Vi sinh vật sống trong đất vùng rễ thúc đẩy sự phát triển của thực vật, đặc biệt là vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân hay kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng và sản xuất chất kích thích tố tăng trưởng như là cytokinin, auxin và gibberellin giúp bộ rễ thực vật hấp thu tốt nước, muối khoáng và các chất dinh dưỡng. Dựa vào những ưu điểm trên, 28 dòng vi khuẩn Pseudomonas sp. được phân lập từ tám mẫu đất vùng rễ lúa thu thập được từ các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Vĩnh Long, Cần Thơ trên môi trường Pseudomonas isolation agar. Tất cả các dòng vi khuẩn này đều có khả năng tổng hợp IAA tăng dần theo thời gian và đạt cao nhất vào ngày thứ 8 sau khi nuôi. Trong số đó, dòng AG 2a và CT 2a có khả năng tổng hợp IAA cao nhất, sản xuất được 3,18 mgL IAA và 3,27 mgL IAA đo theo phương pháp thuốc thử Salkowski và acid giberrelic (GA3) đạt 550,24 mglít ở dòng AG 2a và 419 mglít ở dòng CT 2a theo phương pháp sắc ký sau 8 ngày nuôi. Chất kích thích tố tăng trưởng tạo ra từ dòng AG 2a và CT 2a thúc đẩy sự phát triển của rễ, lông hút, số lượng rễ, chiều dài rễ cây lúa nhiều hơn khác biệt với nghiệm thức đối chứng (không chủng dịch vi khuẩn). Giải trình tự 2 dòng AG 2a và CT 2a với cặp mồi 8F và 1492R, so sánh kết quả trên NCBI đồng hình với Pseudomonas sp. dòng YT3 và Pseudomonas putida dòng AKMP7 tỉ lệ 99%.
GIỚI THIỆU
Vùng rễ là khu vực quan trọng giữa rễ thực vật và đất, nơi tích tụ các chất hữu cơ và là môi trường sống cho nhiều vi sinh vật đất Trong vùng rễ, vi khuẩn có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và kiểm soát vi sinh vật gây bệnh cho cây Chúng cũng tổng hợp và phóng thích các hợp chất sinh học như cytokinin, auxin và gibberellin, giúp rễ phát triển và hấp thu dinh dưỡng hiệu quả hơn Nhóm vi khuẩn này được gọi là vi khuẩn vùng rễ kích thích tăng trưởng thực vật, và có thể được ứng dụng trong các loại phân sinh học để hỗ trợ cây trồng.
Đồng Bằng Sông Cửu Long, với hơn 4 triệu hecta đất canh tác, là vùng sản xuất nông nghiệp chủ lực cho tiêu thụ trong nước và xuất khẩu Tuy nhiên, việc lạm dụng phân hóa học đã dẫn đến giảm chất hữu cơ, bạc màu đất và ô nhiễm nguồn nước, ảnh hưởng đến sức khỏe con người Do đó, việc tìm kiếm nguồn phân bón vi sinh vật có khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp kích thích tố tăng trưởng thực vật là rất cần thiết Ứng dụng vi sinh vật có hoạt tính sinh học cao để sản xuất phân vi sinh dạng nước hoặc dạng viên nhằm thay thế một phần phân hóa học sẽ hướng tới nền nông nghiệp sạch và bền vững Đề tài “Phân lập một số dòng Pseudomonas trong vùng rễ có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng và ứng dụng trên cây lúa” được thực hiện nhằm tìm ra những dòng vi khuẩn có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng cao, phục vụ cho sản xuất nông nghiệp.
Phân lập một số dòng Pseudomonas sp
Một số dòng Pseudomonas sp đã được tuyển chọn với khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng cao Việc định danh Pseudomonas sp cho phép đánh giá hiệu quả của vi khuẩn này khi kết hợp với phân vi sinh DASVILA và phân hữu cơ vi sinh DASVILA ++ trên cây lúa cao sản.
OM 6976 và tìm ra nghiệm thức tối ƣu trong canh tác lúa.
LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU
Vùng rễ và vi khuẩn vùng rễ
Vùng rễ là khu vực tiếp xúc giữa rễ thực vật và đất, nơi tích tụ các chất hữu cơ và là nguồn sống cho vi sinh vật đất Thực vật có khả năng điều chỉnh vùng rễ của mình thông qua việc hấp thu dinh dưỡng, độ ẩm và oxy, cùng với các chất do rễ tiết ra.
Dịch rễ có tỉ lệ C/N cao, điều này giúp tăng cường sự phong phú của vi khuẩn cố định đạm trong vùng rễ (Dửbereiner, 1974) Ngược lại, vi sinh vật trong vùng rễ có thể tác động đến sự sinh trưởng của cây thông qua việc ảnh hưởng đến giá trị dinh dưỡng, sự phát triển và hình thái của rễ (Rovira et al., 1983; Harari et al., 1988).
Vi khuẩn vùng rễ có vai trò quan trọng trong việc tăng cường hấp thu dinh dưỡng và chuyển hóa chất cho cây non (Rovira et al., 1983) Cụ thể, Azospirillum brasilense đã chứng minh khả năng thúc đẩy sự phát triển của lông rễ và làm giảm sự kéo dài của rễ ở cây Panicum miliaceum.
(Harari et al., 1988) Azospirillum trong vùng rễ của cỏ Kallar (Leptochloa fusca)
Các vi khuẩn xâm nhập vào nhu mô rễ không chỉ có khả năng cố định đạm mà còn hòa tan lân khó tan và các chất dinh dưỡng khác (Reinhold et al., 1986; Seshadri et al., 2000; Richardson, 2003) Chúng cũng sản xuất kích thích tố thực vật (Vande Broek et al., 1999) và giúp kiểm soát các vi sinh vật gây bệnh cho cây trồng (Rangarajan et al.).
Vi khuẩn nốt rễ sống trong rễ lúa có khả năng tăng cường hấp thu các chất dinh dưỡng như nitơ, lân, kali và sắt từ 10 – 64% (Biswas et al., 2000) Nghiên cứu của Chaintreuil et al (2000) đã phát hiện vi khuẩn nốt rễ trong rễ lúa hoang (Oryza breviligulata) tại Châu Phi, có nguồn gốc từ cây điên điển (Sesbania sp.) mọc xen kẽ với lúa hoang.
