CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.2 Quan sát hình thái, đo kích thƣớc khuẩn lạc
- Khi cấy chuyển vi khuẩn trên đĩa môi trƣờng phân lập đặc ta đồng thời tiến hành đo kích thƣớc và quan sát hình thái các dạng khuẩn lạc bao gồm các chỉ tiêu: màu sắc, hình dạng, độ nổi và dạng bìa khuẩn lạc bằng mắt thƣờng (Cao Ngọc Điệp và
Nguyễn Hữu Hiệp, 2000). Tuy nhiên, đối với những khuẩn lạc có kích thƣớc q nhỏ thì sử dụng kính lúp để quan sát.
- Các khuẩn lạc đƣợc đo kích thƣớc bằng thƣớc centimet (cm). 3.3.3 Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
- Sau khi phân lập và tách ròng vi khuẩn, tiến hành quan sát hình dạng và sự chuyển động của vi khuẩn bằng phƣơng pháp giọt ép dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần theo Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp (2000).
Chuẩn bị mẫu vi khuẩn
o Nhỏ 15 μl nƣớc cất vô trùng lên lame.
o Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
o Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nƣớc cất vô trùng trên lame.
o Đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lammen tiếp xúc với lame một góc 45° rồi hạ lammen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng có bọt khí.
Quan sát hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn
o Tiến hành quan sát mẫu vật dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần để thấy đƣợc các hình dạng và khả năng chuyển động của vi khuẩn.
3.3.4 Khả năng tổng hợp indole-3-acetic acid (IAA)
Để xác định khả năng tổng hợp IAA của vi khuẩn, trình tự các bƣớc đƣợc tiến hành theo hình (Patten và Glick, 1996).
Vi khuẩn
Nuôi trong môi trƣờng khơng có tryptophan
Ly tâm, lấy phần dịch trong
Trộn với thuốc thử
Đo OD ở bƣớc sóng 530 nm
Hình 3 : Sơ đồ các bƣớc xác định khả năng sản xuất IAA của các dòng vi khuẩn
Chuẩn bị thuốc thử (R2)
- Đong 553ml H2SO4 đậm đặc vào bình định chuẩn, thêm từ từ nƣớc cất vào cho đủ 1 lít, để nguội sau 12 giờ đƣợc dung dịch H2SO4 đậm dặc 10,8M.
- Cân 4,5g FeCl3 cho vào cốc, thêm từ từ dung dịch H2SO4 đậm đặc 10,8M vào cốc và khuấy cho FeCl3 tan đều, để nguội. Bảo quản trong chai sậm màu và đặt trong tối.
Chuẩn bị dịch huyền phù vi khuẩn
- Để đảm bảo lƣợng vi khuẩn đƣợc chủng vào các môi trƣờng lỏng tạo dịch huyền phù là tƣơng đối nhƣ nhau, dùng que cấy lấy một phần sinh khối của vi khuẩn đã làm ròng sao cho đầy vòng tròn của đầu que cấy rồi cho vào ống nghiệm có chứa sẵn 5ml mơi trƣờng lỏng King B, ủ trên máy lắc với tốc độ 120 vòng/phút trong 2 ngày.
- Lấy 200μl các dịch huyền phù vi khuẩn trên chủng vào các ống nghiệm chứa 2ml môi trƣờng King B lỏng và lắc trên máy lắc xoay vòng với tốc độ 120 vòng/phút. Mỗi nghiệm thức lập lại 2 lần.
Dựng đƣờng chuẩn Hàm lƣợng IAA (mg/lít) 0 1 2 3 4 5 Hóa chất Nƣớc 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml 0,5ml Thuốc thử 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml 1ml IAA chuẩn 0l 1l 2l 3l 4l 5 l Định lƣợng lƣợng IAA đƣợc tổng hợp
- Lấy 2ml mẫu của các dịch huyền phù vi khuẩn trong môi trƣờng nuôi ở các thời điểm 2, 4, 6 và 8 ngày nuôi đem ly tâm lạnh 12.000 vòng/phút trong 5 phút.
