Nấm mốc là một trong những vi sinh vật có khả năng sinh kháng sinh đầu tiên có ý nghĩa quan trọng về mặt lịch sử lẫn y học. Chính vì vậy, từ lâu nấm mốc đã trở thành đối tượng để các nhà khoa học nghiên cứu và sản xuất ra chất kháng sinh với mục đích chữa bệnh. Đề tài “Phân lập một số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non cây Măng cụt trồng tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre” nhằm mục đích phân lập và tuyển chọn các chủng nấm mốc có khả năng sinh ra các hợp chất có hoạt tính kháng khuẩn cao. Trong phạm vi khảo sát của đề tài đã phân lập được 34 chủng nấm mốc trên môi trường Potato Dextrose Agar. Trong đó có 2 dòng được phân lập tại xã Phú Phụng, 4 dòng tại xã Hưng Khánh Trung B, 5 dòng tại xã Vĩnh Thành, 7 dòng tại xã Long Thới, 8 dòng tại xã Sơn Định và 8 dòng tại xã Tân Thiềng.
GIỚI THIỆU
Đặt vấn đề
Từ xa xưa, con người đã khám phá và ứng dụng nhiều nguồn dược liệu trong y học thông qua kinh nghiệm thực tiễn Hơn 2000 năm trước, các hỗn hợp kháng khuẩn đã được sử dụng để điều trị nhiễm khuẩn Sự phát triển của vi sinh vật học, đặc biệt là phát hiện của Alexander Fleming về kháng sinh từ nấm Penicillium vào năm 1928, đã mở ra kỷ nguyên mới trong y học Kháng sinh không chỉ được dùng để chữa bệnh mà còn được ứng dụng rộng rãi trong nông nghiệp, chăn nuôi, công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường Tuy nhiên, việc sử dụng kháng sinh không đúng cách hoặc quá liều có thể dẫn đến kháng thuốc ở một số vi sinh vật gây bệnh.
Hiện nay, các nước đang phát triển đang đối mặt với tình trạng lạm dụng thuốc kháng sinh, dẫn đến sự gia tăng các vi sinh vật kháng thuốc, gây khó khăn trong điều trị Do đó, việc nghiên cứu và tìm kiếm các chất kháng sinh mới từ nguồn gốc tự nhiên, do vi sinh vật tiết ra để chống lại các vi sinh vật gây bệnh kháng thuốc, đang thu hút sự quan tâm lớn từ các nhà khoa học Đây là một vấn đề cấp thiết và quan trọng trong lĩnh vực y tế hiện nay.
Nấm mốc sinh kháng sinh đang được nghiên cứu một cách sâu rộng, đặc biệt là các dòng nấm mốc được phân lập từ thực vật có chứa chất kháng khuẩn mạnh Những loại thực vật này không chỉ có khả năng chống viêm và chống nấm, mà còn mang lại nhiều tác động sinh học có lợi khác, đặc biệt là từ các cây dược liệu với nhiều đặc tính đa dạng.
Măng cụt (Garcinia mangostana) là một loại trái cây nhiệt đới phổ biến ở Đông Nam Á, nổi bật không chỉ với hương vị thơm ngon mà còn với nhiều công dụng dược liệu trong điều trị bệnh Các nghiên cứu hóa học đã chỉ ra rằng Măng cụt chứa nhiều hợp chất quý giá như alpha-mangostin, beta-mangostin, và gamma-mangostin, có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm, và chống oxy hóa Tuy nhiên, việc sử dụng Măng cụt với số lượng lớn để điều trị bệnh có thể dẫn đến tình trạng khai thác quá mức, làm suy giảm nguồn tài nguyên Theo Strobel (2002), các loại nấm cộng sinh trong cây Măng cụt có thể sản xuất các hợp chất kháng sinh mạnh hơn, do đó cần thiết phải tiến hành nghiên cứu để phân lập và ứng dụng các vi sinh vật này.
Đề tài nghiên cứu "Phân lập một số chủng nấm mốc có hoạt tính kháng khuẩn từ cành non cây Măng cụt trồng tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre" đã được triển khai nhằm khám phá tiềm năng kháng khuẩn của các chủng nấm mốc này.
Mục tiêu đề tài
Phân lập được một số chủng nấm mốc từ cành non cây Măng cụt có khả năng sinh ra hợp chất kháng khuẩn.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Giới thiệu về Măng cụt
(*Nguồn: https://sites.google.com, ngày 15/06/2016)
Măng cụt (Garcinia mangostana) là một loại cây ăn trái nhiệt đới thuộc họ Bứa (Clusiaceae), được trồng phổ biến ở các rừng mưa nhiệt đới của nhiều quốc gia Đông Nam Á như Ấn Độ, Myanmar, Malaysia, Philippines, Sri Lanka và Thái Lan Cây có chiều cao từ 6 đến
Măng cụt, được mệnh danh là "nữ hoàng của các loại trái cây", có quả chín với vỏ dày màu đỏ tím đậm và ruột trắng ngà, chia thành nhiều múi có vị chua ngọt thanh và mùi thơm hấp dẫn Loại trái cây này rất phù hợp với khí hậu nóng ấm, nên thường được trồng nhiều ở các tỉnh miền Đông Nam Bộ và đồng bằng Sông Cửu Long, trong khi ở miền Trung chỉ có số lượng ít và không thấy trồng ở miền Bắc.
