CHƢƠNG II LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU
2.7. Phƣơng pháp giải trình tự DNA
2.7.1 Giải trình tự gen theo phƣơng pháp dideoxy
- Nguyên tắc cơ bản là dựa vào hoạt động của enzyme DNA polymerase trong quá trình tổng hợp DNA. DNA polymerase xúc tác gắn các nucleotid khơng có nhóm 3’OH phản ứng tổng hợp bị dừng lại. Kết quả tạo ra các đoạn oligonucleotid dài ngắn khác nhau một nucleotid.
- Thực hiện bốn phản ứng trong 4 ống eppendorf, mỗi ống có chứa DNA, mồi, bốn loại dNTP có một loại đƣợc đánh dấu phóng xạ (S35
– dATP, dGTP, dCTP, dTTP), enzyme và các điều kiện thích hợp. Ống A thêm 1% ddATP, ống G thêm 1% ddGTP, ống C thêm 1% ddCTP, ống T thêm 1% ddTTP. Sau khi khuếch đại DNA qua
PCR khoảng 25-35 chu kỳ, điện di kết quả thu đƣợc trên gel polyacrylamide. Các đoạn oligonucleotid có kích thƣớc khác nhau di chuyển với tốc độ khác nhau, tạo nên các vị trí khác nhau trên bản gel, thực hiện phản ứng hiện hình phóng xạ có thể quan sát đƣợc các đoạn mạch đơn DNA bằng các vạch trên bản gel. Tổng hợp kết quả phản ứng ở 4 ống thu đƣợc trình tự các nucleotid mạch đơn, có thể biết trình tự các nucleotid trong gen.
- Tùy theo mục đích giữ mẫu, có thể sử dụng đồng vị phóng xạ S35 hoặc P32 để đánh dẫu phóng xạ đoạn mạch khuôn. Sử dụng S35
thời gian mất hoạt tính khoảng 3 tháng, còn P32 khoảng 14 ngày (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.7.2 Giải trình tự gen bằng máy giải trình tự gen tự động
- Nguyên tắc chung: dựa trên cơ sở phƣơng pháp dideoxy. Máy đọc trình tự cả trên hai mạch đơn nên có thể phát hiện và giảm các nhầm lẫn do kỹ thuật. Có hai loại mồi xi và mồi ngƣợc đƣợc sử dụng cho mỗi mạch đơn DNA. Tiến hành biến tính DNA trong mơi trƣờng có urea và nhiệt độ cao (khoảng 55oC), hai mạch đơn DNA tách rời nhau không bắt cặp lại với nhau. Chùm tia laser đánh dấu vị trí và thời gian đi qua các nucleotid, từ đó tổng hợp đƣợc trinhg tự sắp xếp của gen (Khuất Hữu Thanh, 2006).
2.7.3 Phần mềm phân tích trình tự DNA đƣợc giảỉ mã
- Trong những năm gần đây lƣợng thông tin liên quan đến trình tự DNA đƣợc xác định ở các loài sinh vật khác nhau đã đƣợc quản lý dƣới dạng ngân hàng dữ liệu (EMBL ở Châu Âu, GenBank ở Mỹ), có thể dễ dàng truy cập và tải về miễn phí thơng tin trên internet.
- BLAST là một trong những chƣơng trình đƣợc sử dụng rộng rãi nhất trong tin sinh học. BLAST cho phép nhà nghiên cứu tìm kiếm DNA, protein xem đoạn mà ta quan tâm có tƣơng cận với đoạn của sinh vật nào trong ngân hàng gen không, khi đƣợc cung cấp một thƣ viện hay cơ sở dữ liệu các chuỗi đó. Để chạy BLAST cần đầu tƣ hai chuỗi: chuỗi đích và cơ sử dữ liệu chuỗi. Chuỗi đích nhỏ hơn nhiều so với cơ sở dữ liệu.
- Có 5 chƣơng trình BLAST: BLAST N, BLAST P, BLAST S, TBLAST N, TBLAST X, trong đó BLAST N (Nucleotid- Nucleotid BLAST) cho phép so sánh cấu trúc chuỗi nucleotid trong ngân hàng dữ liệu. (Ken, 2002).