- Lấy dịch trong sau khi ly tâm phối trộn với thuốc thử R2 theo tỉ lệ (2R2/1mẫu) để đo lƣợng IAA đƣợc tổng hợp bằng máy so màu theo phƣơng pháp của Salkowki ở bƣớc sóng 530nm (OD530nm). IAA đƣợc tạo ra trong dịch huyền phù vi khuẩn sẽ phản ứng với thuốc thử tạo thành dung dịch có màu hồng hay đỏ tùy vào lƣợng IAA do vi khuẩn tạo ra nhiều hay ít. Sử dụng phần mềm Excel vẽ đồ thị xác định phƣơng trình đƣờng chuẩn của IAA.
- Phƣơng trình đƣờng chuẩn: Y = a*X + b
Trong đó: X là nồng độ của mẫu (ppm) và Y là độ hấp thụ quang (OD)
Dựa vào phƣơng trình đƣờng chuẩn IAA và giá trị OD của mẫu để tính hàm lƣợng IAA có trong mẫu tƣơng ứng với lƣợng IAA theo công thức: X = (Y – b)/a.
3.3.5 Đo hàm lƣợng các chất kích thích tố sinh trƣởng bằng sắc ký lỏng Đo hàm lƣợng IAA, Gibberellin.
3.3.6 Giải trình tự mẫu
3.3.6.1 Ly trích DNA của các dịng vi khuẩn Pseudomonas (Wilson, 1997)
- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trƣờng LB và ủ qua đêm ở 30oC. - Chuyển dung dịch huyền phù vi khuẩn sang tuýp 2 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ hết dung dịch môi trƣờng ni vi khuẩn có trong tuýp, thêm 250 μl dung dịch TE-pH8 và đánh tan sinh khối. Sau đó cho thêm 50 μl dung dịch SDS 10%.
- Bổ sung thêm 10 μl proteinase K (10 mg/ml) và ủ ở 65oC trong 20 phút. - Thêm 400 μl CTAB 10 %/ NaCl 0,7 M và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút.
- Cho tiếp 600 μl chloroform-isoamyl alcohol vào tuýp và lắc đều. Sau đó ly tâm 12.000 vịng/phút trong 10 phút.
- Chuyển phần trong bên trên sang tuýp mới, thêm isopropanol với thể tích tƣơng đƣơng, ủ ở -20oC ít nhất 30 phút.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, đổ nhẹ để loại bỏ nƣớc bên tr ên.
- Rửa DNA với cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
- Ly tâm chân không ở 45oC trong 5 phút để loại hết cồn còn lại trong tuýp.
- Hòa tan DNA với 30 μl nƣớc cất 2 lần vô trùng. Trữ ở -20oC để thực hiện bƣớc tiếp theo.
3.3.6.2 Phản ứng PCR
Sau khi ly trích DNA của các dịng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi sau. Mồi xuôi 8F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’. Mồi ngƣợc 1492R: 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
- Thành phần phản ứng PCR gồm: Nƣớc cất hai lần, PCR buffer, MgCl2, dNTPs, hai mồi xuôi và ngƣợc và Taq DNA polymerase.
Bảng 4. Thành phần của phản ứng PCR Hóa chất Số lƣợng (µl) Hóa chất Số lƣợng (µl) Nƣớc cất hai lần 12 PCR buffer 2,5 MgCl2 2 dNTPs 4 Mồi xuôi 1 Mồi ngƣợc 1 BSA 0,25
Taq DNA polymerase 0,25
95oC 95oC 55oC 72oC 72oC 10oC 5’ 1’ 1’ ∞ 35 chu kỳ 1’ 10’
Hình 4: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR
3.3.6.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Các sản phẩm sau khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên gel agarose 1,2% bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ) có bổ sung thêm ethidium bromide (EtBr).