Măng cụt từ lâu đã được biết đến với nhiều tác dụng dược lý, bao gồm chống viêm, chữa tiêu chảy, đau bụng, vàng da, và hỗ trợ điều trị hen suyễn Nghiên cứu gần đây cho thấy vỏ Măng cụt có khả năng chống ung thư và kháng HIV, với hoạt chất trong vỏ gây độc mạnh cho các tế bào ung thư Các nghiên cứu về xanthone từ Măng cụt đã chỉ ra rằng α-, β- và γ-mangostins, cùng với garcinone E, 8-deoxygartanin và gartanin, là những hợp chất đáng chú ý Hơn nữa, các loại nấm sống cộng sinh trong Măng cụt cũng có thể sản xuất các chất chuyển hóa tương tự với hoạt tính mạnh hơn, mở ra cơ hội cho việc tìm kiếm các hợp chất mới từ nấm này Nghiên cứu của Souwalak Phongpaichit et al (2006) tại Thái Lan đã phát hiện một số dòng nấm mốc cộng sinh trong lá và cành của cây Măng cụt.
Nghiên cứu cho thấy các loài nấm mốc như Fusarium sp., Penicillium sp., Guignardia mangiferae và Aspergillus aculeatus có khả năng kháng lại vi sinh vật gây bệnh Điều này chứng tỏ rằng nấm mốc cộng sinh trong cây Măng cụt là nguồn tài nguyên tiềm năng cho các tác nhân kháng khuẩn.
Sơ lược về nấm mốc
2.2.1 Đặc điểm của nấm mốc
Nấm mốc là vi sinh vật chân hạch thuộc thể tản, không có diệp lục tố và sống theo chế độ dị dưỡng, bao gồm hoại sinh, ký sinh và cộng sinh Vách tế bào của nấm mốc chủ yếu được cấu tạo từ chitin, có thể có hoặc không có cellulose cùng với một số thành phần khác với hàm lượng thấp.
Nấm mốc ký sinh trên nhiều ký chủ như động vật, thực vật, và đặc biệt là con người, cây trồng, vật nuôi, cũng như sản phẩm sau thu hoạch Một số loài nấm mốc gây bệnh và làm hư hỏng thiết bị bảo quản, nhưng nhiều loài khác lại có lợi, như tổng hợp acid hữu cơ, thuốc kháng sinh, vitamin, và kích thích tố tăng trưởng thực vật, được ứng dụng trong sản xuất công nghiệp Một số nấm cũng là đối tượng nghiên cứu quan trọng trong di truyền học.
Nấm mốc có cấu trúc hình sợi, có thể có hoặc không có vách ngăn ngang, với sợi nấm thường là ống hình trụ dài có đường kính từ 3-5μm, có thể lên tới 10μm hoặc thậm chí 1mm Chiều dài của sợi nấm có thể đạt vài chục centimet và chúng phát triển theo kiểu tăng trưởng ở ngọn Các sợi nấm có khả năng phân nhánh liên tục, tạo thành hệ sợi nấm (mycelium) có hình dạng xù xì như bông Trong môi trường đặc và một số cơ chất tự nhiên, bào tử nấm, tế bào nấm hoặc đoạn sợi nấm có thể phát triển thành khuẩn lạc nấm với hình dạng nhất định (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành, 2010).
Hình 2: Sợi nấm và cấu tạo vách tế bào sợi nấm
(*Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) trích từ Samson et al., (1995))
Khuẩn lạc nấm mốc có nhiều màu sắc giống như khuẩn lạc xạ khuẩn, nhưng phát triển nhanh hơn và thường lớn hơn Khuẩn lạc nấm mốc có dạng xốp hơn do kích thước lớn hơn, với kích thước khoảng 5-10mm sau 3 ngày phát triển, trong khi khuẩn lạc xạ khuẩn chỉ đạt khoảng 0,5-2mm.
Hình 3: Khuẩn lạc nấm mốc
Khuẩn lạc nấm mốc thường có hình dạng tròn, nhưng một số loài như Mucor và Rhizopus có thể phát triển mạnh theo cả ba chiều trên môi trường thạch đĩa Petri, dẫn đến hình dạng khuẩn lạc không rõ rệt Tốc độ tăng trưởng của các loài nấm mốc thường được đo bằng đường kính và đôi khi cả chiều dày của khuẩn lạc.
Khuẩn lạc của một số loài nấm được đặc trưng bởi màu sắc của sợi nấm, bào tử và các bộ phận chứa bào tử Bề mặt khuẩn lạc có thể có nhiều hình dạng khác nhau như mượt, nhẵn bóng, bột, sợi, hạt hoặc xốp.
Mặt khuẩn lạc thường phẳng, tuy nhiên, ở một số loài như Penicillium, mặt khuẩn lạc có thể xuất hiện những vết khía xuyên tâm hoặc có hình dạng thấp dần từ trung tâm ra mép, tạo nên sự lồi lõm không đều.
