Trong những năm gần đây, hướng nghiên cứu tìm ra các loài vi sinh vật biển có chứa các hợp chất mới với hoạt tính sinh học cao từ vùng biển Việt Nam ngày càng được đẩy mạnh, thu hút sự quan tâm của nhều nhà khoa học. Một trong số các loài vi sinh vât biển tiêu biểu phải kể đến là Hải miên (Sponges) với nhiều hợp chất mới cóhoạt tính sinh học cao được tìm ra, đồng thời là nơi cộng sinh của cộng đồng vi sinh vật vô cùng phong phú. Cùng với sự quan tâm và hướng nghiên cứu đó, đề tài “Phân lập và tuyển chọn dòng vi kkhuẩn sợi (Actinobacteria) có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn ở Hải miên (Sponges) sống ở vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang” đãđược thức hiên và mang lại kết quả hết sức khả quan. Với 23 mẫu Hải miên thu được tại vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang, đã phân lập được 90 dòng vi khuẩn sợi trên môi trường thạch SCA. Sau khi phân lập tiếp tục tiến hành kiểm tra khả năng kháng khuẩn của các dòng vi khuẩn sợi bẳng phương pháp khuếch tán qua giếng thạch đốivới 7 dòng vi khuẩn chỉ thị gồm: Bacillus cereus chủng 1; Bacillus cereus chủng 2; Candida albicans; Escherichia coli chủng 1; Escherichia coli chủng 2; Samonella sp., Samonella enterica subsp. enterica serovar Typhimurium.
GIỚI THIỆU
ĐẶT VẤN ĐỀ
Kháng sinh hiện nay được xem là nhóm thuốc thiết yếu trong y học, giúp tiêu diệt hoặc làm chậm sự phát triển của vi khuẩn, từ đó hỗ trợ hệ miễn dịch chống lại nhiễm khuẩn (Kohanski et al., 2010) Ngoài ứng dụng trong y tế, kháng sinh còn đóng vai trò quan trọng trong chăn nuôi, bảo quản thực phẩm và bảo vệ thực vật (Ceylan et al., 2008) Tuy nhiên, tình trạng kháng kháng sinh đang trở nên nghiêm trọng với sự xuất hiện của các chủng vi sinh vật kháng nhiều loại kháng sinh, dẫn đến nhiều bệnh nhiễm khuẩn như thương hàn và nhiễm trùng huyết (Barrett, 2003) Việc gia tăng vi khuẩn đa kháng thuốc cùng với sự thiếu hụt kháng sinh mới đang khiến con người đối mặt với “thời kỳ hậu kháng sinh” Do đó, ngành công nghiệp sản xuất kháng sinh cần cải tiến các loại kháng sinh cũ và đẩy mạnh nghiên cứu để phát hiện ra các kháng sinh mới (Alanis, 2005).
Vi khuẩn sợi, đặc biệt là các loài thuộc chi Streptomyces, đóng vai trò quan trọng trong việc sản xuất kháng sinh, chiếm khoảng 80% tổng số chất kháng sinh được phát hiện Tuy nhiên, việc tìm kiếm kháng sinh mới từ Streptomyces phân lập từ đất đã trở nên hiếm và khó khăn trong những năm gần đây Do đó, nghiên cứu phân lập các loài vi khuẩn sợi từ nhiều nguồn khác nhau đang thu hút sự quan tâm mạnh mẽ.
Trong xu hướng nghiên cứu hiện nay, các loài vi khuẩn sợi hiếm từ biển đang thu hút sự chú ý nhờ khả năng sản sinh các hợp chất thứ cấp có hoạt tính sinh học quý giá như kháng sinh và hợp chất chống ung thư Các nghiên cứu trong nước đã chỉ ra rằng vi sinh vật từ hệ sinh thái biển Việt Nam, đặc biệt là vùng biển Hà Tiên, có độ đa dạng sinh học cao, hứa hẹn là nguồn nguyên liệu tiềm năng cho việc phát triển kháng sinh mới Đặc biệt, nhiều hợp chất kháng khuẩn đã được phát hiện từ động vật không xương sống, như Hải miên (ngành Porifera), nhấn mạnh tính đa dạng của ngành này và sự phong phú của cộng đồng vi sinh vật trong mô của chúng, có khả năng tạo ra các sản phẩm sinh học tự nhiên có giá trị cao.
