Hình 9: Khuẩn ty bào tử chủng nấm CL27C (ngày 25/8/2016) .31 Hình 10: Vịng vơ khuẩn chủng nấm CL27C tạo vi khuẩn Salmonella sp phương pháp khối thạch (ngày 03/8/2016) 34 Hình 11: Vịng vơ khuẩn chủng CL06C tạo vi khuẩn Salmonella sp phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (ngày 07/9/2016) 36 Hình 12: Vịng vơ khuẩn chủng nấm CL10C tạo vi khuẩn Bacillus cereus chủng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch (ngày 07/9/2016) 37 Chuyên ngành Vi sinh vật học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT PDA Potato Dextrose Agar ADN Acid Deoxyribonucleic ARN Acid Ribonucleic B1 Bacillus cereus chủng B2 Bacillus cereus chủng C Candida albicans CNSH Công nghệ Sinh học ĐC Đối chứng E1 Escherichia coli chủng E2 Escherichia coli chủng EHEC Enterohaemorrhagic Escherichia coli LB Luria Bertani Agar NCBI National Center for Biotechnology Information PCR Polymerase Chain Reaction PDB Potato Dextrose Broth PTN Phịng thí nghiệm S1 Samonella sp S2 Samonella enterica subsp enterica serovar Typhimunum Chuyên ngành Vi sinh vật học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Từ xa xưa lịch sử, đường tìm tịi, khám phá tích lũy kinh nghiệm thực tiễn, người phát ứng dụng hiệu nhiều nguồn dược liệu vào mục đích điều trị y học Các hỗn hợp với đặc tính kháng khuẩn sử dụng điều trị nhiễm khuẩn phát cách 2000 năm Ngày với phát triển ngành Vi sinh vật học, đặc biệt phát vĩ đại Alexander Fleming (1928) chất kháng sinh từ loài nấm chi Penicillium mở kỷ nguyên lịch sử y học: khai sinh chất kháng sinh ứng dụng chất kháng sinh để chữa bệnh cho người Không vậy, chất kháng sinh ứng dụng rộng rãi trồng trọt, chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm bảo vệ môi trường Tuy nhiên, sử dụng kháng sinh liều không cách dễ dẫn đến tượng kháng thuốc số vi sinh vật gây bệnh Hiện nay, nước phát triển việc lạm dụng thuốc kháng sinh xảy nhiều ngày xuất nhiều dịng vi sinh vật kháng thuốc gây khó khăn điều trị kháng sinh Vì thế, việc tìm kiếm chất kháng sinh có nguồn gốc tự nhiên, vi sinh vật tiết chống lại vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học, vấn đề vô cấp thiết quan trọng Trong đó, nấm mốc sinh kháng sinh đối tượng trọng quan tâm nghiên cứu hàng đầu, dòng nấm mốc phân lập chủ yếu từ lồi thực vật có chứa chất kháng khuẩn mạnh, chống viêm, chống nấm số tác động sinh học có lợi khác, đặc biệt dược liệu với nhiều đặc tính khác Măng cụt (Garcinia mangostana) loài ăn trái nhiệt đới quen thuộc Đơng Nam Á Từ lâu ngồi hương vị thơm ngon, Măng cụt biết đến thảo dược dùng để điều trị nhiều loại bệnh Phân tích nhà khoa học thành phần hóa học Măng cụt cho thấy có nhiều chất alpha-mangostin, beta-mangostin, gamma-mangostin, garcinone-E, methoxy-betamangostin 3hydroxy-4-geranyl-5-methoxydiphenyl, có khả kháng khuẩn, kháng nấm, chất chống oxy hóa, chống ung thư, Tuy nhiên, sử dụng trực tiếp Măng cụt với số lượng lớn để điều trị bệnh việc chặt phá khai thác mức Măng Cụt Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ làm giảm diện tích trồng gây suy kiệt tài nguyên, theo Strobel (2002) loại nấm cộng sinh phận Măng cụt sản xuất chất tương tự chí có hoạt tính mạnh nên cần nghiên cứu tìm hiểu, phân lập vi sinh vật cộng sinh phận Măng cụt có hoạt tính kháng sinh để dễ dàng ứng dụng Vì vậy, đề tài “Phân lập số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non Măng cụt trồng huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre” thực 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số chủng nấm mốc từ cành non Măng cụt có khả sinh hợp chất kháng khuẩn Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu Măng cụt Hình 1: Măng cụt (*Nguồn: https://sites.google.com, ngày 15/06/2016) Măng cụt (Garcinia mangostana), thuộc họ Bứa (Clusiaceae), loài ăn trái nhiệt đới trồng nhiều rừng mưa nhiệt đới số quốc gia Đông Nam Á Ấn Độ, Myanmar, Malaysia, Philippines, Sri Lanka Thái Lan Cây cao từ đến 25 m Quả chín có vỏ ngồi dày, màu đỏ tím đậm Ruột trắng ngà chia thành nhiều múi có vị chua thanh có mùi thơm thu hút Măng cụt gọi ''nữ hồng loại trái cây" loại