Mép khuẩn lạc thường được hình thành từ các sợi nấm cơ chất, có độ mỏng hơn so với phần bên trong Trong nhiều trường hợp, đặc biệt khi khối sợi nấm dày, bao gồm cả sợi cơ chất và sợi khí sinh, ranh giới giữa mép và phần bên trong khuẩn lạc có thể được quan sát rõ ràng.
Các đặc điểm hình thái như bó sợi, bó giá, thể quả, hạch nấm, giọt tiết và sắc tố hòa tan tạo nên sự đặc trưng cho khuẩn lạc của từng loài nấm mốc.
Hình 4: Một số dạng khuẩn lạc nấm
( *Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Văn Thành (2010) trích từ Samson et al., (1995))
Sợi nấm thường có dạng trong suốt, nhưng một số loại nấm có sắc tố tạo nên màu tối hoặc màu sắc sặc sỡ Sắc tố này không chỉ ảnh hưởng đến màu sắc của sợi nấm mà còn làm thay đổi màu của khu vực xung quanh nơi nấm phát triển Ngoài ra, một số nấm còn tiết ra các chất hữu cơ, hình thành các tinh thể trên bề mặt khuẩn lạc Do bào tử của nấm thường có màu sắc riêng, nên khuẩn lạc nấm cũng mang màu sắc đặc trưng.
Nấm mốc là sinh vật có cấu trúc tế bào nhân thực, bao gồm ba thành phần chính: thành tế bào, nguyên sinh chất và nhân Màng tế bào của nấm mốc được cấu tạo từ cellulose hoặc các hợp chất tương tự, với cấu trúc đặc trưng cho từng loài Do không có diệp lục, nấm mốc không có khả năng thực hiện quá trình quang hợp.
Trong tế bào nấm, có nhiều cơ quan quan trọng như ty thể, mạng nội chất, dịch bào, ribôxôm, bào nang, thể Golgi, giọt lipid, tinh thể và các vi thể với đường kính từ 0,5-1,5nm Các cấu trúc khác bao gồm thể Vôrônin với đường kính 0,2μm và thể Chitôxôm có đường kính từ 40-70nm Bên cạnh đó, trong tế bào chất còn chứa các vi quản rỗng ruột (microtubule) với đường kính 25nm và các vi sợi (microfilament) có đường kính từ 5-8nm, cùng với các thể màng biên.
2.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa
Nấm mốc là sinh vật hoại sinh, có khả năng sử dụng nhiều nguồn carbon khác nhau như carbohydrate, amino acid và amonia để thực hiện các quá trình sinh lý Mỗi loại nấm mốc có nhu cầu riêng về nguồn thức ăn, và sự thích hợp của nguồn carbon được đánh giá qua các chỉ tiêu như mức độ sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm, số lượng bào tử hình thành và sự tích lũy các chất chuyển hóa Tuy nhiên, sinh trưởng tối đa của hệ sợi nấm không nhất thiết tương ứng với sự tích lũy tối đa các sản phẩm trao đổi chất Nhiều loại nấm mốc có khả năng đồng hóa trực tiếp các loại đường như mantose, lactose, melibiose và rỉ đường.
Các loại nấm mốc khác nhau có nhu cầu đa dạng về nguồn thức ăn nitơ, sử dụng cả nitơ hữu cơ và vô cơ Nhiều loài thuộc chi Aspergillus và Penicillium có khả năng khử nitrat hóa Đặc biệt, một số loài như Aspergillus flavus, Trichoderma lignorum và Myrothecium verrucaria có khả năng đồng hóa trực tiếp nitơ phân tử.
Các nguyên tố vi lượng đóng vai trò quan trọng trong các quá trình xúc tác sinh học của tế bào nấm sợi Các loại nấm mốc có mối quan hệ khác nhau với vitamin và các chất sinh trưởng Nhu cầu về chất sinh trưởng của nấm sợi có thể thay đổi theo điều kiện nuôi cấy và độ tuổi của giống nấm.
Hình 5: Cấu trúc của sợi nấm
(*Nguồn: http://vietsciences.org, ngày 15/06/2016)
Kháng sinh từ nấm mốc
Kháng sinh là những chất do vi sinh vật sản sinh hoặc được tổng hợp với nồng độ thấp, có khả năng ức chế sự phát triển hoặc tiêu diệt vi khuẩn Chúng tác động lên vi khuẩn ở cấp độ phân tử, thường nhắm vào những vị trí quan trọng trong cấu trúc phân tử hoặc các phản ứng trong quá trình phát triển của vi khuẩn.
2.3.1 Lịch sử tìm ra kháng sinh
Penicillin là chất kháng sinh đầu tiên được phát hiện và ứng dụng cách đây hơn 60 năm, nhưng con người đã từ lâu biết sử dụng nấm mốc trên đậu phụ để chữa trị vết thương nhỏ Nhiều thế kỷ trước, người dân châu Âu và châu Mỹ đã dùng bánh mì, ngô, và giày da cũ bị mốc để điều trị các vết thương lở loét và mủ Theo quan điểm khoa học hiện đại, nấm mốc trên đậu phụ và bánh mì thực sự chứa chất kháng sinh, mặc dù người xưa chưa hiểu về vi khuẩn hay kháng sinh.