Vi khuẩn nốt rễ không chỉ tồn tại nội sinh trong cây họ đậu mà còn xâm nhập vào các cây hòa bản, đồng thời thực hiện quá trình cố định đạm sinh học cho cây.
Các nhóm vi khuẩn có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng
Pseudomonas là vi khuẩn gram âm, có hình dạng que với kích thước dài từ 1-3 µm và rộng từ 0,5-0,8 µm Chúng có chiến mao ở cực và khả năng di chuyển tốt trong môi trường nước, nhưng không tạo nội bào tử Pseudomonas sống tự do và hiện diện rộng rãi trong đất, nước, trên động vật và thực vật; một số loại có thể gây hư hỏng thực phẩm và thối trứng Chúng có khả năng hô hấp hiếu khí hoặc kỵ khí trong điều kiện thiếu oxy.
Nhiệt độ phát triển tốt nhất của Pseudomonas là từ 30 o C đến 37 o C, tuy nhiên một số chủng Pseudomonas lại có khả năng phát triển ở nhiệt độ cao khoảng 42 o C
Pseudomonas có khả năng phát triển trong môi trường nuôi cấy đơn giản với nhu cầu dinh dưỡng không phức tạp Loại vi khuẩn này phát triển tốt nhất ở pH trung tính Đặc biệt, một số chủng Pseudomonas có khả năng phát quang dưới ánh sáng tia cực tím ở bước sóng 254 nm.
Một số chủng Pseudomonas đóng vai trò quan trọng trong sự sinh trưởng và phát triển của thực vật bằng cách tổng hợp các chất kích thích tăng trưởng như IAA và cytokinin, giúp kích thích bộ rễ và tăng cường khả năng hấp thu dinh dưỡng Chúng cũng có khả năng hòa tan lân khó tan thành dạng dễ hấp thu cho cây và kháng lại một số vi sinh vật gây hại trong đất.
Một số chi Pseudomonas nổi bật với khả năng chuyển hóa các hợp chất hóa học như hydrocarbon thơm, acid béo, thuốc trừ sâu và các chất ô nhiễm môi trường, khiến chúng trở thành các tác nhân hữu ích trong xử lý môi trường Chẳng hạn, Pseudomonas alcaligenes có khả năng phân giải hydrocarbon đa vòng, Pseudomonas mendocina có thể phân giải toluene, và Pseudomonas pseudoalcaligenes sử dụng cyanide làm nguồn cung cấp nitơ.
Pseudomonas resinovorans có thể phân hủy carbazole và Pseudomonas veronii đƣợc dùng để phân giải các hợp chất thơm khác nhau
Acid gibberellic (GA3) là sản phẩm chính sản xuất gibberellin ở nấm và vi khuẩn Pseudomonas sp được ủ trong môi trường dinh dưỡng ở các thời điểm 12, 24,
36, 48, 72, 78, 80 giờ tại 30 o C, lắc ở tốc độ 150 vòng/phút Sau khi ủ, vi khuẩn phát triển và xác định được lượng GA3 sản xuất ra bằng phương pháp sắc ký Ở nhiệt độ
30 0 C, pH = 7, tốc độ lắc 150 vòng/phút lƣợng GA3 tạo ra cao nhất 252,1mg/lít sau 72h nuôi (KARAKO, 2005)
Năm 1923, Beijerinck đã phân lập một nhóm vi khuẩn giống như xoắn khuẩn, và phát hiện này được Becking xác nhận lại vào năm 1963 Đến năm 1976, Dửbereiner và Day đã mô tả sự liên hợp của các vi khuẩn này với cây cỏ và nhiều loại ngũ cốc khác nhau.
Vai trò của chất kích thích tố tăng trưởng
Azospirillum là một nhóm vi khuẩn gram âm có hình dạng que ngắn, kích thước từ 0,8-1,7μm chiều rộng và 1,4-3,7μm chiều dài Chúng có sự phân bố sinh thái rộng lớn, gắn liền với đa dạng cây trồng Năm 1984-1985, nhiều loài Azospirillum đã được phát hiện trong vùng rễ của cỏ Kallar, với khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan và sản xuất hormone thực vật Nghiên cứu cho thấy, khi sử dụng Azospirillum, sản lượng cây trồng có thể tăng từ 5-30% so với việc sử dụng phân bón hóa học, nhờ vào sự phát triển tốt hơn của hệ thống rễ và khả năng hấp thu nước, khoáng chất.
Theo nghiên cứu của Bottini (1988), A.diazotrophicus có khả năng sản xuất từ 1,6 đến 11,9 ng GA3/ml trong môi trường nuôi chứa 10% sucrose Đồng thời, vi khuẩn này cũng tạo ra 32 ng IAA/ml trong môi trường có 15% sucrose và 21 ng IAA/ml trong môi trường tương tự.
2.3 Vai trò của chất kích thích sinh trưởng
Indole-3-acetic acid (IAA), hay còn gọi là auxin, là chất điều hòa chính trong sự sinh trưởng của thực vật, có vai trò quan trọng trong việc điều chỉnh sự phân chia và giãn dài tế bào, phân hóa sinh mô, cũng như phát triển trái và hạt, ảnh hưởng đến giai đoạn đầu của sự phát triển cây trồng (Davies, 2004) Tác động của auxin phụ thuộc vào loại tế bào và nồng độ; ở các nồng độ khác nhau, IAA có thể kích thích sự giãn dài của trục lá mầm, đồng thời ngăn cản sự sinh trưởng của rễ chính, kích thích sự hình thành rễ bên và lông rễ (Theologis và Ray, 1982; Gray et al., 2001).
Theo nghiên cứu của Sergeeva et al (2002), nhiều nhóm vi khuẩn, bao gồm vi khuẩn đất, vi khuẩn biểu sinh, vi khuẩn nội sinh và một số Cyanobacteria, có khả năng tổng hợp indole-3-acid acetic từ L-tryptophan (Trp) Trong số đó, một số loài như Pseudomonas savastanoi và Agrobacterium tumefaciens liên quan đến bệnh thực vật, trong khi các loài khác có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của cây trồng (Patten và Glick, 1996) Các giống vi khuẩn như Azospirillum, Gluconacetobacter và Pseudomonas, không chỉ có khả năng cố định đạm mà còn sản xuất auxin, do đó được xem là vi khuẩn vùng rễ kích thích sinh trưởng thực vật (PGPR), góp phần nâng cao năng suất cây trồng (Kloepper et al., 1989) Koga et al (1991) đã mô tả ba lộ trình chính trong quá trình chuyển đổi L-tryptophan thành IAA.