trái nhiệt đới ngon Do thích hợp với khí hậu nóng ấm nên Việt Nam Măng cụt trồng nhiều tỉnh miền Đông Nam Bộ đồng Sông Cửu Long, số trồng miền Trung, nhiên không thấy trồng miền Bắc (Đỗ Huy Bích et al., 2004) Về tác dụng dược lý, từ lâu người ta biết sử dụng Măng cụt loại thuốc quý dùng để chống viêm, chữa tiêu chảy, đau bụng, vàng da, ức chế dị ứng, làm giãn phế quản điều trị hen suyễn, chống dịch tả, bệnh lỵ, kháng vi khuẩn, kháng vi sinh vật, chống suy giảm miễn dịch, … (Jung et al., 2006; Sakagami et al., 2005) Những nghiên cứu cho biết vỏ Măng cụt trị bệnh ung thư kháng HIV, hoạt chất chứa vỏ trái Măng cụt gây độc mạnh cho dòng tế bào ung thư gan, ung thư vú SKBR3, ức chế tế bào ung thư máu HL60 người (Akao et al., 2008) Một số đề tài nghiên cứu gần Măng cụt chủ yếu hoạt chất xanthone Kháng thể xanthone phân lập từ vỏ quả, toàn trái cây, tâm gỗ Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ Hình 17: Bảo tử chủng CL32C (ngày 20/6/2016) Hình 18: Chủng nấm CL06C kháng Bacillus cereus chủng (ngày 10/09/2016) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ Hình 19: Chủng nấm CL10C kháng Samonella sp (ngày 10/09/2016) Hình 20: Chủng nấm CL29C kháng Bacillus cereus chủng (ngày 10/09/2016) Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học CL01C CL02C CL03C CL04C CL05C CL06C CL07C CL08C CL09C CL10C 10 Chuyên ngành Vi sinh vật học Ký hiệu STT 10 - - 10 - - - - 12 - - - - - - B1 10 - - 10 - - - - - - 14 - - - 10 - 2 - - 14 - - - - B2 - - 12 - - - - 12 - - - - - - - 14 - - - - - - - C 14 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E1 - - - - - - - - - Bảng 11: Kết khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khối thạch Kết khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khối thạch Phụ lục 2: Kết thí nghiệm Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 - - - - - - - - - - - - - - - - - - E2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - S2 - - - - - - - - Viện NC&PT Công nghệ Sinh học S1 Trường Đại học Cần Thơ CL12C CL13C CL14C CL15C CL16C CL17C CL18C CL19C CL20C CL21C CL22C CL23C CL24C CL25C 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Chuyên ngành Vi sinh vật học CL11C 11 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 - - - - - - - - - - - 10 - - - - - - - - - - - - - - - - 8 - - - 4 - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - 6 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Viện NC&PT Công nghệ Sinh học - - - - - - - - - - - - - Trường Đại học Cần Thơ CL27C CL28C CL29C CL30C CL31C CL32C CL33C CL34C 27 28 29 30 32 32 33 34 - - - - - 6 - - - 4 - - 10 - - - - 12 - - - - 12 - - - - - - 2 2 - - - 2 2 - - - 2 2 - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - Trường Đại học Cần Thơ Ký hiệu Chuyên ngành Vi sinh vật học STT B1 B2 C E1 E2 Bảng 12: Kết khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch Kết khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch coli chủng 2; S1: Samonella sp.; S2: Samonella enterica subsp enterica serovar Typhimunum S1 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học S2 Ghi chú: (-): không kháng; STT: số thứ tự; B1: Bacillus cereus chủng 1; B2: Bacillus cereus chủng 2; C: Candida albicans; E1: Escherichia coli chủng 1; E2: Escherichia CL26C 26 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 CL06C CL10C CL29C CL24C CL28C CL15C CL17C CL25C CL20C CL32C 10 11 - - - - - - 12 18 20 - - - - - - 14 21 20 11 - - - - - - 12 21 21 10 - 11 - - 4 10 12 12 10 - 10 - - 10 14 12 10 - 10 - - 4 10 14 14 - - - - - - 8 - - - - 6 - - - - 8 20 18 20 - 4 - - - - - 16 4 - - - - - 14 4 - - - - - 18 - - - - - - - - - 14 - - - - - - - - - 12 - - - - - - - - - 12 - - - - - - 10 12 14 - - - - - - 10 - - - - - - 8 12 - - - - 10 12 - - - 4 - 8 - - - - 10 10 Trường Đại học Cần Thơ Chuyên ngành Vi sinh vật học coli chủng 2; S1: Samonella sp.; S2: Samonella enterica subsp enterica serovar Typhimunum Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Ghi chú: (-): không kháng; STT: số thứ tự; B1: Bacillus cereus chủng 1; B2: Bacillus cereus chủng 2; C: Candida