CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.7 Sinh trắc trên đĩa petri
So sánh sự khác biệt giữa mẫu chủng vi khuẩn tổng hợp kích thích tố sinh trƣởng và mẫu đối chứng (khơng có vi khuẩn), lặp lại 3 lần.
- Hạt lúa đƣợc khử trùng với cồn 960C khoảng 2 phút (3 lần) và oxy già 1 phút (3 lần) sau đó rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng và để ráo. Hạt lúa đƣợc cho nẩy mầm trên đĩa petri chứa mơi trƣờng agar. Sau đó, hạt lúa nảy mầm cho vào ống nghiệm chứa môi trƣờng agar và nhỏ dung dịch vi khuẩn tổng hợp kích thích tố tăng trƣởng và đối chứng âm (khơng có vi khuẩn) để so sánh sự tạo thành rễ và chiều dài rễ của hai nghiệm thức này, đánh giá hiệu quả của vi khuẩn đƣợc minh họa ở hình 5.
Hình 5: Các bƣớc tiến hành sinh trắc hạt lúa trên đĩa petri với các dịng vi khuẩn sản xuất kích thích tố tăng trƣởng
3.3.8 Đánh giá hiệu quả vi khuẩn tổng hợp kích thích tố tăng trƣởng kết hợp với phân vi sinh (DASVILA) và phân hữu cơ – vi sinh (DASVILA++) trên cây lúa.
3.3.8.1 Phân tích đất trƣớc khi thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện ngồi đồng, vụ Đơng xn tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ.
Đất ruộng thí nghiệm đƣợc phân tích bởi phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ đƣợc thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5: Thành phần dinh dƣỡng của đất trồng lúa thí nghiệm tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ.
pH Nitơ (%N) P2O5 (mg/100g đất) K trao đổi (mg/kg đất) Chất hữu cơ (%) 5,8 1,63 4,45 380 1,1
Kết quả từ bảng cho thấy thành phần dinh dƣỡng của đất trồng lúa thí nghiệm tại
Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ thuộc loại đất ít chua, giàu đạm, giàu kali, giàu lân và chất hữu cơ trung bình (Bùi Huy Hiền, 2008).
3.3.8.2 Sơ lƣợc về giông lúa OM 6976
OM 6976 là tổ hợp lai giữa giống IR 68144, OM 997 và OM 27118. Nó có hàm lƣợng vi chất dinh dƣỡng sắt trong hạt gạo khá cao. Thời gian sinh trƣởng từ 95 - 100 ngày, chiều cao cây trung bình 95 – 100 cm, dáng cây đẹp, cứng cây, ít đẻ nhánh, bơng to, kháng rầy, đạo ôn, vàng lá và lùn xoắn lá khá. Năng suất trung bình trung bình từ 7 – 9 tấn/ha.
3.3.8.3 Sơ lƣợc về chế phẩm DASVILA và DASVILA++
DASVILA là phân vi sinh dạng nƣớc với liều lƣợng sử dụng là 1 lít/1000m2
. DASVILA++ là phân hữu cơ vi sinh dạng viên với liều lƣợng sử dụng là 50 kg/1000m2. Hai sản phẩm này đều có chứa dịng vi khuẩn Azospirillum lipoferum (cố định đạm), Pseudomonas sp. (hòa tan lân), Bacillus subtilis (hịa tan kali) đƣợc sản xuất bởi cơng
ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên dịch vụ phát triển nơng nghiệp Đồng Tháp.
3.3.8.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối hồn tồn ngẫu nhiên, với 6 nghiệm thức x 4 lần lập lại = 24 lơ . Diện tích mỗi lơ là 5 m x 10 m = 50 m2. Diện tích 1200 m2
= 50 m2 (50 m2/1 lần lặp lại) x 24 lơ . Tính cả bờ đê, mƣơng tƣới, lơ bảo vệ tổng diện tích thí nghiệm 1300 m2. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày theo bảng 6 và hình 7.
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm trên cây lúa ở Viện lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long
Nghiệm thức (NT)
Phân hóa học Phân vi sinh
N (kg/ha) P2O5 (kg/ha) K2O (kg/ha) DASVIL A + (10 lít/ ha) DASVILA + vi khuẩn A (1) (10 lít/ha) DASVILA+ + (500kg /ha) 1 100 60 30 2 0 0 0 3 50 30 15 10 4 50 30 15 10 5 25 15 7,5 10 6 10 500
( 1)Vi khuẩn A: vi khuẩn vừa mới phân lập có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng.