Vào năm 1895, Vincenzo Tiberio, một nhà vật lý học tại đại học Naples, đã phát hiện ra rằng nấm mốc Penicillium có khả năng kháng khuẩn tốt Tuy nhiên, phát hiện này không được chú ý cho đến năm 1928, khi Alexander Fleming phát hiện ra kháng sinh Penicillin từ một loài nấm trong chi Penicillium, có khả năng chống lại vi khuẩn Fleming đã mô tả một số đặc tính sinh học của Penicillin và thử nghiệm các chế phẩm thô để điều trị một số trường hợp nhiễm khuẩn Dù vậy, ông không thể thuyết phục sự phát triển của kháng sinh này mà không có sự hỗ trợ từ các nhà khoa học được đào tạo bài bản.
Một số loại kháng sinh từ nấm mốc được phát hiện như: x Penicillin:
Chất kháng sinh Penicillin được phát hiện tình cờ vào năm 1928, trong khi vệ sinh phòng thí nghiệm của mình, Alexander Fleming đã chú ý đến một hộp Petri nuôi
Staphylococcus bị nhiễm nấm mốc Penicillium notatum tạo ra vòng vô khuẩn xung quanh khuẩn lạc nấm, và hiện tượng tương tự cũng xảy ra khi thử nghiệm với các loài vi khuẩn gây bệnh khác Từ đó, Fleming kết luận rằng nấm mốc tiết ra một chất có khả năng tiêu diệt vi khuẩn và đặt tên cho chất kháng sinh này là Penicillin vào năm 1929 Công trình của ông nhanh chóng thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học, bao gồm các nhà khoa học Mỹ, những người đã thành công trong việc lên men Penicillin vào năm 1931 Tuy nhiên, trong giai đoạn đó, mọi nỗ lực tách và tinh chế Penicillin từ dịch lên men đều thất bại do không bảo vệ được hoạt tính kháng sinh, dẫn đến việc chất này tạm thời bị lãng quên.
Mãi đến năm 1945, ông mới nhận được giải Nobel
Vào năm 1938, Ernst Chain và Norman Heatley bắt đầu sản xuất thử Penicillin tại Oxford Chỉ sau hai năm, họ đã tinh chế được một lượng lớn Penicillin, đủ để tiến hành thí nghiệm trên chuột, và vào ngày 25/05/1940, kết quả điều trị thành công đã mở ra kỷ nguyên kháng sinh trong việc điều trị bệnh nhiễm trùng Năm 1940, Dorothy Hodgkin đã xác định cấu trúc phân tử của Penicillin.
Năm 1942, Mary Hunt tìm ra chủng Penicillium chrysogesrum có khả năng tổng hợp kháng sinh cao gấp hai lần giống Penicillium notatum tìm ra trước đó
Từ năm 1946 đến 1950, nhiều loại kháng sinh mới được phát hiện và hàng loạt máy móc sản xuất kháng sinh, đặc biệt là Penicillium, đã ra đời, khẳng định giá trị to lớn của Penicillin trong việc điều trị bệnh.
Tiếp theo Penicillin, hàng loạt chất kháng sinh đã được tìm kiếm và phát hiện x Cephalosporin:
Năm 1948, Brotzu chiết từ chủng nấm mốc thuộc giống Cephalosporium sp có khả năng chống lại cả vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, đặc biệt là
Vibriocholerac Ngày nay, người ta phát hiện nhiều loài nấm, xạ khuẩn và vi khuẩn khác nhau có khả năng tổng hợp Cephalosporin Tuy nhiên hoạt tính của
Cephalosporin thì kém hơn hoạt tính của Penicillin x Griseofulvin:
Năm 1959, Oxford và cộng sự đã chiết xuất thành công Griseofulvin từ một số loài nấm mốc thuộc giống Penicillium như Pen urticae, Pen nigricans và Pen raistrichi Mặc dù Griseofulvin không có hoạt tính chống vi khuẩn, nhưng nó lại có khả năng chống nấm mạnh mẽ, được sử dụng để điều trị các bệnh nấm ở người và gia súc.
Năm 1959, các nhà khoa học Anh, Mỹ đã tách được vòng Penicillin, mở đầu cho hàng loạt các loại kháng sinh tổng hợp
Năm 1960, người ta đã bắt đầu tổng hợp được Griseofulvin bằng con đường nhân tạo
Kháng sinh được chiết suất từ nấm mốc Citrinin (P.citrinum), Fumagillin (A.fumigatus), Nidulin (A.nidulans), Humicolin (A.humicola), Viridin (T.virides), …
Nhiều nghiên cứu đã chỉ ra rằng Trichoderma, đặc biệt là loài Trichoderma virides, có khả năng chữa bệnh và phân bố rộng rãi trong đất Glytoxin, một chất kháng sinh được chiết xuất từ Trichoderma viride, cũng được tìm thấy ở Aspergillus fumgitus và một số loài Penicillium Tuy nhiên, Glytoxin không ổn định và dễ bị phân hủy dưới ánh sáng Phổ kháng sinh của Glytoxin có khả năng chống lại các vi khuẩn Gram dương và nấm gây bệnh, nhưng trong thực nghiệm, nó không hiệu quả trong việc chống nhiễm trùng lao ở chuột và không ngăn chặn sự phát triển của u ác tính Hoạt tính kháng sinh của Glytoxin liên quan đến sự hiện diện của nhóm chứa lưu huỳnh trong cấu trúc phân tử của nó.