Trong bối cảnh phát hiện và phát triển các sản phẩm có hoạt tính sinh học phục vụ y học và bảo vệ sức khỏe, đề tài nghiên cứu “Phân lập và tuyển chọn vi khuẩn sợi (Actinobacteria) có khả năng sinh hoạt chất kháng khuẩn từ Hải miên (Sponge) tại vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang” được thực hiện nhằm tìm kiếm các dòng vi khuẩn sợi có khả năng kháng khuẩn và tiềm năng ứng dụng thực tế.
MỤC TIÊU CỦA ĐỀ TÀI
Một số dòng vi khuẩn sợi có khả năng sản sinh chất kháng khuẩn đã được phân lập và tuyển chọn tại Hải miên thu ở vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
SƠ LƯỢC VỀ HẢI MIÊN
2.1.1 Giới thiệu về Hải miên
Hải miên, được xem là động vật đa bào nguyên thủy nhất, đã xuất hiện từ khoảng 600 triệu năm trước, vào đầu thời kỳ tiền Cambri (Liet al., 1998) Sự phân kỳ của Hải miên từ tổ tiên chung với các động vật đa bào khác có thể đã diễn ra sớm hơn, khoảng 1,3 tỷ năm trước (Hedges et al., 2004) Trong thời kỳ Cổ sinh, Hải miên chiếm ưu thế trong các hệ sinh thái biển (Hooper et al., 2002) Ngày nay, chúng vẫn là thành phần quan trọng trong cả cộng đồng sinh vật vùng nước cạn và sâu, chiếm tới 80% bề mặt sẵn có ở một số khu vực (Dayton et al., 1989) Hải miên (phylum Porifera) là những động vật sống lâu và rất ổn định, tồn tại suốt 700 triệu năm qua.
Hải miên, một nhóm động vật không xương sống đa bào, đã tồn tại khoảng 800 triệu năm với tốc độ sinh trưởng khác nhau giữa các loài Chúng chủ yếu sống bám vào nền biển, nhưng cũng có khoảng 1% trong số 15.000 loài hải miên sống ở môi trường nước ngọt Mặc dù không có mô thực sự, hải miên sở hữu nhiều loại tế bào khác nhau, mỗi loại đảm nhận các chức năng riêng biệt để thực hiện các hoạt động của cơ thể.
Nghiên cứu gần đây cho thấy Hải miên có khả năng sản xuất các chất trao đổi thứ cấp, cung cấp nguồn tài nguyên phong phú cho các sản phẩm tự nhiên giá trị như polyketides, nonribosomal peptides và alkaloids, giúp xua đuổi kẻ thù và chống lại sự nhiễm bệnh (Xu et al., 2009) Hải miên có tiềm năng cung cấp thuốc chống lại nhiều mầm bệnh, với các hợp chất có hoạt tính như cytotoxic, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng virus và chống viêm Trong số 18.000 sản phẩm tự nhiên từ biển, hơn 30% đến từ Hải miên (Koopmans et al., 2009) Tuy nhiên, nồng độ các chất hoạt tính sinh học trong Hải miên rất thấp, như Lissodendorix sp chỉ chứa khoảng 400μg/kg halichondrin B, điều này nhấn mạnh sự cần thiết của các phương pháp sản xuất bền vững Cần xác định rõ vai trò của Hải miên và các loài nội cộng sinh trong việc sản sinh các chất có hoạt tính sinh học, và nếu Hải miên là nguồn chính, cần tìm ra tế bào chịu trách nhiệm (Niyaz, 2012) Do hàm lượng thấp của các chất này, việc thu thập một lượng lớn sinh khối Hải miên cho quá trình tách chiết là rất cần thiết.
Hầu hết Hải miên có cộng đồng vi sinh vật cực kỳ đa dạng trong mô của chúng
Sự đa dạng sinh học trong Hải miên phần nào được giải thích bởi sự biến đổi của các điều kiện lý, hóa và sinh, ảnh hưởng đến hệ sinh thái vi sinh vật và quá trình tiến hóa.
Vi sinh vật biển đóng vai trò quan trọng trong tất cả các hệ sinh thái biển với sự đa dạng và quá trình trao đổi chất phức tạp Chúng là những nhà sản xuất sinh khối đầu tiên trong đại dương, thu nhận ánh sáng và cố định carbon, đồng thời tham gia vào chu trình của các nguyên tố sinh học như nitơ, cacbon, oxy, photpho, sắt, lưu huỳnh và các nguyên tố vi lượng Mặc dù những đóng góp của vi sinh vật biển vào chu trình hóa địa sinh vẫn chưa được hiểu rõ, nhưng với tính linh hoạt trong các quá trình chuyển hóa và sinh khối lớn, chúng được xem là yếu tố chính trong việc duy trì ổn định các hệ sinh thái biển.