Lộ trình indole-3-pyruvic acid
Tryptophan indole-3-pyruvic acid indole-3-acetaldehyde IAA
Tryptophan tryptamine indole-3-acetaldehyde IAA
Nghiên cứu của Koga et al (1991) về quá trình sinh tổng hợp IAA từ tryptophan ở vi khuẩn Enterobacter cloacae cho thấy rằng trong điều kiện có oxy, 50-90% IAA được tạo ra chủ yếu qua lộ trình indole-3-pyruvic acid Ngược lại, trong điều kiện có chất khử, các chất trung gian như indole-3-pyruvic acid và indole-3-acetaldehyde bị chuyển hóa thành indole-3-lactic acid và tryptophol, dẫn đến sự giảm hàm lượng IAA Do đó, indole-3-lactic acid và tryptophol có thể là những sản phẩm tích lũy quan trọng trong việc điều hòa sinh tổng hợp IAA.
Hình 1: Sơ đồ của lộ trình sinh tổng hợp IAA ở Enterobacter cloacae
Carrenõ-López et al (2000) cũng nhận thấy trong các lộ trình tổng hợp IAA ở loài
Azospirillum brasilense primarily synthesizes indole-3-acetic acid (IAA) from the precursor tryptophan through the indole-3-pyruvic acid pathway This process is mainly catalyzed by the enzyme indole pyruvic decarboxylase, as noted by Costacurta et al (1994) Thus, the indole-3-pyruvic acid pathway is essential for IAA production in this bacterium.
Cytokinin, một nhóm hormone thực vật quan trọng, được phát hiện lần đầu tiên thông qua kỹ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật, với kinetin (6-furfuryl-aminopurin) là hợp chất chính được chiết xuất từ tinh dịch cá thu Zeatin, cytokinin tự nhiên đầu tiên được tách từ hạt ngô, có hoạt tính tương tự kinetin Các nghiên cứu cho thấy cytokinin có mặt trong tất cả các loại thực vật, với ba loại phổ biến nhất là kinetin, 6-benzyl-aminopurin và nhiều loại khác được tìm thấy trong các bộ phận sinh trưởng của cây Cytokinin chủ yếu được hình thành trong hệ thống rễ và cũng có thể được tổng hợp ở các cơ quan đang phát triển như chồi, lá non và quả non Kinetin cũng được phát hiện nhiều trong nước dừa Khác với auxin, cytokinin được vận chuyển không phân cực trong cây, có thể di chuyển theo cả hai hướng từ ngọn đến gốc Trong cây, cytokinin có thể tồn tại ở dạng tự do hoặc liên kết và bị phân giải bởi enzyme thành urê Các cytokinin tổng hợp như kinetin và benzyladenin được ứng dụng trong kỹ thuật nuôi cấy mô.
+ Vai trò sinh lý của Cytokinin
Cytokinin đóng vai trò quan trọng trong việc kích thích sự phân chia tế bào mạnh mẽ, được coi là chất kích hoạt quá trình này Chúng hoạt hóa mạnh mẽ quá trình tổng hợp acid nucleic và protein, từ đó thúc đẩy sự phân chia tế bào hiệu quả.
Cytokinin có vai trò quan trọng trong sự hình thành và phân hóa cơ quan của thực vật, đặc biệt là sự phân hóa chồi Sự cân bằng giữa auxin (phân hóa rễ) và cytokinin (phân hóa chồi) quyết định quá trình phát sinh hình thái của mô nuôi cấy in vitro và cây nguyên vẹn Tỷ lệ auxin cao hơn cytokinin kích thích ra rễ, trong khi tỷ lệ cytokinin cao hơn auxin kích thích ra chồi Để tăng hệ số nhân giống, nồng độ cytokinin thường được tăng trong môi trường nuôi cấy ở giai đoạn tạo chồi Rễ là cơ quan tổng hợp cytokinin chủ yếu, do đó, sự phát triển mạnh của rễ sẽ kích thích sự hình thành chồi trên mặt đất Cytokinin còn có khả năng kìm hãm quá trình già hóa của các cơ quan và cây, giúp duy trì hàm lượng protein và chlorophin trong lá lâu hơn Khi cành dâm ra rễ, rễ sẽ tổng hợp cytokinin nội sinh, kéo dài thời gian sống của lá Hàm lượng cytokinin cao giúp lá xanh lâu hơn nhờ tăng cường quá trình vận chuyển chất dinh dưỡng Sự sinh trưởng tốt của bộ rễ làm cho cây trẻ và phát triển mạnh, trong khi tổn thương rễ sẽ khiến các cơ quan trên mặt đất nhanh chóng già Ngoài ra, cytokinin còn ảnh hưởng đến sự nảy mầm của hạt và củ, giúp phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng.
Cytokinin có vai trò quan trọng trong việc tương tác với auxin, giúp làm giảm hiện tượng ưu thế ngọn và thúc đẩy sự phân cành Ngoài ra, cytokinin còn ảnh hưởng đến các quá trình trao đổi chất của cây, bao gồm tổng hợp axit nucleic, protein và chlorophin, từ đó tác động đến các quá trình sinh lý của cây.
+ Cơ chế tác dụng của cytokinin
Cytokinin chủ yếu kích thích tổng hợp DNA và RNA trong tế bào, ảnh hưởng đến quá trình sinh tổng hợp protein cần thiết cho sự phân chia và sinh trưởng tế bào Hiệu quả của cytokinin trong việc ngăn chặn sự già hóa liên quan đến khả năng ngăn chặn phân hủy protein, axit nucleic và chlorophyll hơn là kích thích tổng hợp chúng Cytokinin có thể ngăn chặn tổng hợp mRNA, điều này ảnh hưởng đến sự tổng hợp các enzyme thủy phân.