R1 R2 R3 R4 NT3 NT6 NT5 NT1 NT5 NT1 NT4 NT5 NT6 NT3 NT2 NT3 NT1 NT4 NT6 NT4 NT4 NT2 NT1 NT2 NT2 NT5 NT3 NT6
Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (R: lần lặp lại, NT: nghiệm thức)
3.3.8.5 Chuẩn bị hạt giống
- Giống đƣợc sử dụng: OM 6976
- Lúa đƣợc ủ cho nẩy mầm, sau đó đƣợc trộn với dịch vi khuẩn với liều lƣợng 1 lít/1000 m2 (đối với nghiệm thức 3, 4, 5, 6) ít nhất 3 giờ trƣớc khi sạ. Riêng nghiệm thức 6, DASVILA++
đƣợc bón một lần trƣớc khi sạ 1 ngày.
Hình 7: Chuẩn bị hạt giống và đất trƣớc khi sạ lúa
3.3.8.6 Cách bón phân
- Phân hóa học sử dụng: Phân Urea 46% N, super lân 15% P2O5, KCl 60% K2O.
- Sau khi sạ ta tiến hành bón phân theo liều lƣợng và thời điểm nhƣ sau: Phân bón đƣợc chia làm 3 đợt bón
Đợt 1: 7 ngày sau sạ: bón 1/4 so với tổng lƣợng phân bón
Đợt 2: 30 ngày sau sạ: bón 2/4 so với tổng liều lƣợng phân bón
Đợt 3: 45 ngày sau sạ: bón 1/4 so với tổng số liều lƣợng phân bón. 3.3.8.7 Các chỉ tiêu khảo sát
Các chỉ tiêu phân tích đất Mẫu đất trƣớc khi thí nghiệm - Đo pH
- Phân tích đạm tổng số bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl
- Lân dễ tiêu trong đất theo phƣơng pháp ONIANI
- Chất hữu cơ trong đất bằng phƣơng pháp chuẩn độ Walkley-Black - K trao đổi.
Mẫu đất sau khi thu hoạch lúa
- Phân tích đạm tổng số bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl - Lân dễ tiêu trong đất theo phƣơng pháp ONIANI
- Chất hữu cơ trong đất bằng phƣơng pháp chuẩn độ Walkley-Black Chỉ tiêu về chiều cao cây lúa lúc thu hoạch
- Chiều cao cây đo từ gốc tới chót lá. Các chỉ tiêu thành phần năng suất - Tổng số bông lúa/m2
- Chiều dài bông lúa (cm) - Tổng số hạt lúa chắc/bông - Trọng lƣợng 1000 hạt lúa (g) - Năng suất thực tế (kg/ha)
Chỉ tiêu phẩm chất hạt
- Phân tích hàm lƣợng protein trong hạt gạo bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl
Phƣơng pháp phân tích: Xác định pH đất
pH đất đƣợc đo theo tỉ lệ đất : nƣớc là 1:5 (trọng lƣợng/thể tích). Cân 5g đất cho vào ống, kế đó cho vào 25ml nƣớc cất khuấy đều, sau đó để yên 30-45 phút, đo bằng pH kế. Đọc giá trị pH kế khi giá trị pH ổn định trong 30 giây.
Phân tích hàm lƣợng chất hữu cơ (CHC) trong đất ở các giai đoạn trƣớc khi sạ và sau khi thu hoạch lúa bằng phƣơng pháp chuẩn độ của Walkley – Black.
- Cân 1g đất cho vào bình tam giác đã đƣợc rửa sạch. Dùng ống đong cho vào bình tam giác đã có đất 10ml K2Cr2O7 và 15ml H2SO4 đậm đặc lắc nhẹ cho đất và hóa chất đƣợc trộn lẫn với nhau. Để yên 20-30 phút, sau đó cho thêm 100ml nƣớc cất. Ngay sau khi bắt đầu chuẩn độ thì cho thêm 10ml H3PO4 và 1ml chất chỉ thị màu diphemylamine.