Ngày nay, sự phát triển mạnh mẽ của sinh học hiện đại cùng với sự hỗ trợ của nhiều nhà khoa học đã thúc đẩy nghiên cứu chất kháng sinh đạt được những thành tựu lớn Tại Việt Nam, nghiên cứu và sản xuất kháng sinh bắt đầu từ năm 1949 dưới sự dẫn dắt của Giáo sư Bác sĩ Đặng Văn Ngữ với chủng Penicillium, cho ra dịch lọc Penicillin để điều trị vết thương cho bệnh binh Sau cuộc kháng chiến chín năm, nghiên cứu này tiếp tục được phát triển tại Đại học Y Dược Hà Nội.
Nghiên cứu về chất kháng sinh đã thu hút sự chú ý của nhiều nhà khoa học hàng đầu, tuy nhiên, những nỗ lực trong lĩnh vực này vẫn còn hạn chế so với các nghiên cứu trên thế giới.
2.3.2 Ứng dụng của chất kháng sinh từ nấm mốc a) Ứng dụng chất kháng sinh từ nấm mốc trong điều trị bệnh nhiễm trùng và hiện tượng kháng thuốc
Vi sinh vật là nguyên nhân chính gây ra bệnh nhiễm khuẩn, một vấn đề đã tồn tại từ xa xưa và được nghiên cứu khoa học hơn một thế kỷ qua Dù đã có những tiến bộ trong hiểu biết về bệnh nhiễm khuẩn, nhưng hiện nay nó vẫn là một thách thức lớn đối với sức khỏe cộng đồng toàn cầu.
Kể từ khi Penicillin ra đời, công nghệ kháng sinh đã cung cấp cho bác sĩ những công cụ quan trọng trong việc kiểm soát các bệnh nhiễm khuẩn Sự phát triển của các chế phẩm kháng sinh tổng hợp và bán tổng hợp đã diễn ra song song với việc gia tăng kháng thuốc, do tác nhân gây bệnh phát triển tính đề kháng Tỷ lệ kháng thuốc của vi khuẩn ngày càng tăng, hiện nay, nhiều loại vi khuẩn như Salmonella, Shigella, Pseudomonas và Enterococcus đã trở nên kháng thuốc.
Cần chú ý đến các trường hợp nhiễm khuẩn do S aureus kháng Methicillin, thuộc nhóm Penicillins có khả năng ức chế f-lactamase, cùng với các chủng vi khuẩn đường ruột kháng các Cephalosporins phổ rộng.
Vi khuẩn lao Mycobacterium tuberculosis, một mối đe dọa kinh hoàng của nhân loại từ nhiều thế kỷ trước, đã từng được kiểm soát nhờ vào sự phát hiện của streptomycin Tuy nhiên, hiện nay vi khuẩn này đang trở lại và trở thành mối lo ngại toàn cầu, đặc biệt đối với bệnh nhân AIDS, do khả năng kháng thuốc của M tuberculosis đối với nhiều loại kháng sinh hiện có Các kháng sinh hiệu quả trong điều trị lao bao gồm streptomycin, muối Para-amino của acid salicylic (PAS) và ionicotinic acid Hydrazide (INH) Tổ hợp streptomycin, PAS và INH đã được sử dụng hiệu quả trong nhiều năm qua kể từ năm 1945, nhưng giờ đây cũng đã giảm hiệu quả.
Các bệnh nhiễm khuẩn đã được kiểm soát nhờ vào thuốc kháng sinh và vaccine ở các nước phát triển, nhưng vẫn là vấn đề nghiêm trọng tại các nước đang phát triển Ngoài những bệnh nhiễm khuẩn truyền thống, nhiều loại bệnh mới như tiêu chảy do E.coli, xuất huyết tiêu hóa và tiết niệu do EHEC, cũng như viêm loét dạ dày do Hecolibacter pylori đang gia tăng Đặc biệt, Hecolibacter pylori không chỉ gây viêm loét mà còn có khả năng gây ung thư dạ dày Thêm vào đó, một số nước Nam Á đang ghi nhận sự xuất hiện của các chủng vi khuẩn tả mới.
V.cholerae O139 khác với týp V.cholerae O1 vẫn gây dịch ở nhiều nước trên thế giới
Riêng HIV/AIDS đang gây đại dịch toàn cầu và là vấn đề nổi cộm của thế giới
Tình hình nghiên cứu về chất kháng sinh và cây Măng cụt
Kể từ khi Alexander Fleming phát hiện ra kháng sinh đầu tiên từ nấm Penicillium, nghiên cứu về kháng sinh vẫn tiếp tục phát triển mạnh mẽ Các nhà khoa học hiện đang tập trung vào việc phân lập vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc nội sinh trong cây dược liệu, với mục tiêu tìm ra các dòng nấm mốc có khả năng sản sinh chất kháng sinh tương tự như cây chủ.