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,48g agarose cho vào bình tam giác đựng 45ml dung dịch TAE 1X, dùng lị vi sóng đun hỗn hợp này trong 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Lấy ra để nguội tự nhiên khoảng 10 phút (cầm tay đƣợc), bổ sung 1μl ethidium bromide và lắc nhẹ cho đều. Sau đó đổ nhẹ dung dịch agarose vào khn để định hình gel. Khi đổ gel phải đổ dứt khoát để tránh bọt khí làm ảnh hƣởng đến kết quả điện di sản phẩm PCR.
- Đặt gel agarose đã đƣợc định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X, bơm 10μl mẫu sản phẩm PCR của DNA đã đƣợc trộn đều với 2μl loading buffer vào các giếng trên gel agarose. Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 60 phút.
- Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) kết hợp với thang chuẩn DNA để ƣớc lƣợng kích thƣớc của băng DNA vi khuẩn trên hình gel chụp đƣợc.
Giải trình tự đoạn DNA và tìm mối tƣơng đồng với dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen của NCBI để nhận diện hay định danh chúng bằng phần mềm BLAST N (Nucleotid – Nucleotid BLAST)
3.3.7 Sinh trắc trên đĩa petri
So sánh sự khác biệt giữa mẫu chủng vi khuẩn tổng hợp kích thích tố sinh trƣởng và mẫu đối chứng (khơng có vi khuẩn), lặp lại 3 lần.
- Hạt lúa đƣợc khử trùng với cồn 960C khoảng 2 phút (3 lần) và oxy già 1 phút (3 lần) sau đó rửa lại bằng nƣớc cất khử trùng và để ráo. Hạt lúa đƣợc cho nẩy mầm trên đĩa petri chứa mơi trƣờng agar. Sau đó, hạt lúa nảy mầm cho vào ống nghiệm chứa môi trƣờng agar và nhỏ dung dịch vi khuẩn tổng hợp kích thích tố tăng trƣởng và đối chứng âm (khơng có vi khuẩn) để so sánh sự tạo thành rễ và chiều dài rễ của hai nghiệm thức này, đánh giá hiệu quả của vi khuẩn đƣợc minh họa ở hình 5.
Hình 5: Các bƣớc tiến hành sinh trắc hạt lúa trên đĩa petri với các dịng vi khuẩn sản xuất kích thích tố tăng trƣởng
3.3.8 Đánh giá hiệu quả vi khuẩn tổng hợp kích thích tố tăng trƣởng kết hợp với phân vi sinh (DASVILA) và phân hữu cơ – vi sinh (DASVILA++) trên cây lúa.
3.3.8.1 Phân tích đất trƣớc khi thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc thực hiện ngồi đồng, vụ Đơng xn tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ.
Đất ruộng thí nghiệm đƣợc phân tích bởi phịng Vi sinh vật đất, Viện Nghiên cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, trƣờng Đại học Cần Thơ đƣợc thể hiện ở bảng 5.
Bảng 5: Thành phần dinh dƣỡng của đất trồng lúa thí nghiệm tại Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ.
pH Nitơ (%N) P2O5 (mg/100g đất) K trao đổi (mg/kg đất) Chất hữu cơ (%) 5,8 1,63 4,45 380 1,1
Kết quả từ bảng cho thấy thành phần dinh dƣỡng của đất trồng lúa thí nghiệm tại
Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, Tp Cần Thơ thuộc loại đất ít chua, giàu đạm, giàu kali, giàu lân và chất hữu cơ trung bình (Bùi Huy Hiền, 2008).
3.3.8.2 Sơ lƣợc về giông lúa OM 6976
OM 6976 là tổ hợp lai giữa giống IR 68144, OM 997 và OM 27118. Nó có hàm lƣợng vi chất dinh dƣỡng sắt trong hạt gạo khá cao. Thời gian sinh trƣởng từ 95 - 100 ngày, chiều cao cây trung bình 95 – 100 cm, dáng cây đẹp, cứng cây, ít đẻ nhánh, bơng to, kháng rầy, đạo ôn, vàng lá và lùn xoắn lá khá. Năng suất trung bình trung bình từ 7 – 9 tấn/ha.