Gibberellin là nhóm hormone tăng trưởng được phát hiện sau auxin, có nguồn gốc từ nghiên cứu bệnh lý "bệnh lúa von" do nấm Fusarium moniliforme gây ra trên cây lúa Từ nghiên cứu này, hai chất tinh thể được tách ra từ nấm lúa von, gọi là gibberellin A và B, mặc dù bản chất hóa học của chúng vẫn chưa được xác định.
Năm 1955, hai nhóm nghiên cứu của Anh và Mỹ phát hiện axit gibberellic trong cây lúa bị bệnh lúa von và xác định công thức hóa học của nó là C19H22O6 Đến năm 1956, gibberellin được tách ra từ thực vật bậc cao và được xác nhận là hormone tăng trưởng tồn tại trong các bộ phận của cây, với hơn 50 loại gibberellin được phát hiện, ký hiệu từ A1 đến A52, trong đó gibberellin A3 (GA3) là loại có tác dụng sinh lý mạnh nhất Gibberellin có mặt ở nhiều nguồn khác nhau, bao gồm nấm, thực vật bậc thấp và bậc cao, và được tổng hợp trong các bộ phận đang phát triển như phôi, lá non, rễ non và quả non, chủ yếu trong lục lạp Gibberellin vận chuyển không phân cực, có thể hướng lên hoặc hướng xuống tùy thuộc vào vị trí sử dụng, với tốc độ từ 5-25 mm trong 12 giờ qua hệ thống mạch dẫn Trong cây, gibberellin tồn tại dưới dạng tự do và dạng liên kết như auxin, có khả năng liên kết với glucose và protein.
+ Vai trò sinh lý của gibberellin
Gibberellin là hormone thực vật có tác dụng mạnh mẽ trong việc kích thích sự sinh trưởng của cây, đặc biệt là làm tăng chiều dài thân và lóng Hiệu quả này xảy ra do gibberellin kích thích pha giãn của tế bào theo chiều dọc, từ đó làm tăng nhanh sự sinh trưởng dinh dưỡng và sinh khối của cây Dưới tác động của gibberellin, nhiều loại cây như đậu xanh và đậu tương có thể cao gấp 2-3 lần so với bình thường Ngoài việc thúc đẩy sự sinh trưởng, gibberellin còn kích thích sự phân chia tế bào và hỗ trợ quá trình nảy mầm của hạt và củ, giúp phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của chúng Hàm lượng gibberellin thường gia tăng khi cây bắt đầu nảy chồi hoặc khi hạt nảy mầm, đồng thời kích thích sự tổng hợp và hoạt tính của các enzyme như amilase, protease và photphatase, qua đó thúc đẩy quá trình phân hủy tinh bột thành đường Việc xử lý gibberellin ngoại sinh có thể giúp phá bỏ trạng thái ngủ nghỉ của hạt, củ và căn hành, kể cả trong trường hợp ngủ nghỉ sâu.
Gibberellin có khả năng kích thích sự ra hoa rõ rệt, đồng thời thúc đẩy sự sinh trưởng nhanh chóng và kéo dài của cụm hoa Đặc biệt, gibberellin có thể kích thích cây ra hoa trong điều kiện ngày ngắn, giúp tăng cường hiệu quả sinh trưởng của cây trồng.
Ứng dụng trên cây trồng
Trong thế kỷ 20, việc sử dụng phân bón, đặc biệt là nitơ, gia tăng trên toàn cầu nhằm nâng cao năng suất cây trồng, đặc biệt ở các nước đang phát triển với chương trình “chiến dịch xanh” Đến năm 1960, các chiến dịch bảo vệ hệ sinh thái đã mở rộng sang các nước nghèo, dẫn đến sự phát triển của các phương pháp thân thiện với môi trường, trong đó vi khuẩn cố định đạm được sử dụng để cải thiện năng suất Các vi sinh vật như Pseudomonas, Bacillus, Azotobacter, và Azospirillum, được gọi là vi sinh vật vùng rễ (PGPR), đóng vai trò quan trọng trong việc thúc đẩy sự phát triển của cây trồng thông qua nhiều cơ chế khác nhau Chúng không chỉ cố định đạm bằng enzyme nitrogenase mà còn sản xuất siderophore và kích thích tố tăng trưởng, giúp cây hấp thu nước và muối khoáng tốt hơn Mặc dù các cơ chế của PGPR chưa giải thích đầy đủ sự tổng hợp các kích thích tố sinh trưởng như gibberellin, nhưng nghiên cứu cho thấy gibberellin do Azospirillum sp và Bacillus sp sản xuất có thể tăng cường khả năng hấp thu đạm, đặc biệt khi ủ với hạt, từ đó thúc đẩy sự phát triển của rễ ở cây lúa mì.
Các nhóm vi khuẩn như Azotobacter spp và Azospirillum có khả năng tổng hợp IAA, giúp cây lúa mạch tăng chiều cao và sinh khối Đặc biệt, Azotobacter chroococcum sản xuất auxin, khi được bón vào đất, không chỉ thúc đẩy sự phát triển của cây bắp mà còn làm tăng năng suất hạt và cải thiện độ giàu nitơ của đất Việc sử dụng các vi khuẩn như Azotobacter, Azospirillum và Acetobacter mang lại lợi ích đáng kể cho sự phát triển cây trồng.
Bacillus và Pseudomonas là hai loại vi khuẩn giúp cây lúa nước phát triển mạnh mẽ và nâng cao năng suất nhờ vào khả năng tổng hợp IAA, kích thích sự phát triển của rễ lúa, từ đó cải thiện khả năng hấp thụ nước và dinh dưỡng Việc ứng dụng vi khuẩn tổng hợp IAA như một loại phân sinh học cho các cây trồng như lúa gạo, lúa mì, bắp lai, đậu nành và mía đường đã được Okon và Labandera–Gonzalez (1994) chứng minh là hiệu quả trong việc tăng năng suất và chất lượng sản phẩm Nhiều công ty hiện nay đã thành công trong việc áp dụng phân vi sinh có khả năng tổng hợp hormone tăng trưởng thực vật dưới dạng phân phức hợp hữu cơ vi sinh Fitohoocmon (Lê Văn Tri, 2000).
Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction)
Phản ứng chuỗi polymerase (PCR) là một phương pháp cho phép thu thập hàng triệu đoạn DNA đồng nhất từ một hỗn hợp phức tạp, bao gồm RNA, protein, polysaccharide, và cả DNA không có chức năng lẫn DNA có chức năng di truyền.
PCR là kỹ thuật xử lý in vitro các chuỗi DNA bằng cách phát triển primer trên các dây đơn DNA Quá trình này bao gồm biến tính DNA, sự tác động của primer và sự phát triển của chúng nhờ phản ứng DNA polymerase, enzyme chịu trách nhiệm tổng hợp DNA Trong điều kiện thích hợp, quá trình tổng hợp DNA có thể diễn ra in vitro Ứng dụng đầu tiên của sinh tổng hợp DNA in vitro bao gồm tạo chuỗi mã DNA qua phương pháp Sanger và phương pháp giải mã DNA đánh dấu, tất cả đều nằm trong giai đoạn 1 của sinh tổng hợp DNA.
Sự phát minh của máy thermalcycler đã cách mạng hóa quy trình PCR bằng cách cho phép thay đổi nhiệt độ định kỳ theo thời gian nhất định Máy này tự động hóa chu trình nhiệt, giúp nâng cao hiệu quả và độ chính xác trong các thí nghiệm sinh học phân tử.
2.5.1 Nguyên lí chung của phương pháp PCR
PCR là một chuỗi phản ứng liên tục, gồm nhiều chu kỳ kế tiếp nhau, mỗi chu kỳ gồm ba giai đoạn (Khuất Hữu Thanh, 2006):
Trong giai đoạn biến tính, nhiệt độ cao từ 90 đến 95 độ C sẽ làm đứt các liên kết hydro giữa các phân tử DNA, dẫn đến việc hai mạch DNA tách rời Đặc điểm của đoạn DNA khuôn, như độ dài của các nucleotide giống nhau và tỷ lệ G-C, ảnh hưởng đến nhiệt độ biến tính (Tm), với tỷ lệ G-C cao hơn thường có Tm cao hơn Do đó, việc lựa chọn nhiệt độ biến tính phù hợp cần căn cứ vào đặc điểm của DNA khuôn và quá trình này thường kéo dài từ 1 đến 2 phút.
- Giai đoạn gắn mồi: ở nhiệt độ khoảng 55 – 65 o C để các mồi bắt cặp với các mạch đơn DNA khuôn ở các đầu 3 ’ theo nguyên lí Chargaff Giai đoạn này khoảng 30
Giai đoạn tổng hợp DNA diễn ra ở nhiệt độ 70 – 72 o C, điều kiện lý tưởng cho enzyme DNA polymerase hoạt động Enzyme này xúc tác quá trình gắn thêm nucleotide vào đầu đoạn mồi, kéo dài các đoạn mồi dựa trên nguyên tắc bắt cặp với mạch khuôn theo nguyên lý Chargaff, từ đó tạo ra các mạch đơn DNA mới Giai đoạn này còn được gọi là giai đoạn polymer hóa và thời gian thực hiện có thể từ 30 giây đến vài chục phút, tùy thuộc vào kích thước của đoạn DNA.
Chu kỳ PCR bao gồm ba bước sẽ được lặp lại từ 25 đến 40 lần, tùy thuộc vào ứng dụng cụ thể Quy trình kết thúc bằng một bước "extension" ở nhiệt độ 72 độ C trong 5 phút Sau đó, sản phẩm PCR được bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc 4 độ C, tùy vào loại máy Thermal cycler sử dụng.
Phản ứng PCR bao gồm nhiều chu kỳ liên tục, trong đó sản phẩm của chu kỳ trước được sử dụng làm khuôn cho chu kỳ sau, dẫn đến sự gia tăng số lượng bản sao theo cấp số nhân Thông thường, một phản ứng PCR thực hiện từ 20 đến 40 chu kỳ, cho phép tạo ra từ 2^20 đến 2^40 bản sao DNA từ mỗi đoạn DNA khuôn Trong quá trình này, cần chú ý rằng ở các chu kỳ sau, lượng khuôn tăng lên trong khi lượng mồi và dNTP tự do giảm, và hoạt động của enzyme DNA polymerase cũng yếu dần Do đó, việc tính toán hàm lượng mồi, dNTP và enzyme là rất quan trọng để đảm bảo phản ứng PCR đạt kết quả tốt nhất.
2.5.2 Mồi (primer) sử dụng trong PCR
Primer là các đoạn oligonucleotide ngắn từ 14 đến 15 nucleotide, đóng vai trò quan trọng trong việc đảm bảo thành công của phản ứng PCR Trong quá trình PCR, một cặp mồi bao gồm mồi xuôi (F) và mồi ngược (R) là cần thiết để khởi đầu quá trình nhân bản DNA.
- Mồi xuôi (sense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 5’3’
- Mồi ngƣợc (antisense primer): bắt cặp và gắn ở đầu 3’ của mạch khuôn 3’ 5’ Điều kiện chủ yếu của bảo đảm hiệu quả mồi là:
Khi thiết kế mồi cho phản ứng PCR, cần chú ý rằng độ dài của mồi không nên quá ngắn (dưới 8 nucleotide) hoặc quá dài (trên 50 nucleotide) Mồi quá ngắn có thể dẫn đến kết quả PCR không chính xác, trong khi mồi quá dài sẽ làm giảm khả năng thành công của phản ứng Để đảm bảo đoạn DNA được nhân lên có trình tự nguyên vẹn, nên để thừa 1 - 3 nucleotide ở đầu 5' của mồi.
Mồi có tính đặc hiệu cao, chỉ có khả năng bắt cặp với đầu 3’ của mạch khuôn Điều này có nghĩa là các mồi không thể bắt cặp với nhau hoặc bắt cặp ở giữa mạch khuôn.
- Nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các mồi không đƣợc chênh lệch nhau quá lớn
Khoảng cách tiến hóa giữa hai loài được xác định qua sự khác biệt trong nucleotide hoặc acid amin của các phân tử tương đồng Số lượng khác biệt trong chuỗi phân tử là một tỷ lệ cố định trong mã di truyền của DNA Việc chọn rRNA 16S hoặc 16S-23S để phân loại và xác định sự tiến hóa là rất quan trọng.