Sutjaritvorakul et al (2003) đã phân lập 20 dòng nấm mốc từ lá cây trong rừng Dầu rái Dipterocarpus maksum tại Thái Lan, trong đó có 17 dòng thể hiện khả năng kháng khuẩn Tương tự, Radji et al (2011) đã phân lập 24 dòng nấm mốc từ mẫu lá và cành cây Măng cụt tại Indonesia, với 10 dòng có khả năng kháng khuẩn, nổi bật là dòng RGM-02, có khả năng kháng mạnh đối với cả 6 dòng vi khuẩn kiểm định.
Măng cụt đang thu hút sự chú ý của các nhà khoa học với nhiều nghiên cứu về dược liệu của nó Một nghiên cứu gần đây tại Indonesia đã phân lập được 12 dòng nấm mốc trong vỏ cây, lá và vỏ quả Măng cụt, trong đó 4 dòng cho thấy khả năng kháng vi khuẩn gây bệnh (Rivai et al., 2016) Ngoài ra, các nghiên cứu khác cũng khám phá hoạt động giảm đau và đặc tính dược lý của hoạt chất từ vỏ quả Măng cụt (Cui et al., 2010), cũng như hoạt tính kháng nấm của alpha-mangostin đối với Candida albicans (Kaomongkolgit et al., 2009).
2.4.2 Nghiên cứu trong nước Ở Việt Nam, việc nghiên cứu về chất kháng sinh đến rất muộn và phát triển chậm, đến năm 1949 mới được tiến hành do giáo sư bác sĩ Đặng Văn Ngữ với chủng nấm mốc Penicillum và thu được dịch lọc Penicillin Đến nay, có một vài công trình nghiên cứu của tác giả Mai Thị Hằng và Nguyễn Thành Đạt về nấm mốc đối kháng trong hệ sinh thái rừng ngập mặn Một nghiên cứu về phân lập nấm mốc kháng khuẩn từ rừng Đà Lạt của tác giả Nguyễn Thị Nhã Vy
Nghiên cứu năm 2009 đã phân lập thành công 297 dòng nấm mốc từ các mẫu lá tươi, thân tươi, đất, lá mục và thân mục Trong số đó, có 86 dòng nấm mốc thể hiện khả năng kháng khuẩn đáng chú ý.
Năm 2014, Trường Đại học Cần Thơ đã phân lập 11 dòng nấm từ đất ở quận Ninh Kiều, trong đó 7/11 dòng nấm cho thấy khả năng kháng lại ít nhất một trong bốn dòng vi khuẩn kiểm định Tuy nhiên, nghiên cứu về chất kháng sinh tại Việt Nam vẫn còn nhiều hạn chế so với các nước trên thế giới.
Nghiên cứu về Măng cụt (Garcinia mangostana L.) tại Việt Nam đã ghi nhận nhiều đề tài quan trọng như quy trình tách chiết mangostin và các hoạt chất khác trong vỏ quả để hỗ trợ điều trị ung thư (Đỗ Thị Tuyên, 2011), chiết tách và xác định xanthones trong vỏ quả (Đỗ Thị Thúy Vân et al., 2010), và phân lập xanthone từ quả (Nguyễn Văn Đậu et al., 2012) Tuy nhiên, hiện tại, các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào việc chiết tách và phân lập các hợp chất có lợi từ Măng cụt để ứng dụng trong điều trị bệnh, mà chưa có nghiên cứu nào về vi sinh vật cộng sinh trong Măng cụt Điều này tạo ra động lực quan trọng cho nghiên cứu của chúng tôi nhằm khám phá tiềm năng ứng dụng mới từ Măng cụt.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Phương tiện thí nghiệm
3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu
Phòng thí nghiệm Vi sinh vật môi trường thuộc Viện nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ, đã thực hiện đề tài từ tháng 4 đến tháng 11 năm 2016.