Sponges, classified into four main classes—Demospongiae, Calcarea, Homoscleromorpha, and Hexactinellida—are diverse marine organisms Common species include Petromica citrina, Amphimedon viridis, Desmapsamma anchorata, Polymastia janeirensis, Aplysina fulva, Mycale angulosa, Hymeniacidon heliophila, Dysidea etheria, Tethya rubra, Tethya maza, Chondrosia collectrix, Tedania ignis, Hyrtioserecta, and Amphimedon chloros.
2.1.2 Đặc tính của một số chi Hải miên
Hải miên chi Hyrtios, thuộc họ Thorectida, lớp Demospongia, là nguồn phong phú các chất chuyển hóa thứ cấp có hoạt tính sinh học như terpenoids, macrolides và tryptamine Những hợp chất này đã được chứng minh là có khả năng chống ung thư mạnh mẽ Đặc biệt, hợp chất heteronemin từ Hải miên Hyrtios sp không chỉ có dược lực cao trong bào chế thuốc mà còn có khả năng kháng khuẩn và chống ung thư Nghiên cứu cho thấy hợp chất này gây độc cho tế bào A498, ức chế sự tăng trưởng và dẫn đến cái chết của tế bào ung thư theo thời gian (Wu et al., 2015).
Hải miên thuộc chi Hyrtios đã được xác nhận là nguồn cung cấp phong phú các hợp chất gây độc tế bào, mở ra hướng đi mới cho điều trị ung thư (Inman et al., 2011) Dẫn xuất indol từ Hyrtios cũng thể hiện nhiều tác dụng tích cực, bao gồm chống ung thư, kháng sinh, chống viêm và hoạt động chống oxy hóa Các hợp chất chuyển hóa từ Hyrtios có khả năng kháng khuẩn và loại bỏ gốc tự do (Youssef et al., 2013) Dịch trích từ Hyrtios sp là sản phẩm tự nhiên tiềm năng cho phát triển thuốc điều trị ung thư đại trực tràng ở người (Lim et al.).
2014) Vì thế Hải miên thuộc chi Hyrtios là một ứng cử viên tốt cho việc điều trị bệnh ung thư trong tương lai
Hải miên Hyrtioserecta thuộc chi Hyrtios có khả năng hấp thu và tích lũy các nguyên tố như Al, Cr, Fe, Mn, Ti, V với nồng độ đáng kể so với các loài khác Điều này chứng tỏ tính đặc hiệu của loài Hải miên này trong việc chọn lọc các thành phần từ môi trường Việc nghiên cứu sâu hơn về các thành phần và sự tham gia của chúng trong quá trình trao đổi của Hải miên là cần thiết (Mayzel et al., 2014).
Hải miên Hyrtios sp chứa nhiều hợp chất có hoạt tính sinh học cao như terpenoids, macrolides và tryptamine từ alkaloid, cùng với các sesterterpenes và sesquiterpene Đặc biệt, Puupehanol, một sesquiterpene-dihydroquinone mới, và các hợp chất puupehenone, chloropuupehenone đã được phát hiện có tác dụng kháng nấm Puupehenone, hợp chất chính trong lớp sesquiterpene-quinone, cho thấy khả năng kháng khuẩn, chống sốt rét, chống độc tế bào, kháng vi khuẩn lao, và hoạt động chống oxy hóa Ngoài ra, spongistatin, một lacton macrocyclic từ Hải miên Hyrtioserecta, có hoạt tính kháng nấm phổ rộng.
Amphimedon là một loài thuộc Ngành Porifera, có nguồn gốc từ những động vật cổ đại với hình thái đơn giản, tách ra từ động vật đa bào khác cách đây ít nhất 700 triệu năm, trước sự bùng nổ của kỷ Cambri.
Amphimedon queenslandica là một loài quan trọng trong nghiên cứu sinh hóa và trao đổi chất ở Hải miên, sinh sản quanh năm với số lượng lớn ấu trùng vào mùa ấm Khác với các loài Hải miên khác, chúng tập trung tế bào trứng trong một buồng gồm nhiều lứa, tạo thành các tầng, dẫn đến sự thay đổi đáng kể trong cấu trúc bên trong (Leys et al., 2001) Một phần lớn ấu trùng Amphimedon queenslandica sẽ chết sau khi biến đổi, trong khi số còn lại phát triển mạnh mẽ (Nakanishi et al., 2014).