- Nó tham gia trong quá trình tổng hợp protein nên RNA của ribô thể đƣợc chọn để nghiên cứu mối liên hệ tiến hóa trong sinh vật
- RNA của ribô thể là những phân tử cổ điển, chức năng cố định, đồng nhất và đặc trung cho các loài
- RNA của ribô thể phân phối phổ biến trong tất cả các loài
- Kích thước của nó vừa phải, thuận lợi cho việc xếp hàng (align) để so sánh các chuỗi
Sự ổn định của chuỗi rRNA đã thúc đẩy sự phát triển các mẫu dò DNA nhằm nhận diện vi khuẩn Những mẫu dò này giúp hình dung các thành phần chuyên biệt trong bộ gen DNA vi khuẩn thông qua phương pháp điện di Kết quả từ khuôn giới hạn gen rRNA được sử dụng để phân biệt các loài và dòng dưới chi, trở thành công cụ hữu hiệu trong việc nhận diện vi khuẩn với phạm vi rộng.
Trong mỗi ribô thể có 3 phân tử RNA với loài sơ hạch có 5S, 16S và 23S trong đó 16S có khoảng 1500 nucleotide và 23S có khoảng 2900 nucleotide 5S chứa khoảng
120 nucleotide (quá nhỏ) nên ít đƣợc nghiên cứu, 16S và 23S đƣợc nghiên cứu nhiều hơn, ở loài chân hạch dùng 18S để nghiên cứu
Chuỗi trình tự 16S rRNA là công cụ hiệu quả để đánh giá sự đa dạng di truyền của vi khuẩn trong các mẫu môi trường (Barker et al., 2003).
Điện di gel agarose
2.6.1 Nguyên tắc của kỹ thuật điện di
Các acid nucleic có cấu trúc đặc trưng với các đại phân tử mang điện tích âm phân bố đồng đều trên bề mặt Khi chịu tác động của một điện trường, chúng sẽ di chuyển về phía cực dương của điện trường (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
Sau khi thực hiện phản ứng PCR, DNA vi khuẩn được nhuộm bằng Ethidium bromide (EtBr), một chất có khả năng gắn vào giữa các base của acid nucleic và phát huỳnh quang dưới ánh sáng tia tử ngoại Sản phẩm được điện di trên gel agarose và quan sát kết quả dưới tia UV với bước sóng 260nm.
Thang DNA, hay còn gọi là thang DNA ladder, là một yếu tố quan trọng để xác định kích thước các trình tự axit nucleic trong gel agarose Nó bao gồm nhiều trình tự DNA với kích thước đã được biết đến, giúp ước lượng chính xác trọng lượng phân tử của các mẫu DNA (Hồ Huỳnh Thùy Dương, 2002).
2.6.2 Các kỹ thuật điện di chủ yếu a Điện di trên gel agarose
Kỹ thuật điện di DNA sử dụng gel agarose với nồng độ từ 0,3 - 2,0% tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA Đối với DNA nhỏ hơn 1kb, nồng độ agarose khoảng 1 - 2% được khuyến nghị, trong khi các phòng thí nghiệm thường sử dụng nồng độ khoảng 0,7 - 0,8% Bên cạnh đó, điện di trên gel polyacrylamide cũng là một phương pháp phổ biến trong phân tích DNA.
Kỹ thuật điện di là phương pháp dùng để kiểm tra DNA hoặc protein, sử dụng bản gel polyacrylamide với nồng độ từ 3,5% đến 20%, tùy thuộc vào kích thước đoạn DNA hoặc trọng lượng phân tử protein Khi kích thước gel nhỏ hơn, cần sử dụng hàm lượng polyacrylamide lớn hơn cho protein có khối lượng phân tử nhỏ, và ngược lại.
Kỹ thuật điện di sử dụng giấy thấm Whatman 3 MM làm cầu nối giữa hai điện cực trong buồng điện di, cho phép các đại phân tử tích điện di chuyển trên giấy với tốc độ khác nhau tùy thuộc vào kích thước và trọng lượng của chúng Phương pháp này cũng được áp dụng trong điện di trên gel tinh bột.
Tinh bột biến tính đƣợc sử dụng làm bản gel dùng trong điện di trong các nghiên cứu protein, enzyme và izoenzyme
Phương pháp giải trình tự DNA
2.7.1 Giải trình tự gen theo phương pháp dideoxy
Nguyên tắc cơ bản của quá trình tổng hợp DNA dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase Enzyme này xúc tác việc gắn kết các nucleotid, nhưng quá trình tổng hợp sẽ dừng lại khi không có nhóm 3’OH Kết quả là hình thành các đoạn oligonucleotid với độ dài khác nhau, chênh lệch một nucleotid.
Thực hiện bốn phản ứng trong các ống Eppendorf, mỗi ống chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP với một loại được đánh dấu phóng xạ (S 35 – dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp Cụ thể, ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddGTP, ống C thêm 1% ddCTP, và ống T thêm 1% ddTTP Sau khi khuếch đại DNA, quá trình này sẽ giúp phân tích và xác định các thành phần của DNA một cách chính xác.
PCR được thực hiện với khoảng 25-35 chu kỳ, sau đó kết quả được điện di trên gel polyacrylamide Các đoạn oligonucleotid có kích thước khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo ra các vị trí khác nhau trên bản gel Phản ứng hiện hình phóng xạ cho phép quan sát các đoạn mạch đơn DNA thông qua các vạch trên bản gel Kết quả từ 4 ống phản ứng cho phép xác định trình tự các nucleotid, từ đó biết được trình tự nucleotid trong gen.
Tùy vào mục đích giữ mẫu, có thể lựa chọn sử dụng đồng vị phóng xạ S-35 hoặc P-32 để đánh dấu phóng xạ cho đoạn mạch khuôn Đồng vị S-35 có thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, trong khi đó P-32 có thời gian mất hoạt tính khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.7.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
Nguyên tắc chung của phương pháp dideoxy cho phép máy đọc trình tự phát hiện và giảm nhầm lẫn nhờ vào việc đọc trên cả hai mạch đơn DNA Hai loại mồi, mồi xuôi và mồi ngược, được sử dụng cho mỗi mạch đơn Quá trình biến tính DNA diễn ra trong môi trường có urea và nhiệt độ khoảng 55 độ C, giúp hai mạch đơn tách rời mà không bắt cặp lại Sử dụng chùm tia laser để đánh dấu vị trí và thời gian của các nucleotid, từ đó tổng hợp được trình tự gen chính xác.