albicans; E1: Escherichia coli chủng 1; E2: Escherichia CL02C Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ Kết giải trình tự 3.1 Trình tự tương đồng dịng CL02C với lồi AF181703 Mycosphaerella citri Fellsmere lồi AF297234 Mycosphaerella fijiensis rCRB >CL02C (497 nu) TTTTGTGAACCAACCTGTTGCTTCGGGGGAGACCCCGCCGTTCGCGGCGGCGGCTCCCCCGGAGGCCCATCAACA CTGCGTAACTGTTTGTCGGAGTCTTAATAAATCAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCCTGGCTTGGTATTGGGC GTCGCGGGCCTCGCCCGCGCGCCTTAAAGTCTCCCCGGCTGGACCGTCTGTCCCCAAAGCGTCGTGCAAACCTCG CGGTGGGATTTGATGGGCCGGCCGTTAAATCTTTATCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA >AF181703 Mycosphaerella citri Fellsmere TTTTGTGAACCAACCTGTTGCTTCGGGGGAGACCCCGCCGTTCGCGGCGGCGGCTCCCCCGGAGGCCCATTAACA CTGCGTAACTGTTTGTCGGAGTCTTAATAAATCAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCCTGGCTTGGTATTGGGC GTCGCGGGCCTCGCCCGCGCGCCTTAAAGTCTCCCCGGCTGGACCGTTTGTCCCTAAAGCGTCGTGCAAACCTCG CGGTGGGATTTGATGGGCCGGCCGTTAAATCTTTATCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ >AF297234 Mycosphaerella fijiensis rCRB TTTTGTGAACCAACCTGTTGCTTCGGGGGAGACCCCGCCGTTCGCGGCGGCGGCTCCCCCGGAGGCCCATTAACA CTGCGTAACTGTTTGTCGGAGTCTTAATAAATCAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGA TGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACAT TGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTACACCCCTCAAGCCTGGCTTGGTATTGGGC GTCGCGGGCCTCGCCCGCGCGCCTTAAAGTCTCTCCGGCTGGACCGTTTGTCCCTAAAGCGTCGTGCAAACCTCG CGGTGGGATTTGATGGGCCGGCCGTTAAATCTTTATCAAAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAA CTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA 3.2 Trình tự tương đồng dịng CL10C với loài GQ888738 Pestalotiopsis palmarum CLB5 loài JX045815 Pestalotiopsis clavispora F211b >CL10C (498 nu) ACATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAA CTCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTG GCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAA CGCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGT GTTGGGAATCTACTTCTTTCATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAG TAATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTGTGGTTGACCTCGGA TCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA >GQ888738 Pestalotiopsis palmarum CLB5 CATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAAC TCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTG Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ TTGGGAATCTACTTCTTTCATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGT AATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTGTGGTTGACCTCGGAT CAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGA >JX045815 Pestalotiopsis clavispora F211b CATGTGAACTTACCTTTTGTTGCCTCGGCAGAAGTTATAGGTCTTCTTATAGCTGCTGCCGGTGGACCATTAAAC TCTTGTTATTTTATGTAATCTGAGCGTCTTATTTTAATAAGTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGG CATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAAC GCACATTGCGCCCATTAGTATTCTAGTGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTTAAGCCTAGCTTAGTG TTGGGAATCTACTTCTTTTATTAGTTGTAGTTCCTGAAATACAACGGCGGATTTGTAGTATCCTCTGAGCGTAGT AATTTTTTTCTCGCTTTTGTTAGGTGCTATAACTCCCAGCCGCTAAACCCCCAATTTTTTGTGGTTGACCTCGGA TCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA 3.3 Trình tự tương đồng dịng CL29C với loài KU594266 Aspergillus terreus H010 loài KT310980 Aspergillus tubingensis MSEF76 >CL29C (555 nu) GGCACTCCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGGACAC GCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTT TGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAC TAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCA TGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGAC GGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCG GCCGGCGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGC TGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ >KU594266 Aspergillus terreus H010 CCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCC CGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAA TCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATG TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCT GTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCC CGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGG CGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA >KT310980 Aspergillus tubingensis MSEF76 CCACCCGTGACTATTGTACCTTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCAGCGTTGCTGGCCGCCGGGGGGCGACTCGCCCC CGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACATGAACCCTGTTCTGAAAGCTTGCAGTCTGAGTGTGATTCTTTGCAA TCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATG TGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCT GTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGCCCTCGTCCCCCGGCTCCCGGGGGACGGGCC CGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGGTCCTCGAGCGTATGGGGCTTCGTCTTCCGCTCCGTAGGCCCGGCCGG CGCCCGCCGACGCATTTATTTGCAACTTGTTTTTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAAC TTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA Phụ lục 3: Kết thống kê Kết thống kê khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khối thạch B1 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total DF 14 30 44 S = 1.155 SS 250.31 40.00 290.31 MS 17.88 1.33 R-Sq = 86.22% F 13.41 P 0.000 R-Sq(adj) = 79.79% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL10C CL06C CL16C CL33C CL25C CL29C CL30C CL28C CL09C CL02C CL26C CL23C CL24C CL15C N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 10.667 9.333 7.333 6.667 6.000 5.333 4.667 4.667 4.667 4.667 4.000 3.333 2.667 2.667 Chuyên ngành Vi sinh vật học Grouping A A B A B C B C D B C D E C D E C D E C D E C D E C D E C D E D E E E F F F F F F F F F Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 CL32C 2.000 Trường Đại học Cần Thơ F Means that not share a letter are significantly different B2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF 15 32 47 S = 0.9895 SS 506.146 31.333 537.479 MS 33.743 0.979 R-Sq = 94.17% F 34.46 P 0.000 R-Sq(adj) = 91.44% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL06C CL33C CL21C CL02C CL20C CL24C CL29C CL32C CL16C CL30C CL28C CL09C CL25C CL15C CL23C CL10C N 3 3 3 3 3 3 3 3 Mean 13.333 10.667 8.667 8.667 7.333 6.667 6.000 4.667 4.000 3.333 3.333 3.333 3.000 2.667 2.000 2.000 Grouping A A B B C B C C D C D E C D E F D E F G E F G F G F G F G G G G G Means that not share a letter are significantly different C One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF 14 30 44 S = 0.8944 SS 425.778 24.000 449.778 MS 30.413 0.800 R-Sq = 94.66% F 38.02 P 0.000 R-Sq(adj) = 92.17% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL10C CL06C CL29C CL17C CL15C CL16C CL09C CL25C CL23C CL31C CL30C CL28C CL27C CL26C CL21C N 3 3 3 3 3 3 3 Mean 13.333 7.333 6.667 6.667 5.333 3.333 3.333 2.667 2.667 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 2.000 Grouping A B B B B C C D C D C D C D D D D D D D Means that not share a letter are significantly different E1 Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF S = 0.9428 SS 56.889 5.333 62.222 MS 28.444 0.889 R-Sq = 91.43% F 32.00 P 0.001 R-Sq(adj) = 88.57% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL20C CL02C CL17C N 3 Mean 7.3333 7.3333 2.0000 Grouping A A B Means that not share a letter are significantly different E2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF S = 1.155 SS 8.00 8.00 16.00 MS 4.00 1.33 F 3.00 R-Sq = 50.00% P 0.125 R-Sq(adj) = 33.33% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL15C CL20C CL02C N 3 Mean 4.000 2.000 2.000 Grouping A A A Means that not share a letter are significantly different S1 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF 10 14 S = 0.8944 SS 9.600 8.000 17.600 MS 2.400 0.800 R-Sq = 54.55% F 3.00 P 0.072 R-Sq(adj) = 36.36% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL09C CL24C CL17C CL10C CL06C N 3 3 Mean 4.0000 2.0000 2.0000 2.0000 2.0000 Grouping A A A A A Means that not share a letter are significantly different S2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total DF 11 S = 0.8165 SS 1.333 5.333 6.667 MS 0.444 0.667 R-Sq = 20.00% Chuyên ngành Vi sinh vật học F 0.67 P 0.596 