- Chuẩn độ bằng FeSO4 1N cho đến khi dung dịch màu tím mận chuyển sang màu xanh rêu thì dừng. Đây là lúc phản ứng kết thúc. Ghi thể tích trên ống chuẩn độ. Thể tích FeSO4 chính là lƣợng K2Cr2O7 dƣ thừa sau phản ứng oxyt hóa.
- Mẫu đất đối chứng: tất cả các bƣớc đều làm nhƣ mẫu thật nhƣng chỉ khác là khơng có đất. CHC%= W f N V Vo )* *0.3* *1.274 (
Vo (ml): thể tích của FeSO4 khi chuẩn độ mẫu Blank V (ml): thể tích của FeSO4 khi chuẩn độ mẫu thật W (gam): trọng lƣợng đất cân (1g)
N: nồng độ của FeSO4
Hệ số f=100/75=1.33. Nếu giả định phản ứng oxít hóa trên chỉ oxít hóa đƣợc 75% chất hữu cơ trong đất.
Phân tích hàm lƣợng lân dễ tiêu trong đất ở giai đoạn trƣớc khi sạ và sau khi thu hoạch lúa bằng phƣơng pháp Oniani.
- Cân chính xác 1g đất cho vào ống li tâm 50 ml, thêm vào 25 ml H2SO4 0,1N, dùng tay lắc đều, để yên và lọc qua giấy lọc chứa vào chai đựng mẫu.
- Dùng pipet hút từ 1-5 ml dung dịch trích cho vào bình định mức 50 ml, thêm vào 20 ml nƣớc cất, nhỏ 3 giọt phenolphthalein, dùng NaOH 10% nhỏ từng giọt lắc đều cho tới khi dung dịch có màu hồng nhạt, sau đó dùng H2SO4 5% nhỏ 1-2 giọt lắc đều đến khi mất màu. Sau đó thêm vào 8 ml dung dịch B để làm hiện màu, lên thể tích bằng nƣớc cất tới vạch và lắc đều, để yên 10-20 phút đem đo trên máy so màu ở bƣớc sóng bằng 720 hoặc 880 nm.(chuẩn bị mẫu blank giống nhƣ mẫu thật nhƣng khơng có mẫu đất)
- Đƣờng chuẩn: Từ dung dịch chuẩn 0,1mg/ml P2O5: Hút 1ml, 2ml, 3ml, 4ml, 5ml cho vào bình định mức 50 ml, thêm vào 20 ml nƣớc cất vào cho hóa chất làm giống y nhƣ dung dịch trích, đo trên máy so màu.
P2O5 (mg/100g đất) = 1 * % * 100 * * v m k v a a: số mg P2O5 tìm đo trên đồ thị (mg)
v: Thể tích dung dịch trích P dễ tiêu trong đất (ml) 100: Hệ số chuyển đổi từ 1g đất sang 100g đất m: Trọng lƣợng mẫu đất (g)
k: Hệ số cô kiệt của đất.
Phƣơng pháp phân tích Micro-Kjeldahl
- Vơ cơ hóa: Cân 1 g đất đã nghiền nhuyễn vào bình Kjeldahl có thể tích 50- 100 ml, sau đó thêm 5 ml H2SO4 đậm đặc, thêm vào 0,5 g chất xúc tác gồm hỗn hợp: K2SO4:CuSO4:Se (100:10:1). Sau đó đem bình vơ cơ hóa khoảng 45 phút, để nguội. Sau đó pha lỗng dung dịch nhận đƣợc với nƣớc khử khoáng.
- Sự lôi cuốn hơi nƣớc: Đun sơi bình nƣớc trong hệ thống chƣng cất đạm. Cho mẫu vào bình đựng mẫu lơi cuốn đạm, cho từ từ NaOH 10N vào cho tới khi dung dịch trong bình chuyển sang màu xám đen, NH3 đƣợc đẩy ra khỏi bình và hứng trong cốc thủy tinh có chứa 10 ml acid boric và chất chỉ thị màu, màu của acid chuyển từ màu đỏ sang màu xanh chứng tỏ NH3 đang bị đẩy ra, hứng tới 60 ml thì lấy cốc ra đi chuẩn độ bằng acid H2SO4 0,01N cho tới khi nó trở lại màu ban đầu là đƣợc. Đọc thể tích H2SO4 đem đi chuẩn độ và tính lƣợng đạm có trong mẫu theo cơng thức sau:
X = W V*0,014*100 X: % đạm tổng số có trong mẫu đất V: thể tích H2SO4 (0,01N) đem chuẩn độ 0,014: Số mg nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,01N 100: Hệ số chuyển đổi % W: Trọng lƣợng mẫu (mg)
- % protein trong hạt gạo: cũng tiến hành các bƣớc giống nhƣ trên.