2.7.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA đƣợc giảỉ mã
Trong những năm gần đây, thông tin về trình tự DNA của các loài sinh vật đã được lưu trữ và quản lý trong các ngân hàng dữ liệu như EMBL ở Châu Âu và GenBank ở Mỹ, cho phép người dùng dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thông qua internet.
BLAST là một trong những công cụ phổ biến nhất trong tin sinh học, cho phép các nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA và protein để xác định mối liên quan giữa đoạn gen quan tâm và các đoạn gen trong ngân hàng gen Để sử dụng BLAST, người dùng cần cung cấp hai chuỗi: chuỗi đích, thường nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu, và cơ sở dữ liệu chứa các chuỗi gen.
- Có 5 chương trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotid- Nucleotid BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotid trong ngân hàng dữ liệu (Ken, 2002).
PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP
Địa điểm và thời gian thực hiện
3.1.1 Địa điểm tiến hành thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện tại phòng thí nghiệm Vi Sinh Vật thuộc Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
Ruộng thí nghiệm ở nông trường Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long
Phương tiện
3.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Sử dụng phương tiện nghiên cứu có tại Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trường Đại học Cần Thơ
- Tủ cấy vi sinh vật (Pháp)
- Tủ ủ vi sinh vật Incucell 111 (Đức)
- Kính hiển vi Olympus CHT (Nhật)
- Kính hiển vi Olympus BH - 2 (Nhật)
- Máy lắc mẫu GFL 3005 (Đức)
- Nồi khử trùng nhiệt ƣớt Pbi - international (Đức)
- Máy khuấy từ (Hoa kỳ)
- pH kế Orion 420A (Hoa Kỳ)
- Cân điện tử Sartorius (Đức)
- Lò vi sóng Panasonic (Thái Lan)
- Máy chụp ảnh kỹ thuật số
- Máy vi tính phân tích và lưu trữ số liệu
- Hệ thống chƣng cất đạm
- Bếp vô cơ hóa mẫu
- Đĩa petri, ống nghiệm, Bình Kjeldahl
- Đèn cồn, que cấy, lame và lammen
Cân phân tích pH kế
Buồng cấy vi sinh vật
3.2.2 Vật liệu thí nghiệm Đất vùng rễ thu thập ở tỉnh Đồng Tháp, An Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ 3.2.3 Hóa chất và môi trường
Hóa chất dùng để phân lập Pseudomonas sp trên môi trường đặc theo công thức môi trường ở bảng 1
Bảng 1: Công thức môi trường Pseudomonas sp
Hóa chất Nồng độ(g/100ml)
Hóa chất dùng để nuôi Pseudomonas sp trên môi trường King B theo công thức ở bảng 2
Bảng 2: Công thức môi trường King B
* Hóa chất của môi trường nuôi vi khuẩn để trích DNA
Môi trường LB lỏng nuôi vi khuẩn để trích DNA có thành phần các chất như sau:
Bảng 3 Công thức môi trường Luria-Bertani (LB)
NaCl 10 pH 7,0 www.bcm.edu/physio/lab_pages/ /protocols.htm
* Hóa chất dùng để tinh sạch DNA của vi khuẩn
- Nước cất hai lần vô trùng
- Chloroform: Isoamyl alcohol (tỉ lệ 24:1)
* Hóa chất dùng để PCR và điện di sản phẩm PCR
- DNA vi khuẩn Pseudomonas sp đã tinh sạch
- Nước cất hai lần vô trùng
- dNTPs (dATP, dTTP, dGTP và dCTP)
- Thang DNA chuẩn 100bp plus
* Hóa chất dùng để đo lân
- Dung dịch lân chuẩn: P 2 O 5 : 10 ppm (10 mg/l)
Hóa chất dùng để phân tích hợp chất hữu cơ
Hóa chất dùng để xác định P dễ tiêu trong đất theo phương pháp ONIANI
- Dung dich A: ammoniummolypdat, Potassium antinomol tartrat
Hóa chất phân tích đạm bằng phương pháp Kjedahl
- Dung dịch acid oxalic chuẩn (N/100)
- Dung dich đỏ metyl 0,5% trong rƣợu etylic
Phương pháp nghiên cứu
3.3.1 Phương pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn
3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu
Để thu mẫu đất hiệu quả, nên tiến hành lấy mẫu ở vùng rễ tại các địa điểm như Đồng Tháp, An Giang, Vĩnh Long và Cần Thơ Thời điểm lý tưởng để thu mẫu là vào buổi sáng hoặc xế chiều, đồng thời cần đảm bảo đất luôn có độ ẩm tương đối.
- Cách thu mẫu: nhổ toàn bộ cây (lấy cả phần đất dính xung quanh rễ), giủ sạch đất, mẫu cần thu chính là phần đất đƣợc giủ ra
3.3.1.2 Phân lập các dòng vi khuẩn
- Cân 10g mẫu đất cho vào 90 ml nước cất vô trùng trong bình tam giác 250 ml, đậy bình bằng nút gòn và giấy dầu
- Đem lắc các bình tam giác trên máy lắc trong 30 phút
- Dùng micropipet P200 hút lần lượt 100 μl mẫu nước rồi nhỏ lên đĩa petri có môi trường phân lập (Pseudomonas isolation agar)
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch
- Đĩa môi trường đã trải mẫu được ủ ở 30 o C trong tủ ủ vi sinh vật từ 2- 3 ngày để vi khuẩn phát triển
Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ với sự khác biệt về hình dạng, màu sắc và kích thước từ đĩa môi trường Tiến hành cấy chuyển nhiều lần sang môi trường tương tự cho đến khi các khuẩn lạc tách rời hoàn toàn.
Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần bằng cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn Đầu tiên, nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên lame, sau đó khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội Sử dụng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc và trải đều lên giọt nước cất vô trùng Đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách tiếp xúc một cạnh của lammen với lame ở góc 45° rồi hạ lammen từ từ để tránh tạo bọt khí Cuối cùng, quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu.