3.3.8.3 Sơ lƣợc về chế phẩm DASVILA và DASVILA++
DASVILA là phân vi sinh dạng nƣớc với liều lƣợng sử dụng là 1 lít/1000m2
. DASVILA++ là phân hữu cơ vi sinh dạng viên với liều lƣợng sử dụng là 50 kg/1000m2. Hai sản phẩm này đều có chứa dịng vi khuẩn Azospirillum lipoferum (cố định đạm), Pseudomonas sp. (hòa tan lân), Bacillus subtilis (hịa tan kali) đƣợc sản xuất bởi cơng
ty trách nhiệm hữu hạn một thành viên dịch vụ phát triển nơng nghiệp Đồng Tháp.
3.3.8.4 Bố trí thí nghiệm
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo khối hồn tồn ngẫu nhiên, với 6 nghiệm thức x 4 lần lập lại = 24 lơ . Diện tích mỗi lơ là 5 m x 10 m = 50 m2. Diện tích 1200 m2
= 50 m2 (50 m2/1 lần lặp lại) x 24 lơ . Tính cả bờ đê, mƣơng tƣới, lơ bảo vệ tổng diện tích thí nghiệm 1300 m2. Bố trí thí nghiệm đƣợc trình bày theo bảng 6 và hình 7.
Bảng 6: Bố trí thí nghiệm trên cây lúa ở Viện lúa Đồng Bằng Sơng Cửu Long
Nghiệm thức (NT)
Phân hóa học Phân vi sinh
N (kg/ha) P2O5 (kg/ha) K2O (kg/ha) DASVIL A + (10 lít/ ha) DASVILA + vi khuẩn A (1) (10 lít/ha) DASVILA+ + (500kg /ha) 1 100 60 30 2 0 0 0 3 50 30 15 10 4 50 30 15 10 5 25 15 7,5 10 6 10 500
( 1)Vi khuẩn A: vi khuẩn vừa mới phân lập có khả năng tổng hợp kích thích tố tăng trưởng.
R1 R2 R3 R4 NT3 NT6 NT5 NT1 NT5 NT1 NT4 NT5 NT6 NT3 NT2 NT3 NT1 NT4 NT6 NT4 NT4 NT2 NT1 NT2 NT2 NT5 NT3 NT6
Hình 6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm ở Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long (R: lần lặp lại, NT: nghiệm thức)
3.3.8.5 Chuẩn bị hạt giống
- Giống đƣợc sử dụng: OM 6976
- Lúa đƣợc ủ cho nẩy mầm, sau đó đƣợc trộn với dịch vi khuẩn với liều lƣợng 1 lít/1000 m2 (đối với nghiệm thức 3, 4, 5, 6) ít nhất 3 giờ trƣớc khi sạ. Riêng nghiệm thức 6, DASVILA++
đƣợc bón một lần trƣớc khi sạ 1 ngày.
Hình 7: Chuẩn bị hạt giống và đất trƣớc khi sạ lúa
3.3.8.6 Cách bón phân
- Phân hóa học sử dụng: Phân Urea 46% N, super lân 15% P2O5, KCl 60% K2O.
- Sau khi sạ ta tiến hành bón phân theo liều lƣợng và thời điểm nhƣ sau: Phân bón đƣợc chia làm 3 đợt bón
Đợt 1: 7 ngày sau sạ: bón 1/4 so với tổng lƣợng phân bón
Đợt 2: 30 ngày sau sạ: bón 2/4 so với tổng liều lƣợng phân bón
Đợt 3: 45 ngày sau sạ: bón 1/4 so với tổng số liều lƣợng phân bón. 3.3.8.7 Các chỉ tiêu khảo sát
Các chỉ tiêu phân tích đất Mẫu đất trƣớc khi thí nghiệm - Đo pH
- Phân tích đạm tổng số bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl
- Lân dễ tiêu trong đất theo phƣơng pháp ONIANI
- Chất hữu cơ trong đất bằng phƣơng pháp chuẩn độ Walkley-Black - K trao đổi.
