23
Bảng 4. Chu kỳ phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rDNA của vi khuẩn Bƣớc phản ứng Tên bƣớc Số lƣợng chu
kỳ
Nhiệt độ (oC) Thời gian
1 2 3 Biến tính Biến tính Dán mạch Kéo dài Kéo dài 30 30 30 94 94 55 72 72 5 phút 1 phút 1 phút 2 phút 10 phút (Nguồn: chu kỳ phản ứng PCR dựa trên 16S rDNA theo Bennasar et at., 1998) - Cuối cùng đem trữ sản phẩm khuếch đại ở 40C cho đến khi dùng.
Điện di gel chứa sản phẩm phản ứng PCR
Quy trình điện di được thực hiện theo các bước sau: - Bước 1: Đổ gel agarose 1%
Khay được đặt sẵn ở một đầu, đặt khay nơi bằng phẳng và kiểm tra cân bằng, cân 0,2 g agarose cho vào bình có nắp 250 ml, them 20 ml dung dịch TBE 1X, đặt bình vào lị vi sóng, nấu khoảng 2 – 3 phút cho agarose tan hoàn toàn, để nguội khoảng 650C, them 1 µl EthBr lắc đều. Đổ nhẹ vào khay điện di, đợi khoảng 60 – 90 phút mới đem sử dụng.
- Bước 2: Chạy gel
Lấy nhẹ lược ra khỏi khay điện di, đặt vào bể điện di. Hút 10 µl hỗn hợp mẫu PCR trộn với dung dịch loading buffer, nạp mẫu và thang chuẩn vào các giếng trên gel, bật máy điện di với hiệu điện thế 100V, chạy trong khoảng 60 – 90 phút, lấy gel ra khỏi bể điện di và đem chụp hình dưới tia UV, quan sát các band xuất hiện trên gel.
Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng, khơng hiện băng phụ, …
Giải trình tự DNA
Sản phẩm PCR được tinh sạch và gửi mẫu đi giải trình tự ở cơng ty MACROGEN ở Hàn Quốc để có được chuỗi trình tự nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
24
Sử dụng BLAST N
Sử dụng chương trình BLAST N (Nucleotide BLAST) để so sánh trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn đã phân lập với trình tự đoạn gen của các dòng vi khuẩn có trong cơ sở dự liệu NCBI (The National Cether of Biotechnology Information).
o Truy cập vào http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tool/blasttool/nucleotideblast
o Dán trình tự DNA cần nghiên cứu vào hộp Enter Query Sequence
o Tùy chọn các mục ở hộp Choose Search Set
o Có thể tùy chọn các mục ở các hộp Program Selection, General Parameters
o Nhấp chọn BLAST, đợi đến khi xuất hiện kết quả
o Di chuyển đế hộp Descriptions. Chọn đối tượng có trình tự gen tương đồng cao (Max Ident) với trình tự gen của đối tượng đang nghiên cứu
o Lưu ý đến các đối tượng có Max Ident cao, khơng gây bệnh, có nguồn gốc tương tự với đối tượng cần nghiên cứu.
3.2.5. Phân tích quan hệ di truyền
Xây dựng phát sinh lồi (phân tích cây phả hệ) cho các dịng vi khuẩn phân lập theo phương pháp Neighbour-joining (Saitou và Nei, 1987) dựa trên thuật toán dữ liệu ma trận khoảng cách (distance – matrix) bằng phần mềm MEGA 5.0 (Tamura et al., 2011). Các taxa (các thành viên) trong nhánh (cluster) có liên hệ với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap (Felsenstein, 1985). Chỉ số bootstrap (độ tin cậy của sự gần gũi giữa các thành viên trong cùng nhóm của cây phả hệ), chỉ số bootstrap được tính tốn trên cơ sở 1500 lần lặp lại.
25
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu chất thải 4.1. Kết quả thu mẫu chất thải
Quận Ninh Kiều, tp. Cần Thơ có 13 phường, nhưng phần lớn các quán ăn, quán nhậu và nhà hàng tập trung đông tại một số phường như phường Xuân Khánh, Tân An, nhậu và nhà hàng tập trung đông tại một số phường như phường Xuân Khánh, Tân An, An Cư, Hưng Lợi và Cái Khế.
Tổng số mẫu chất thải được thu trong địa bàn quận Ninh Kiều là 8 mẫu. Địa điểm của các quán ăn và nhà hàng được ghi nhận trong bảng 1.
Bảng 5. Danh sách mẫu chất thải đƣợc thu ở các nhà hàng, quán ăn trên địa bàn quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ
Kí hiệu Địa điểm AL B1 Da MT ST TT KN PM
Quán cơm chay Hỷ Lạc, đường 30/4, phường Hưng Lợi
Căn tin B1, trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân Khánh Quán phở Danh, đường Trần Văn Hoài, phường Xuân Khánh
Căn tin khoa Môi Trường, trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân Khánh
Quán nhậu Mẫn, Hồ Sáng Thổi, phường An Cư
Quán cơm chay Thuận Tâm, đường Nguyễn Thái Học, phường Tân An Nhà hàng Cổ Thành Tây Đô, phường Cái Khế
Quán cơm chay Phương Mai, đường Đề Thám, phường An Cư
4.2. Kết quả phân lập vi khuẩn phân giải lipid
Trên tổng số 8 mẫu, sau khi chủng vào môi trường phân lập, lắc ủ trong 3 ngày ở 30 0
C và cấy trải trên môi trường phú dưỡng LB và ủ trong 24h ở 30 0C, dựa trên hình thái và kích thước khuẩn lạc, trung bình mỗi mẫu xuất hiện 3 dạng khuẩn lạc khác nhau.
- 5 dòng vi khuẩn: AL1, KN2, MT8, MT9 và TT3 được tách ròng.
- Trong thời gian phân lập trên môi trường LB, một môi trường phú dưỡng phù hợp cho hầu hết tất cả các loài vi sinh vật sống và phát triển, phát hiện được trên các mẫu có sự hiện diện của nấm men. Từ Các mẫu nấm men được trữ lạnh
26