Dịch trích từ Hải miên Amphimedonviridis có khả năng phòng chống tác hại của nọc độc rắn, trung hòa sự phân giải protein và ức chế các triệu chứng như gây chết và xuất huyết do nọc rắn (Faioli et al., 2013) Nhiều loài Amphimedon sp có thể phát hiện các cường độ ánh sáng khác nhau, với độ nhạy cảm tối đa ở 440nm (màu xanh) (Leys et al., 2002) Đặc biệt, sự kết hợp giữa bavirin, interferon và các chất ức chế protease virus hứa hẹn sẽ mở ra hướng đi mới cho bệnh nhân nhiễm viêm gan siêu vi C (HCV) Các nghiên cứu cho thấy hợp chất trong Amphimedon sp nhắm đến hoạt động protease và helicase của HCV NS3 Hợp chất C-29EA, chiết xuất từ Amphimedon sp., cho thấy khả năng ức chế mạnh mẽ sự nhân bản của HCV mà không gây độc Thêm vào đó, hợp chất EtOAc từ Amphimedon sp cũng hạn chế đáng kể khả năng nhân bản của HCV bằng cách ức chế hoạt động helicase và protease của virus (Fujimoto et al., 2012).
2.1.3 Vi sinh vật trong Hải miên
Khác với nhiều vật chủ khác, chỉ một số ít Hải miên có khả năng nội sinh Tuy nhiên, sự đa dạng của vi sinh vật trong Hải miên rất phong phú, với mỗi loại vi sinh vật gắn liền với vật chủ tương ứng của nó.
Các ngành vi khuẩn nội sinh trong Hải miên rất đa dạng, với 14 ngành vi khuẩn đã được phân loại từ 2 ngành Hải miên cổ chủ yếu (Hentschel et al.).
SƠ LƯỢC VỀ VI KHUẨN SỢI
2.2.1 Giới thiệu về vi khuẩn sợi
2.2.1.1 Phân b ố c ủ a vi khu ẩ n s ợ i trong t ự nhiên
Vi khuẩn sợi (Actinobacteria) là một nhóm vi khuẩn thật (Eubacteria) có mặt rộng rãi trong tự nhiên, bao gồm đất, nước, rác, phân chuồng và bùn Chúng tồn tại ngay cả trong những môi trường khắc nghiệt mà vi khuẩn và nấm mốc không thể phát triển Sự phân bố của vi khuẩn sợi phụ thuộc vào các yếu tố như khí hậu, thành phần môi trường, mức độ canh tác và thảm thực vật.
Theo nghiên cứu của Theo Waksman, trong một gam đất có từ 29.000 đến 2.400.000 mầm vi khuẩn sợi, chiếm từ 9% đến 45% tổng số vi sinh vật Sự phân bố của vi khuẩn sợi phụ thuộc vào độ pH của môi trường, với sự hiện diện nhiều hơn trong môi trường trung tính, kiềm yếu hoặc axit yếu có pH từ 6,8 đến 7,5.
Vi khuẩn sợi nổi bật với khả năng kháng khuẩn, chiếm 60-70% vi khuẩn sợi được phân lập từ đất Khoảng 80% trong số hơn 8000 chất kháng sinh đã biết trên thế giới được sản xuất bởi vi khuẩn sợi Đặc biệt, hơn 15% chất kháng sinh có nguồn gốc từ các loại vi khuẩn sợi hiếm như Micromonospora, Actinomadura, Actinoplanes, Streptoverticillium và Streptosporangium Những vi khuẩn sợi hiếm này đã cung cấp nhiều kháng sinh quý giá trong y học như gentamixin, tobramixin, vancomixin và rosamixi.
Vi khuẩn sợi đóng vai trò quan trọng trong việc chuyển hóa các hợp chất trong đất và nước, đồng thời được sử dụng để sản xuất nhiều axit amin, axit hữu cơ và enzym như proteaz, amylaza, và xenluloza Tuy nhiên, cần lưu ý rằng một số loại vi khuẩn sợi có khả năng gây bệnh cho con người và động vật.
Nhiệt độ đóng vai trò quan trọng trong sự phát triển của vi khuẩn sợi, với một số loài ưa nhiệt có khả năng sinh trưởng tốt ở nhiệt độ cao Tuy nhiên, hầu hết các vi khuẩn sợi có khả năng sản sinh chất kháng khuẩn thường phát triển mạnh mẽ ở nhiệt độ từ 28°C đến 30°C, tương đương với điều kiện phòng thí nghiệm Nhiệt độ tối ưu cho quá trình tổng hợp kháng sinh thường nằm trong khoảng 18°C.