Mẫu cành non Măng cụt có độ tuổi khoảng từ 15-20 tuổi thu thập ở một số xã thuộc huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
- Escherichia coli chủng 1 (E1): ATCC® 25922 TM* (Công ty Microbiologics)
- Escherichia coli chủng 2 (E2): ATCC® TM* (Công ty Microbiologics)
-Bacillus cereus chủng 1 (B1): ATCC®11778 TM* (Công ty Microbiologics)
- Bacillus cereus chủng 2 (B2): ATCC®10876 TM* (Công ty Microbiologics)
- Samonella sp (S1): từ bộ sưu tập giống của PTN Mô thực vật, Viện NC & PT CNSH
- Samonella enterica subsp enterica serovar Typhimunum (S2): ATCC®14028 TM* (Công ty Microbiologics)
- Candida albicans (C): ATCC®10231 TM* (Công ty Microbiologics)
- Kính hiển vi quang học
- Nồi khử trùng nhiệt ướt
- Tủ ủ, tủ sấy, tủ cấy vô trùng
- Đĩa Petri, ống đong, que cấy, đèn cồn, các loại ống nghiệm, bình tam giác, …
Bảng 1: Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Radji et al., 2011)
Khoai tây Đường Dextrose Agar Nước cất
(Ghi chú: môi trường lỏng (Môi trường Potato Dextrose Broth (PDB)) không cần bổ sung agar)
Bổ sung vào môi trường kháng sinh streptomycin (0.25 mg/L); chloramphenicol (0.05 mg/L)
Bảng 2: Môi trường Luria Bertani (LB) (Li và Wang, 2009)
Phương pháp nghiên cứu
Mục đích: Phân lập được những chủng nấm mốc từ cành non cây Măng cụt trồng ở huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre a) Phương pháp phân lập
Mẫu được lấy tại huyện Chợ Lách, tỉnh Bến Tre, sau đó đem về phòng thí nghiệm trữ trong tủ lạnh ở 4⁰C nếu chưa sử dụng
Mẫu cần được rửa dưới vòi nước trong vài phút, sau đó cắt nhỏ khoảng 2cm và cho vào cốc thủy tinh Tiếp theo, rửa mẫu bằng cồn 70⁰ trong 1 phút, sau đó sử dụng dung dịch sodium hypochlorite 5,25% trong 5 phút, rồi rửa lại với cồn 70⁰ trong 30 giây và nước cất vô trùng từ 5-10 giây Sau đó, nghiền mẫu trong cốc sứ vô trùng, thêm khoảng 2mL nước cất vô trùng và khuấy đều Hút 0,1mL dịch huyền phù và trải lên đĩa petri chứa môi trường PDA vô trùng Cuối cùng, ủ đĩa môi trường ở nhiệt độ phòng cho đến khi xuất hiện khuẩn lạc (khoảng 3-7 ngày) để tiến hành cấy chuyển.
Sau khi cấy chuyển các khuẩn lạc đồng nhất, tiến hành cấy điểm để nhận diện đặc điểm của khuẩn lạc Tiếp theo, mẫu sẽ được chuyển sang môi trường thạch nghiêng để bảo quản.
Để kiểm tra độ ròng của mẫu khuẩn lạc, ta lấy một mẫu từ ống thạch nghiêng, hòa vào nước vô trùng và trải lên đĩa lần thứ hai Nếu thu được khuẩn lạc đồng nhất về hình dạng và màu sắc khi quan sát dưới kính hiển vi, có thể khẳng định rằng tế bào đã thuần Sau đó, cấy sang ba ống thạch nghiêng để bảo quản ngắn hạn và thử nghiệm khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm mốc.
Môi trường nuôi nhân sinh khối nấm mốc PDB được khử trùng bằng phương pháp nhiệt ướt ở 121⁰C, 1 atm trong 20 phút Sau đó, 50mL môi trường được cho vào chai màu sậm và bổ sung dòng nấm mốc cần nhân sinh khối Chai được đặt lên máy lắc với tốc độ 160 vòng/phút ở nhiệt độ phòng trong 5 ngày để quan sát sự phát triển của khuẩn lạc.
(i) Quan sát đại thể nấm mốc
Để tiến hành nghiên cứu, các chủng nấm mốc được phân lập từ ống thạch nghiêng sẽ được cấy ra đĩa môi trường PDA Sau đó, cần ủ đĩa ở nhiệt độ thích hợp trong khoảng thời gian từ 3-7 ngày cho đến khi khuẩn lạc phát triển Cuối cùng, tiến hành đo kích thước khuẩn lạc để thu thập dữ liệu cần thiết cho nghiên cứu.
- Quan sát hình dạng khuẩn lạc
Theo Nguyễn Liên Hoa et al., (2006), các đặc điểm hình thái nấm mốc cần quan sát gồm:
+ Hình dạng (tròn, gần tròn, …)
+ Kích thước (đường kính trung bình của khuẩn lạc)
+ Dạng mặt (nhung mượt, mịn, len xốp, dạng hạt, …)
+ Màu sắc khuẩn lạc mặt trên và mặt dưới
+ Dạng mép khuẩn lạc (mỏng, dày, nhăn nheo, …)
+ Mật số bào tử (nếu có)
(ii) Quan sát vi thể nấm sợi
- Quan sát hình dạng bào tử
+ Hình dạng cuống bào tử (bào tử túi, bào tử đính, bào tử đốt)
+ Hình dạng bào tử (tròn, gần tròn, oval, …)
- Quan sát hình dạng khuẩn ty
+ Đo kích thước sợi nấm
+ Đặc điểm: có hoặc không có vách ngăn
3.2.3 Kiểm tra khả năng sinh chất kháng khuẩn của nấm mốc
Thử khả năng sinh hoạt chất đối kháng của nấm mốc a) Nguyên tắc
Nếu các chủng nấm mốc trên khối thạch có khả năng hình thành hoạt chất kháng khuẩn, chúng sẽ ức chế và tiêu diệt các vi sinh vật kiểm định, tạo ra vòng vô khuẩn (halo) xung quanh khối thạch hoặc giếng thạch Việc này cần được tiến hành thông qua các thí nghiệm cụ thể.