X =
W
V *0,014*100*5,8
X: % Protein trong hạt gạo
V: thể tích H2SO4 (0,01N) đem chuẩn độ 0,014: Số mg nitơ ứng với 1 ml H2SO4 0,01N 100: Hệ số chuyển đổi %
W: Trọng lƣợng mẫu (mg)
Phân tích hàm lƣợng kali dễ tiêu trong đất ở giai đoạn trƣớc khi sạ và sau khi thu hoạch lúa vụ 1 và 2 bằng phƣơng pháp hấp thu nguyên tử.
Phƣơng pháp: Cân chính xác 1 gam đất cho vào ống ly tâm 50 ml. Thêm 10 ml NH4OH, lắc trong 1 giờ, ly tâm và lọc dung dịch nƣớc trích cho vào bình chứa mẫu 25 ml.
Mẫu đối chứng (mẫu Blank) tƣơng tự nhƣ đối với mẫu thật nhƣng khơng có đất.
Đo bằng phƣơng pháp quang kế phát xạ ngọn lửa hoặc phƣơng pháp hấp thu nguyên tử. Hút 2 ml mẫu dung dịch trích cho vào ống nghiệm 15 ml. Thêm vào dung dịch Cesium chloride đã acid hóa và cộng thêm 7 ml nƣớc và lắc đều. Sau đó đem trên máy hấp thu nguyên tử ở độ dài sóng 766 nm. Chuẩn bị tƣơng tự nhƣ vậy đối với mẫu Blank.
Cách tính kết quả:
(a – b) x V x hệ số pha loãng x 10-3 x 100 K trao đổi (meq/100 g đất) =
W x 39
Trong đó: a: nồng độ K trong mẫu thật mg/l
b: nồng độ K trong mẫu Blank mg/l
W: trọng lƣợng mẫu đất (g)
10-3: hệ số đổi ml sang l V: thể tích mẫu trích (ml)
Tổng lƣợng protein = hàm lƣợng protein trong hạt gạo x năng suất lúa. Tổng lƣợng đạm trong rơm = hàm lƣợng đạm trong rơm x năng suất lúa. Tổng lƣợng kali trong rơm = hàm lƣợng kali trong rơm x năng suất lúa.
f. Xử lý số liệu: Thống kê số liệu bằng MS EXCEL, phân tích bằng phƣơng pháp ANOVA
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1 Phân lập và đặc điểm khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn 4.1.1 Phân lập vi khuẩn 4.1.1 Phân lập vi khuẩn
Bảng 7: Nguồn gốc của các dòng vi khuẩn phân lập trên môi trƣờng Pseudomonas Isolation agar.