Độ pH của môi trường đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh Để tối ưu hóa quá trình này, pH trung tính là điều kiện lý tưởng, trong khi pH acid và kiềm có thể ức chế sự sinh tổng hợp chất kháng sinh.
Độ thông khí là yếu tố quyết định đến khả năng sinh tổng hợp chất kháng sinh, đặc biệt đối với các vi khuẩn sợi thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí Để đạt hiệu suất cực đại trong quá trình sản xuất kháng sinh, việc cung cấp lượng không khí vào môi trường nuôi cấy cần đạt lưu lượng thổi khí là 1 thể tích môi trường mỗi phút.
Nhân giống sinh vật có ảnh hưởng lớn đến sinh tổng hợp chất kháng sinh, không chỉ phụ thuộc vào điều kiện nuôi cấy mà còn vào chất lượng giống sinh dưỡng, bao gồm tuổi và khả năng đồng đều về di truyền cũng như hoạt tính trao đổi chất Điều kiện môi trường và thời gian nhân giống cũng thay đổi tùy theo từng chủng và tuổi của giống nuôi.
Hình thức nuôi tăng sinh khối đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh tổng hợp chất kháng sinh Phương pháp nuôi cấy quyết định đến hiệu quả sản xuất, thường được thực hiện qua nuôi cấy lõng trong bình nuôi có khuấy đảo và sục khí.
2.2.1.3 Đặ c đ i ể m hình thái c ủ a vi khu ẩ n s ợ i
Vi khuẩn sợi có những đặc điểm nổi bật như hệ sợi phát triển và phân nhánh mạnh, không có vách ngăn, ngoại trừ cuống sinh bào tử trong quá trình hình thành bào tử Hệ sợi của vi khuẩn này mảnh hơn so với nấm mốc, với đường kính dao động từ 0,2 – 1 μm đến 2 – 3 μm, và chiều dài có thể lên tới vài cm.
Kích thước và khối lượng của hệ sợi vi khuẩn thường không ổn định, phụ thuộc vào điều kiện sinh lý và môi trường nuôi cấy Điều này tạo ra sự khác biệt rõ rệt giữa khuẩn lạc của vi khuẩn sợi và khuẩn lạc của nấm mốc, trong đó hệ sợi nấm mốc có đường kính lớn, dao động từ 5 đến 50 μm, và có thể dễ dàng quan sát bằng mắt thường.
Khuẩn lạc của vi khuẩn sợi có hình dạng đa dạng như chắc, xù xì, dạng da, vôi, nhung tơ hay mãng dẻo Màu sắc của khuẩn lạc này rất phong phú, bao gồm các màu đỏ, da cam, vàng, nâu, xám và trắng, tùy thuộc vào loại vi khuẩn và điều kiện môi trường xung quanh.
Kích thước và hình dạng của khuẩn lạc vi sinh vật thay đổi tùy thuộc vào loài và điều kiện nuôi cấy, bao gồm thành phần môi trường, nhiệt độ và độ ẩm Thông thường, đường kính của mỗi khuẩn lạc dao động từ 0,5 đến 2 mm, nhưng một số khuẩn lạc có thể đạt đường kính lên tới 1 cm hoặc lớn hơn.
Hình 2: Hình dạng các khuẩn lạc vi khuẩn sợi ở Hải miên khi tiến hành trãi đĩa
Khuẩn lạc được cấu tạo từ ba lớp: lớp vỏ ngoài dạng sợi bện chặt, lớp trong tương đối xốp và lớp giữa có cấu trúc tổ ong, với mỗi lớp có chức năng sinh học riêng Trong quá trình trao đổi chất, các sản phẩm như kháng sinh, độc tố, enzyme, vitamin và axit hữu cơ có thể tích lũy trong sinh khối của tế bào vi khuẩn sợi hoặc được tiết ra môi trường.
Trong môi trường cơ chất đặc, vi khuẩn sợi phát triển thành hai loại hệ sợi: hệ sợi cơ chất (khuẩn ty cơ chất) cắm sâu vào môi trường, chủ yếu để cung cấp dinh dưỡng, và hệ sợi khí sinh (khuẩn ty khí sinh) phát triển trên bề mặt thạch, chủ yếu phục vụ cho quá trình sinh sản.
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM THỰC HIỆN
Thí nghiệm được tiến hành tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật Môi Trường và Vi Sinh Vật Đất thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ.
