CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4. Nhận diện các dòng nấm sợi bằng phương pháp sinh học phân tử
3.4.1. Quy trình ly trích DNA từ khuẩn lạc nấm mốc
- Dùng kim cấy đầu tam giác lấy bào tử từ khuẩn lạc nấm mốc đã được cấy ra đĩa từ 7-10 ngày (nấm mốc đã phát triển mạnh và thuần), cho vào tube 2,2 mL.
- Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
- Cho vào 1 mL Lysis buffer, lắc đều, ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút. - Ly tâm 13000 vòng/5 phút, lấy phần dung dịch chuyển sang tube mới.
- Cho một lượng tương đương Ethanol 95%, ly tâm 13000 vịng/5 phút, bỏ phần dung dịch phía trên.
- Rửa phần tủa bằng 500 μL Ethanol 70%, ly tâm 13000 vịng/5 phút. - Sấy khơ chân khơng trong 10 phút (450C).
- Trữ ở -20oC.
3.4.2. Phản ứng PCR
Sau khi tinh sạch DNA, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi (White et al., 1990) có trình tự sau:
ITS 1: 5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’ ITS 4: 5’-TCCTCCGCTTATTG ATATGC-3’ Quá trình thực hiện phản ứng PCR:
Bảng 3: Công thức phản ứng PCR với thể tích 50μL/phản ứng Hóa chất Thể tích (μL) Hóa chất Thể tích (μL)
H20 34,5
PCR buffer (10X Taq buffer (NH4)2SO4) 5
Polymerisation MgCl2 (25mM) 3
dNTPS 3
Primer F 1
Primer R 1
Taq DNA polymerase (5u/μL) 0,5
DNA 2
Tổng cộng 50
Bảng 4: Các giai đoạn của phản ứng PCR
Giai đoạn Tên giai đoạn Chu kỳ Nhiệt độ (⁰C) Thời gian
1 Biến tính 30 95 5 phút 95 90 giây 2 Bắt cặp 30 53 60 giây 3 Kéo dài 30 72 90 giây 72 5 giây
Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi giải trình tự bằng hệ thống giải trình tự tự
động bởi cơng ty TNHH MTV Sinh Hóa Phù Sa. Kết quả này sẽ được so sánh với cơ