CHƢƠNG III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP
3.3 Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.1 Phƣơng pháp thu thập, xử lý mẫu và phân lập các dòng vi khuẩn
3.3.1.1 Thu thập và xử lý mẫu
- Địa điểm thu mẫu: thu mẫu đất vùng rễ ở một số địa điểm ở Đồng Tháp, An Giang, Vĩnh Long, Cần Thơ. Thu mẫu đất tốt nhất vào buổi sáng hoặc xế chiều, ln giữ cho đất có độ ẩm tƣơng đối.
- Cách thu mẫu: nhổ toàn bộ cây (lấy cả phần đất dính xung quanh rễ), giủ sạch đất, mẫu cần thu chính là phần đất đƣợc giủ ra.
3.3.1.2 Phân lập các dòng vi khuẩn
- Cân 10g mẫu đất cho vào 90 ml nƣớc cất vơ trùng trong bình tam giác 250 ml, đậy bình bằng nút gịn và giấy dầu.
- Đem lắc các bình tam giác trên máy lắc trong 30 phút.
- Dùng micropipet P200 hút lần lƣợt 100 μl mẫu nƣớc rồi nhỏ lên đĩa petri có mơi trƣờng phân lập (Pseudomonas isolation agar).
- Dùng que gạt thủy tinh phân phối dịch mẫu trải đều khắp mặt thạch.
- Đĩa môi trƣờng đã trải mẫu đƣợc ủ ở 30oC trong tủ ủ vi sinh vật từ 2- 3 ngày để vi khuẩn phát triển.
- Chọn các khuẩn lạc nghi ngờ (khác nhau về hình dạng, màu sắc, kích thƣớc) từ đĩa mơi trƣờng trên cấy chuyển nhiều lần sang môi trƣờng nhƣ trên đến khi các khuẩn lạc rời ra.
- Tiến hành kiểm tra độ ròng của các dòng vi khuẩn phân lập dƣới kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần. Cách chuẩn bị mẫu vi khuẩn:
o Nhỏ 15 μl nƣớc cất vô trùng lên lame.
o Khử trùng kim cấy trên ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
o Dùng kim cấy lấy một ít khuẩn lạc rồi trải đều lên giọt nƣớc cất vô trùng trên lame.
o Đậy lammen lên giọt huyền phù vi khuẩn bằng cách để một cạnh của lammen tiếp xúc với lame một góc 45° rồi hạ lammen xuống từ từ và nhẹ nhàng sao cho trong mẫu vật khơng có bọt khí.
o Quan sát và kiểm tra độ ròng của mẫu.
- Khi thấy mẫu đã rịng thì cấy chuyển vào ống nghiêng chứa môi trƣờng đặc tƣơng ứng, trữ ở 4oC và đƣợc xem nhƣ là một dòng.