- Khi thấy mẫu đã ròng thì cấy chuyển vào ống nghiêng chứa môi trường đặc tương ứng, trữ ở 4 o C và được xem như là một dòng
3.3.2 Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc
Khi thực hiện cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trường phân lập đặc, việc đo kích thước và quan sát hình thái của các dạng khuẩn lạc là rất quan trọng Các chỉ tiêu cần chú ý bao gồm màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa của khuẩn lạc, được thực hiện bằng mắt thường (Cao Ngọc Điệp).
Nguyễn Hữu Hiệp, 2000) Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thước quá nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát
- Các khuẩn lạc được đo kích thước bằng thước centimet (cm)
3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
Sau khi vi khuẩn được phân lập và tách ròng, hình dạng và sự chuyển động của chúng được quan sát bằng phương pháp giọt ép dưới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần, theo nghiên cứu của Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2000).
Để chuẩn bị mẫu vi khuẩn, trước tiên, nhỏ 15 μl nước cất vô trùng lên lame Tiếp theo, khử trùng kim cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội Sử dụng kim cấy để lấy một ít khuẩn lạc và trải đều lên giọt nước cất vô trùng trên lame Cuối cùng, đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách nghiêng một cạnh của lammen 45° và hạ lammen xuống từ từ, nhẹ nhàng để tránh tạo bọt khí trong mẫu vật.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn là một quy trình quan trọng Để thực hiện điều này, cần sử dụng kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần, giúp phát hiện rõ các hình dạng và cách thức di chuyển của vi khuẩn.
3.3.4 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA) Để xác định khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn, trình tự các bước được tiến hành theo hình (Patten và Glick, 1996)
Nuôi trong môi trường không có tryptophan
Ly tâm, lấy phần dịch trong
Trộn với thuốc thử Đo OD ở bước sóng 530 nm
Hình 3 : Sơ đồ các bước xác định khả năng sản xuất IAA của các dòng vi khuẩn
- Đong 553ml H 2 SO 4 đậm đặc vào bình định chuẩn, thêm từ từ nước cất vào cho đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ đƣợc dung dịch H 2 SO 4 đậm dặc 10,8M
Cân 4,5g FeCl3 và cho vào cốc, sau đó từ từ thêm dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M vào cốc, khuấy đều cho FeCl3 tan hoàn toàn Sau khi hoàn tất, để dung dịch nguội và bảo quản trong chai màu tối, đặt ở nơi tối.
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn
Để đảm bảo lượng vi khuẩn được chủng vào môi trường lỏng đồng nhất, cần sử dụng que cấy để lấy một phần sinh khối vi khuẩn đã làm ròng, sao cho đầy vòng tròn đầu que cấy Sau đó, cho vi khuẩn vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường lỏng King B và ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày.
Lấy 200μl dịch huyền phù vi khuẩn từ chủng và cho vào ống nghiệm chứa 2ml môi trường King B lỏng Sau đó, lắc ống nghiệm trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 vòng/phút, mỗi nghiệm thức được lặp lại 2 lần.
Nước 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml
Thuốc thử 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml
Định lƣợng lƣợng IAA đƣợc tổng hợp
- Lấy 2ml mẫu của các dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trường nuôi ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi đem ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút trong 5 phút
Sau khi ly tâm, dịch được phối trộn với thuốc thử R2 theo tỉ lệ 2R2/1 mẫu để đo lượng IAA tổng hợp bằng máy so màu theo phương pháp Salkowki ở bước sóng 530nm (OD 530nm) IAA trong dịch huyền phù vi khuẩn phản ứng với thuốc thử, tạo thành dung dịch màu hồng hoặc đỏ, tùy thuộc vào lượng IAA do vi khuẩn sản sinh Phần mềm Excel được sử dụng để vẽ đồ thị và xác định phương trình đường chuẩn của IAA.
Trong đó: X là nồng độ của mẫu (ppm) và Y là độ hấp thụ quang (OD)
Dựa vào phương trình đường chuẩn IAA và giá trị OD của mẫu, hàm lượng IAA trong mẫu có thể được tính theo công thức: X = (Y – b)/a Để đo hàm lượng các chất kích thích tố sinh trưởng như IAA và Gibberellin, phương pháp sắc ký lỏng sẽ được sử dụng.
3.3.6.1 Ly trích DNA của các dòng vi khuẩn Pseudomonas (Wilson, 1997)
- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trường LB và ủ qua đêm ở 30 o C
- Chuyển dung dịch huyền phù vi khuẩn sang tuýp 2 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút
Để chuẩn bị mẫu, trước tiên cần loại bỏ hoàn toàn dung dịch môi trường nuôi vi khuẩn trong tuýp Tiếp theo, thêm 250 μl dung dịch TE-pH8 và khuấy đều để hòa tan sinh khối Cuối cùng, cho thêm 50 μl dung dịch SDS 10% vào hỗn hợp.
- Bổ sung thêm 10 μl proteinase K (10 mg/ml) và ủ ở 65 o C trong 20 phút
- Thêm 400 μl CTAB 10 %/ NaCl 0,7 M và ủ tiếp ở 65 o C trong 20 phút
- Cho tiếp 600 μl chloroform-isoamyl alcohol vào tuýp và lắc đều Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút
- Chuyển phần trong bên trên sang tuýp mới, thêm isopropanol với thể tích tương đương, ủ ở -20 o C ít nhất 30 phút
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, đổ nhẹ để loại bỏ nước bên tr ên
- Rửa DNA với cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần)
- Ly tâm chân không ở 45 o C trong 5 phút để loại hết cồn còn lại trong tuýp
- Hòa tan DNA với 30 μl nước cất 2 lần vô trùng Trữ ở -20 o C để thực hiện bước tiếp theo
Sau khi ly trích DNA từ các dòng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi 8F (5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’) và 1492R (5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’).
- Thành phần phản ứng PCR gồm: Nước cất hai lần, PCR buffer, MgCl 2 , dNTPs, hai mồi xuôi và ngƣợc và Taq DNA polymerase
Bảng 4 Thành phần của phản ứng PCR
Húa chất Số lƣợng (àl)
Hình 4: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR
3.3.6.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