+ Nhân nuôi các chủng nấm mốc từ ống thạch nghiêng sang đĩa môi trường tương ứng không có kháng sinh;
+ Ủ đĩa nuôi các chủng nấm mốc trong 5-7 ngày;
+ Chuẩn bị các đĩa môi trường có trãi sẵn các dòng vi sinh vật chỉ thị;
Sử dụng đầu col vô trùng có đường kính khoảng 6mm để khoan vào các khối thạch nấm mốc cần thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn, sau đó đưa chúng lên đĩa môi trường LB đã được chuẩn bị sẵn với các dòng vi sinh vật chỉ thị.
+ Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng nấm mốc phân lập được thông qua sự hiện diện vòng kháng khuẩn (halo) xung quanh khối thạch nấm mốc;
+ Chọn các dòng có khả năng kháng khuẩn (thông qua vòng halo) để tiến hành đánh giá
- Phương pháp khuyếch tán qua giếng thạch
+ Cấy từng dòng nấm mốc đã phân lập ròng vào ống falcon chứa 20mL môi trường lỏng (PDB) Ủ ở nhiệt độ phòng, sau 5-7 ngày thu dịch nuôi cấy;
Hút 1,5mL dịch nuôi cấy vào ống Eppendorf 2mL đã được vô trùng, sau đó ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong 10 phút Tiếp theo, hút khoảng 1mL dịch ở phần trên và cho vào ống Eppendorf khác để tránh làm lẫn mẫu với bào tử hoặc khuẩn ty trước khi sử dụng.
+ Chuẩn bị môi trường thích hợp cho từng dòng vi sinh vật chỉ thị;
+ Trãi các vi sinh vật chỉ thị với nồng độ thích hợp lên các môi trường thích hợp bằng tăm bông đã khử trùng, phơi đĩa trải khoảng 10 phút;
+ Khoan tạo lỗ giếng thạch các đĩa đã trải vi sinh vật chỉ thị;
(Giếng thạch có đường kính 6 mm, sâu khoảng 3mm, mỗi đĩa 3-4 giếng)
+ Hút 50μl phần trong từ tube, nhỏ vào các giếng đã được khoan lỗ sẵn trên môi
LB có trãi sẵn các dòng vi sinh vật chỉ thị;
+ Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng nấm mốc phân lập được thông qua sự hiện diện vòng kháng khuẩn (halo) xung quanh giọt dịch nấm mốc;
+ Chọn các dòng có khả năng kháng khuẩn (thông qua vòng halo) để tiến hành đánh giá
- Chuẩn bị vi sinh vật kiểm định (McFarland và Nephelometer, 1907)
Cấy các dòng vi sinh vật kiểm định trên môi trường LB trong vòng 24 giờ để thu nhận sinh khối Để thực hiện, pha trộn hỗn hợp dung dịch McFarland theo công thức 99,5mL H2SO4 1% và 0,5mL dung dịch khác.
BaCl2 1% được sử dụng để kiểm định sinh khối vi sinh vật Đầu tiên, cho sinh khối vào ống nghiệm chứa 10mL nước muối sinh lý hoặc nước cất đã khử trùng, sau đó lắc đều So sánh độ đục của ống nghiệm với độ đục của dung dịch McFarland 0,5 tại bước sóng 625nm, cho thấy nồng độ vi khuẩn trung bình khoảng 1-2 x 10^8 CFU Tiếp theo, pha loãng vi khuẩn 100 lần để đạt được nồng độ 10^6 CFU Cuối cùng, tiến hành kiểm tra kết quả.
Hoạt tính kháng sinh = (D – d) mm
Với D = đường kính vòng phân giải, d = đường kính khuẩn lạc (giấy lỗ khoan)
Theo Đỗ Thu Hà (2004) đánh giá khả năng kháng khuẩn của chất kháng khuẩn dựa vào việc đo kích thước đường kính vòng vô khuẩn:
- (D – d) ≥ 25mm: hoạt tính rất mạnh
- (D – d ) ≥ 10-19,5mm: hoạt tính trung bình
Sơ tuyển nấm mốc
Chọn những chủng nấm mốc có hoạt tính mạnh và rất mạnh.
Nhận diện các dòng nấm sợi bằng phương pháp sinh học phân tử
3.4.1 Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc nấm mốc
Sử dụng kim cấy đầu tam giác để lấy bào tử từ khuẩn lạc nấm mốc đã phát triển mạnh và thuần trên đĩa sau 7-10 ngày, sau đó cho bào tử vào ống 2,2 mL.
- Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc
- Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
- Ly tâm 13000 vòng/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 vòng/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên
- Rửa phần tủa bằng 500 μL Ethanol 70%, ly tâm 13000 vòng/5 phút
- Sấy khô chân không trong 10 phút (45 0 C)
Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau:
Quá trình thực hiện phản ứng PCR:
Bảng 3: Công thức phản ứng PCR với thể tích 50μL/phản ứng
PCR buffer (10X Taq buffer (NH 4 ) 2 SO 4 ) 5
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (⁰C) Thời gian
Sản phẩm PCR được tinh sạch và giải trình tự tự động bởi công ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa Kết quả sẽ được so sánh với cơ sở dữ liệu GenBank trên NCBI thông qua công cụ BLAST.