Mẫu đất sau khi thu hoạch lúa
- Phân tích đạm tổng số bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl - Lân dễ tiêu trong đất theo phƣơng pháp ONIANI
- Chất hữu cơ trong đất bằng phƣơng pháp chuẩn độ Walkley-Black Chỉ tiêu về chiều cao cây lúa lúc thu hoạch
- Chiều cao cây đo từ gốc tới chót lá. Các chỉ tiêu thành phần năng suất - Tổng số bông lúa/m2
- Chiều dài bông lúa (cm) - Tổng số hạt lúa chắc/bông - Trọng lƣợng 1000 hạt lúa (g) - Năng suất thực tế (kg/ha)
Chỉ tiêu phẩm chất hạt
- Phân tích hàm lƣợng protein trong hạt gạo bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl
Phƣơng pháp phân tích: Xác định pH đất
pH đất đƣợc đo theo tỉ lệ đất : nƣớc là 1:5 (trọng lƣợng/thể tích). Cân 5g đất cho vào ống, kế đó cho vào 25ml nƣớc cất khuấy đều, sau đó để yên 30-45 phút, đo bằng pH kế. Đọc giá trị pH kế khi giá trị pH ổn định trong 30 giây.
Phân tích hàm lƣợng chất hữu cơ (CHC) trong đất ở các giai đoạn trƣớc khi sạ và sau khi thu hoạch lúa bằng phƣơng pháp chuẩn độ của Walkley – Black.
- Cân 1g đất cho vào bình tam giác đã đƣợc rửa sạch. Dùng ống đong cho vào bình tam giác đã có đất 10ml K2Cr2O7 và 15ml H2SO4 đậm đặc lắc nhẹ cho đất và hóa chất đƣợc trộn lẫn với nhau. Để yên 20-30 phút, sau đó cho thêm 100ml nƣớc cất. Ngay sau khi bắt đầu chuẩn độ thì cho thêm 10ml H3PO4 và 1ml chất chỉ thị màu diphemylamine.
- Chuẩn độ bằng FeSO4 1N cho đến khi dung dịch màu tím mận chuyển sang màu xanh rêu thì dừng. Đây là lúc phản ứng kết thúc. Ghi thể tích trên ống chuẩn độ. Thể tích FeSO4 chính là lƣợng K2Cr2O7 dƣ thừa sau phản ứng oxyt hóa.
- Mẫu đất đối chứng: tất cả các bƣớc đều làm nhƣ mẫu thật nhƣng chỉ khác là khơng có đất. CHC%= W f N V Vo )* *0.3* *1.274 (
Vo (ml): thể tích của FeSO4 khi chuẩn độ mẫu Blank V (ml): thể tích của FeSO4 khi chuẩn độ mẫu thật W (gam): trọng lƣợng đất cân (1g)
N: nồng độ của FeSO4
Hệ số f=100/75=1.33. Nếu giả định phản ứng oxít hóa trên chỉ oxít hóa đƣợc 75% chất hữu cơ trong đất.
Phân tích hàm lƣợng lân dễ tiêu trong đất ở giai đoạn trƣớc khi sạ và sau khi thu hoạch lúa bằng phƣơng pháp Oniani.
- Cân chính xác 1g đất cho vào ống li tâm 50 ml, thêm vào 25 ml H2SO4 0,1N, dùng tay lắc đều, để yên và lọc qua giấy lọc chứa vào chai đựng mẫu.
- Dùng pipet hút từ 1-5 ml dung dịch trích cho vào bình định mức 50 ml, thêm vào 20 ml nƣớc cất, nhỏ 3 giọt phenolphthalein, dùng NaOH 10% nhỏ từng giọt lắc đều cho tới khi dung dịch có màu hồng nhạt, sau đó dùng H2SO4 5% nhỏ 1-2 giọt lắc đều đến khi mất màu. Sau đó thêm vào 8 ml dung dịch B để làm hiện màu, lên thể tích bằng nƣớc cất tới vạch và lắc đều, để yên 10-20 phút đem đo trên máy so màu ở bƣớc