Thời gian thực hiện từ tháng 5/2016 đến tháng 11/2016.
PHƯƠNG TIỆN THÍ NGHỆM
Bài viết này trình bày 23 mẫu Hải miên được thu thập từ hai địa điểm khác nhau: 15 mẫu từ Ba Hòn Đầm và 8 mẫu từ Núi Đèn, cả hai đều thuộc vùng biển Hà Tiên, tỉnh Kiên Giang.
Các chủng vi sinh vật kiểm định:
- Escherichia coli chủng 1 (E1): ATCC® 25922 TM* (Công ty Microbiologics)
- Escherichia coli chủng 2 (E2): ATCC® TM* (Công ty Microbiologics)
- Bacillus cereus chủng 1 (B1): ATCC®11778 TM* (Công ty Microbiologics)
- Bacillus cereus chủng 2 (B2): ATCC®10876 TM* (Công ty Microbiologics)
- Samonella sp (S1): từ bộ sưu tập giống của PTN Mô thực vật, Viện NC & PT CNSH
- Samonella enterica subsp enterica serovar Typhimurium (S2): ATCC®14028 TM* (Công ty Microbiologics)
- Candida albicans (C): ATCC®10231 TM* (Công ty Microbiologics)
3.2.2.Dụng cụ và thiết bị
- Que cấy, que gạt thủy tinh;
- Tủ cấy vi sinh vật;
- Tủ lạnh giữ mẫu SHARP;
- Nồi khử trùng nhiệt ướt;
3.2.3.Hóa chất, môi trường nuôi cấy và phân lập
Bảng 1: Môi trường Starch Casein Agar (SCA) (Mohseni et al., 2013)
Nước biển 1 lít đã qua lọc pH từ 6,9 - 7,1
Môi trường SCA dùng để nuôi cấy vi khuẩn sợi, đồng thời có bổ sung kháng sinh Aginalxic (0,5 mg/l) và Nystatin (0,5 mg/l) vào môi trường
Bảng 2: Môi trường Difco TM Mueller Hinton Agar (MHA) (Mueller và
Hinton et al., 1941) Hóa chất Nồng độ (g/l)
Nước cất 1 lít pH từ 7,2 – 7,4
Môi trường MHA là môi trường dùng để nuôi các dòng vi khuẩn chỉ thị
PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3.1 Thu thập và xử lý mẫu
Mẫu được thu thập ở độ sâu 0,5m so với mực nước biển và được bảo quản trong thùng xốp với nước đá trong quá trình vận chuyển về phòng thí nghiệm Sau đó, mẫu tiếp tục được giữ lạnh ở nhiệt độ từ 0°C đến 5°C.
3.3.2 Nuôi cấy và phân lập vi khuẩn sợi
- Mẫu Hải miên được cắt nhỏ khoảng 1cm 2 , và được rửa sạch nhiều lần bằng nước biển vô trùng (lấy từ nơi lấy mẫu) trong tủ cấy vô trùng;
- Dùng kéo vô trùng cắt nhỏ mẫu cho vào ống nghiệm, thêm vào 3ml nước biển vô trùng, dùng đũa thủy tinh nghiền nát mẫu trong ống nghiệm;
- Sau khi nghiền, pha loãng nồng độ dung dịch mẫu lần lượt 10 -1 , 10 -3 , 10 -6 lần;
- Hút 100μl dung dịch gốc và các dung dịch pha loãng cho vào các đĩa môi trường nuôi cấy (SCA) đã chuẩn bị sẵn;
- Dùng que thủy tinh trãi mẫu trãi đều giọt mẫu trong đĩa
- Ủ đĩa trong tủ ủ ở nhiệt độ 30 0 C từ 10 – 15ngày để các vi khuẩn sợi phát triển
- Các đĩa trãi mẫu ủ trong tủ vi sinh ở 30 0 C từ 10 – 15 ngày xuất hiện nhiều dạng khuẩn lạc khác nhau;
- Chọn các khuẩn lạc khác nhau cấy vào các đĩa khác để phân lập và ủ ở 30 0 C;
- Cấy phân lập nhiều lần trên môi trường tương ứng cho tới khi quan sát thấycác khuẩn lạc tách rời nhau và đồng nhất;
- Chọn 1 khuẩn lạc tách rời cấy vào ống thạch nghiêng chứa môi trường tương ứng, ủ ở 30 0 C cho vi khuẩn sợi phát triển
Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn sợi phân lập bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần Để thực hiện kiểm tra này, cần chuẩn bị mẫu một cách chính xác.
- Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn;
- Nhỏ 30μl nước cất vô trùng lên lam kính;
- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn sợi trong ống nghiệm trãi đều lên giọt nước trên lam kính;
Để đặt lamen lên giọt nước, hãy nghiêng lamen một góc 45 độ so với lam kính và tiếp xúc nhẹ nhàng với giọt nước Sau đó, hạ lamen xuống từ từ để tránh tạo ra bọt khí.
Để kiểm tra độ ròng của mẫu, cần quan sát dưới kính hiển vi điện tử Nếu vi khuẩn sợi có cùng hình dạng và kích thước khi quan sát, điều này cho thấy mẫu đã đạt yêu cầu về độ ròng.
- Nếu mẫu ròng thì cấy vào 2 ống nghiệm chứa môi trường phân lập tương tự để trữ lại tạm thời cho các bước tiếp theo
3.3.5 Quan sát vi khuẩn sợi
3.3.5.1 Quan sát hình thái, đ o kích th ướ c khu ẩ n l ạ c
Khi cấy vi khuẩn trên môi trường phân lập, cần đồng thời đo kích thước và quan sát hình thái của các dạng khuẩn lạc bằng mắt thường Các chỉ tiêu quan trọng cần lưu ý bao gồm màu sắc, hình dạng, kích thước, độ nổi và dạng bìa của khuẩn lạc.
+ Màu sắc khuẩn lạc (trắng, đỏ, vàng, cam,…)
+ Hình dạng khuẩn lạc (tròn, thoi,…)
+ Kích thước khuẩn lạc (đường kính trung bình của khuẩn lạc)
+ Dạng bìa (nguyên, răng cưa,…)
Khi khuẩn lạc vi khuẩn sợi được nuôi trên môi trường phân lập đã ròng, cần tiến hành quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần bằng phương pháp giọt ép Đồng thời, ghi nhận hình thái tế bào dựa trên các tiêu chí đã định sẵn.
+ Sự chuyển động (có chuyển động, không chuyển động)
+ Hình dạng tế bào (cầu, que, kết chuỗi,…)
Sau khi quan sát hình thái và đo kích thước khuẩn lạc, chúng tôi tiến hành nhuộm Gram các dòng vi khuẩn sợi và quan sát dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần Cấu trúc thành tế bào của vi khuẩn sợi tương tự như vi khuẩn Gram dương, do đó kết quả nhuộm Gram sẽ cho màu xanh hoặc tím.
Các bước thực hiện nhuộm Gram:
- Khử trùng lam kính và lamen bằng cồn, để khô cồn;
- Nhỏ 30μl nước cất vô trùng lên lam kính;
- Khử trùng que cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội;
- Dùng que cấy lấy một ít vi khuẩn sợi trong ống nghiệm trãi đều lên giọt nước trên lam kính và để khô tự nhiên;
- Hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn 2, 3 lần để cố định vi khuẩn sợi lên lam kính;
- Nhỏ 100μl Crystal Violet lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút;
- Rửa lại với nước cất vô trùng để ráo nước;
- Tiếp tục nhỏ 100μl Lugol lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút;
- Rửa lại với nước cất vô trùng;
- Tẩy màu bằng cồn 96 0 cho đến khi hết máu xanh tím;
- Rửa nhanh lại với nước và để khô;
- Nhỏ 100μl Safranin lên trên vệt vi khuẩn sợi vừa cố định trong 1 phút;
- Rửa lại với nước cất vô trùng và để khô tự nhiên;
- Quan sát dưới kính hiển vi quang học có độ phóng đại 400 lần
3.3.6 Đánh giá khả năng kháng khuẩn (Bioassay of Antimicrobial Activity)
3.3.6.1 Ph ươ ng pháp khu ế ch tán qua gi ế ng th ạ ch (well diffusion assay) (dựa theo phương pháp của Gandhimathi et al., 2009)
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn sợi phân lập được:
Nhân nuôi vi khuẩn sợi bằng cách chuyển từ ống thạch sang ống falcon 50ml chứa 15ml môi trường lỏng SCA Sau đó, ủ các ống falcon trên máy lắc với tốc độ 150 vòng/phút trong khoảng 15 đến 25 ngày, cần lưu ý không để dung dịch chạm vào nắp ống và tránh tiếp xúc với ánh sáng.
