CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.6 Giải trình tự mẫu
3.3.6.1 Ly trích DNA của các dịng vi khuẩn Pseudomonas (Wilson, 1997)
- Nuôi vi khuẩn trong ống nghiệm chứa môi trƣờng LB và ủ qua đêm ở 30oC. - Chuyển dung dịch huyền phù vi khuẩn sang tuýp 2 ml và ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Loại bỏ hết dung dịch môi trƣờng ni vi khuẩn có trong tuýp, thêm 250 μl dung dịch TE-pH8 và đánh tan sinh khối. Sau đó cho thêm 50 μl dung dịch SDS 10%.
- Bổ sung thêm 10 μl proteinase K (10 mg/ml) và ủ ở 65oC trong 20 phút. - Thêm 400 μl CTAB 10 %/ NaCl 0,7 M và ủ tiếp ở 65oC trong 20 phút.
- Cho tiếp 600 μl chloroform-isoamyl alcohol vào tuýp và lắc đều. Sau đó ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút.
- Chuyển phần trong bên trên sang tuýp mới, thêm isopropanol với thể tích tƣơng đƣơng, ủ ở -20oC ít nhất 30 phút.
- Ly tâm 12.000 vòng/phút trong 10 phút, đổ nhẹ để loại bỏ nƣớc bên tr ên.
- Rửa DNA với cồn 70%, ly tâm 12.000 vòng/phút trong 5 phút (lặp lại 2 lần).
- Ly tâm chân không ở 45oC trong 5 phút để loại hết cồn còn lại trong tuýp.
- Hòa tan DNA với 30 μl nƣớc cất 2 lần vô trùng. Trữ ở -20oC để thực hiện bƣớc tiếp theo.
3.3.6.2 Phản ứng PCR
Sau khi ly trích DNA của các dịng vi khuẩn, tiến hành phản ứng PCR với cặp mồi sau. Mồi xuôi 8F: 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’. Mồi ngƣợc 1492R: 5’-TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3’
- Thành phần phản ứng PCR gồm: Nƣớc cất hai lần, PCR buffer, MgCl2, dNTPs, hai mồi xuôi và ngƣợc và Taq DNA polymerase.
Bảng 4. Thành phần của phản ứng PCR Hóa chất Số lƣợng (µl) Hóa chất Số lƣợng (µl) Nƣớc cất hai lần 12 PCR buffer 2,5 MgCl2 2 dNTPs 4 Mồi xuôi 1 Mồi ngƣợc 1 BSA 0,25
Taq DNA polymerase 0,25
95oC 95oC 55oC 72oC 72oC 10oC 5’ 1’ 1’ ∞ 35 chu kỳ 1’ 10’
Hình 4: Chu kỳ gia nhiệt của phản ứng PCR
3.3.6.3 Điện di sản phẩm PCR trên gel agarose
Các sản phẩm sau khi đƣợc khuếch đại bằng phản ứng PCR, tiếp tục đem điện di trên gel agarose 1,2% bằng bộ điện di một chiều Embi-Tec (Hoa Kỳ) có bổ sung thêm ethidium bromide (EtBr).
- Chuẩn bị gel agarose: Cân 0,48g agarose cho vào bình tam giác đựng 45ml dung dịch TAE 1X, dùng lị vi sóng đun hỗn hợp này trong 3 phút cho agarose tan hoàn toàn. Lấy ra để nguội tự nhiên khoảng 10 phút (cầm tay đƣợc), bổ sung 1μl ethidium bromide và lắc nhẹ cho đều. Sau đó đổ nhẹ dung dịch agarose vào khn để định hình gel. Khi đổ gel phải đổ dứt khốt để tránh bọt khí làm ảnh hƣởng đến kết quả điện di sản phẩm PCR.
- Đặt gel agarose đã đƣợc định hình vào bể điện di có chứa dung dịch đệm TAE 1X, bơm 10μl mẫu sản phẩm PCR của DNA đã đƣợc trộn đều với 2μl loading buffer vào các giếng trên gel agarose. Tiến hành chạy điện di trên gel ở hiệu điện thế 95 volt trong 60 phút.
- Quan sát các băng (band) DNA trên gel bằng hệ thống chụp hình gel Bio-Rad UV 2000 (Hoa Kỳ) kết hợp với thang chuẩn DNA để ƣớc lƣợng kích thƣớc của băng DNA vi khuẩn trên hình gel chụp đƣợc.
Giải trình tự đoạn DNA và tìm mối tƣơng đồng với dòng vi khuẩn trong ngân hàng gen của NCBI để nhận diện hay định danh chúng bằng phần mềm BLAST N (Nucleotid – Nucleotid BLAST)