R-Sq(adj) = 0.00% Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL20C CL02C CL24C CL06C N 3 3 Mean 2.6667 2.6667 2.0000 2.0000 Grouping A A A A Means that not share a letter are significantly different Kết thống kê khảo sát khả kháng khuẩn phương pháp khuếch tán qua giếng thạch B1 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total DF 10 14 S = 1.183 SS 442.93 14.00 456.93 MS 110.73 1.40 R-Sq = 96.94% F 79.10 P 0.000 R-Sq(adj) = 95.71% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL06C CL10C CL29C CL02C CL25C N 3 3 Mean 20.333 20.000 12.667 10.000 6.667 Grouping A A B B C Means that not share a letter are significantly different B2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total DF 16 23 S = 0.9354 SS 244.958 14.000 258.958 MS 34.994 0.875 R-Sq = 94.59% F 39.99 P 0.000 R-Sq(adj) = 92.23% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL10C CL06C CL20C CL29C CL02C CL25C CL24C CL28C N 3 3 3 3 Mean 13.333 12.667 10.333 10.000 9.333 7.333 4.667 4.000 Grouping A A B B C C C D D E E Means that not share a letter are significantly different C One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF 12 17 SS 441.11 21.33 462.44 Chuyên ngành Vi sinh vật học MS 88.22 1.78 F 49.63 P 0.000 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 S = 1.333 R-Sq = 95.39% Trường Đại học Cần Thơ R-Sq(adj) = 93.46% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL10C CL28C CL29C CL02C CL32C CL24C N 3 3 3 Mean 19.333 8.000 7.333 6.667 5.333 4.667 Grouping A B B B B B Means that not share a letter are significantly different E1 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total DF 12 17 S = 0.8165 SS 330.000 8.000 338.000 MS 66.000 0.667 R-Sq = 97.63% F 99.00 P 0.000 R-Sq(adj) = 96.65% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL02C CL32C CL15C CL25C CL20C CL17C N 3 3 3 Mean 16.000 8.000 6.000 4.000 4.000 4.000 Grouping A B B C C C C Means that not share a letter are significantly different E2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF S = 1.155 SS 96.00 5.33 101.33 MS 96.00 1.33 R-Sq = 94.74% F 72.00 P 0.001 R-Sq(adj) = 93.42% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL02C CL17C N 3 Mean 12.667 4.667 Grouping A B Means that not share a letter are significantly different S1 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DỊNG NẤM Source DỊNG NẤM Error Total S = 1.155 DF 10 14 SS 124.27 13.33 137.60 MS 31.07 1.33 R-Sq = 90.31% Chuyên ngành Vi sinh vật học F 23.30 P 0.000 R-Sq(adj) = 86.43% Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 39 – 2016 Trường Đại học Cần Thơ Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL02C CL29C CL10C CL25C CL06C N 3 3 Mean 12.667 8.667 6.667 5.333 4.667 Grouping A B B C C C Means that not share a letter are significantly different S2 One-way ANOVA: VỊNG VƠ KHUẨN versus DÒNG NẤM Source DÒNG NẤM Error Total DF 14 20 S = 1.234 SS 134.48 21.33 155.81 MS 22.41 1.52 R-Sq = 86.31% F 14.71 P 0.000 R-Sq(adj) = 80.44% Grouping Information Using Tukey Method DÒNG NẤM CL02C CL06C CL25C CL29C CL10C CL28C CL15C N 3 3 3 Mean 10.000 9.333 6.667 5.333 4.667 4.000 2.667 Grouping A A A B B C B C B C C Means that not share a letter are significantly different Chuyên ngành Vi sinh vật học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học ... tài ? ?Phân lập số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non Măng cụt trồng huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre? ?? thực 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập số chủng nấm mốc từ cành non Măng cụt có khả... ? ?Phân lập số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non Măng cụt trồng huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre? ?? nhằm mục đích phân lập tuyển chọn chủng nấm mốc có khả sinh hợp chất có hoạt tính kháng. .. nghiên cứu 3.2.1 Phân lập nấm mốc Mục đích: Phân lập chủng nấm mốc từ cành non Măng cụt trồng huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre a) Phương pháp phân lập Mẫu lấy huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre, sau đem phịng