- Chuẩn bị các đĩa môi trường MHA cho các dòng vi khuẩn chỉ thị;
- Chuẩn bị các dòng vi khuẩn chỉ thị:
Nhân nuôi các dòng vi khuẩn chỉ thị trên môi trường thích hợp (trong 24 - 48 giờ) để thu sinh khối;
Pha hỗn hợp dung dịch McFarland 0,5 theo chuẩn NCCLS (1997) bằng công thức 99,5 ml H2SO4 1% + 0,5 ml BaCl2 1%;
Để lấy sinh khối vi khuẩn, cho vào ống nghiệm 10ml nước muối sinh lý đã khử trùng, lắc đều và đo độ đục Độ đục của ống nghiệm chứa vi khuẩn chỉ thị phải tương đương với độ đục của hỗn hợp McFarland 0,5 ở bước sóng 625nm Nồng độ vi khuẩn kiểm định trung bình đạt khoảng 1,8x10^8 CFU/ml, trong khi nồng độ nấm men Candida albicans là khoảng 1,8x10^6 (NCCLS, 1997).
Pha loãng tiếp tục vi khuẩn 100 lần để được nồng độ vi khuẩn là 10 6 CFU/ml, riêng dòng chỉ thị Candida albicans không pha loãng
Mỗi dòng vi khuẩn chỉ thị yêu cầu sử dụng các loại kháng sinh khác nhau; trong đó, Streptomycin được áp dụng cho dòng Bacillus cereus, trong khi Tetracyclin được sử dụng cho các dòng chỉ thị còn lại.
Cân và pha loãng kháng sinh với nước cất (đã khử trùng) sao cho nồng độ là 30μg/ml đối với Streptomycin và Tetracyclin
Tiến hành trải các vi khuẩn chỉ thị với nồng độ phù hợp lên các môi trường thích hợp bằng tăm bông vô trùng và để các đĩa này phơi trong khoảng 10 phút.
- Khoan lỗ tạo giếng thạch các đĩa đã trãi vi khuẩn chỉ thị;
(Lưu ý: Giếng thạch có đường kính 6mm, sâu khoảng 3mm; mỗi đĩa 4 – 5 giếng thạch);
- Hút 1ml dung dịch nuôi trong ống falcon cho vào tube 2,2ml đã vô trùng;
- Ly tâm ở 12.000 vòng/phút trong 15 phút;
- Lọc bỏ phần cặn, lấy phần dịch trích trong cho vào tube mới;
Hút 50μl dung dịch từ ống nghiệm và nhỏ vào giếng đã được khoan sẵn trên môi trường có các dòng vi khuẩn chỉ thị; mỗi dòng vi khuẩn sợi được lặp lại từ 2 đến 3 lần.
- Hút 50μl kháng sinh đã pha loãng nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng dương;
- Hút 50μl nước cất (đã khử trùng) nhỏ vào giếng thạch làm đối chứng âm;
Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn sợi được thực hiện thông qua sự hiện diện của vòng kháng khuẩn (halo) xung quanh các giếng thạch chứa dịch lọc của các dòng vi khuẩn sợi kiểm định Các kết quả này được đối chứng với vòng halo quanh giếng được chọn làm đối chứng dương.
- Chọn các dòng có khả năng kháng khuẩn (thông qua vòng halo) để tiến hành đánh giá
3.3.6.2 Tiêu chí đ ánh giá kh ả n ă ng kháng khu ẩ n ( Monks et al., 2002)
- Quan sát khả năng kháng khuẩn của từng dòng vi khuẩn sợi thông qua sự hiện diện vòng kháng khuẩn (halo)
- So sánh tuyển chọn dòng vi khuẩn sợi tiềm năng thông qua đường kính halo và khả năng kháng được nhiều chủng vi khuẩn gây bệnh
Đường kính vòng vô khuẩn được tính theo công thức d = d1 – d2, trong đó d là đường kính vòng vô khuẩn, d1 là đường kính tổng vòng vô khuẩn, và d2 là đường kính khối thạch hoặc giếng thạch Ngoài ra, có nhiều quy ước khác nhau để đánh giá khả năng kháng khuẩn.
- Nghiên cứu này đánh giá khả năng kháng khuẩn dựa vào quy ước của Monks et al., (2002) được trình bày cụ thể ở bảng dưới đây:
Bảng 3: Phân loại hoạt tính kháng khẩn (Monks et al., 2002)
Mức độ hoạt tính Đường kính vòng vô khuẩn Kí hiệu
Không có hoạt tính Nhỏ hơn 7 mm -
Hoạt tính yếu Từ 7 – 11 mm +
Hoạt tính vừa Từ 11 – 16 mm ++
Hoạt tính cao Trên 16 mm +++