STT Vi khuẩn Nguồn gốc mẫu
1 AG 1a Mỹ Luông-An Giang
2 AG 1b Mỹ Luông-An Giang
3 AG 1c Mỹ Luông-An Giang
4 AG 2c Chợ Mới -An Giang
5 AG 2b’ Chơ Mới-An Giang
6 AG 2a Chợ Mới-An Giang 7 AG 2b Chợ Mới-An Giang 8 AG 3a Mỹ Luông-An Giang 9 AG 4c Mỹ Luông-An Giang 10 CT 1c TP. Cần Thơ 11 CT 2a TP. Cần Thơ 12 CT 2b TP. Cần Thơ 13 CT 2c TP. Cần Thơ 14 ĐT 1a Lấp Vò-Đồng Tháp 15 ĐT 1b Lấp Vò-Đồng Tháp 16 ĐT 1d Lấp Vò-Đồng Tháp 17 ĐT 1f Lấp Vò-Đồng Tháp 18 ĐT 2g Cao Lãnh-Đồng Tháp 19 ĐT 2e Cao Lãnh-Đồng Tháp 20 ĐT 2d Cao Lãnh-Đồng Tháp 21 VL 1b Tam Bình-Vĩnh Long 22 VL 1c Tam Bình-Vĩnh Long 23 VL 1e Tam Bình-Vĩnh Long 24 VL 3a Tân Lƣợc-Vĩnh Long 25 VL 3b Tân Lƣợc-Vĩnh Long 26 VL 4c Tân Lƣợc-Vĩnh Long 27 VL 4b Tân Lƣợc-Vĩnh Long 28 VL 4d Tân Lƣợc-Vĩnh Long
Vi khuẩn ở vùng rễ rất phong phú và đa dạng về hình thái, màu sắc và hình dạng khuẩn lạc. Qua quá trình phân lập và tách rịng vi khuẩn từ các mẫu đất vùng rễ thu tại các tỉnh An Giang, Đồng Tháp, Cần Thơ, Vĩnh Long trên môi trƣờng Pseudomonas isolation agar đặc đã thu đƣợc 28 dòng vi khuẩn khác nhau đƣợc trình bày ở bảng 7
4.1.2 Đặc điểm của khuẩn lạc và tế bào vi khuẩn (a) Đặc điểm của khuẩn lạc (a) Đặc điểm của khuẩn lạc
- Màu sắc khuẩn lạc: Đa số các dịng có màu trắng trong hoặc trắng đục. Trong tổng số các dòng phân lập, 15/28 dòng tạo khuẩn lạc màu trắng đục chiếm tỉ lệ 53,58% và 13/28 dịng có khuẩn lạc màu trắng trong chiếm tỉ lệ 46,42%.
- Hình dạng khuẩn lạc: Phần lớn các khuẩn lạc thu đƣợc đều có dạng hình trịn, một số có dạng khơng đều. Trong số 28 dịng phân lập đƣợc thì có 15/28 dịng có dạng khuẩn lạc tròn chiếm tỉ lệ 53,57% và 13/28 dịng có dạng khuẩn lạc khơng đều chiếm tỉ lệ 46,43% .
- Độ nổi khuẩn lạc: trong số 28 dòng đã phân lập thì dịng vi khuẩn có độ nổi lài chiếm đa số với 24/28 dòng, chiếm tỉ lệ 85,71%, còn lại 4 dịng là khuẩn lạc có độ nổi mơ chiếm tỉ lệ 14,29%.
- Dạng bìa khuẩn lạc: Hầu hết các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc đều có khuẩn lạc dạng bìa răng cƣa, một số ít có dạng bìa ngun và dạng bìa xẻ thùy. Số lƣợng cụ thể là 21/28 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc bìa dạng răng cƣa chiếm tỉ lệ 75%, 6/28 dịng vi khuẩn có bìa dạng ngun chiếm tỉ lệ 21,42%, cịn lại một dịng có dạng bìa xẻ thùy.
- Kích thƣớc khuẩn lạc: Phần lớn các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc có đƣờng kính khuẩn lạc dao động từ 1-2 mm sau khi cấy trên môi trƣờng đặc, ủ ở 300
C trong 24 giờ. Đặc biệt, ở cùng điều kiện ủ nhƣng đƣờng kính khuẩn lạc của dịng vi khuẩn ĐT 2e có kính thƣớc đến 3,8 mm.
Bảng 8: Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào khuẩn lạc đã phân lập
Số TT
Vi khuẩn
Đặc điểm vi khuẩn Đặc điểm khuẩn lạc Hình dạng Chuyển
động Màu sắc Hình dạng Dạng bìa Độ nổi
ĐK (mm) 1 AG 1a Que ngắn + + Trắng trong Không đều Răng cƣa Lài 1,5 2 AG 1b Que ngắn + + Trắng đục Tròn đều Răng cƣa Lài 1 3 AG 1c Que ngắn + + Trắng trong Không đều Răng cƣa Lài 1 4 AG 2a Que ngắn + Trắng trong Không đều Răng cƣa Lài 1,5 5 AG 2b Que ngắn + + + Trắng đục Trịn đều Ngun Mơ 1,5 6 AG 2c Que ngắn + + Trắng đục Tròn đều Nguyên Lài 1,5 7 AG 2b’ Que ngắn + + + Trắng trong Không đều Răng cƣa Lài 3