Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 950C 5 phút Nhân bản (30 chu kỳ) Biến tính Bắt cặp Kéo dài 950C 550C 720C 30 giây 30 giây 1 phút 30 giây Hoàn tất 720C 100C 10 phút Điện di sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên trên gel agarose 1,2% (0,48g agarose trong 40ml TAE 1X) chứa 0,8µl ethidium bromide để kiểm tra chất lƣợng phản ứng PCR. Mẫu DNA đƣợc trộn với 6X loading buffer trƣớc khi load vào giếng. DNA đƣợc điện di trên gel ở 95V trong 45 phút. Sau điện di, gel đƣợc quan sát dƣới tia cực tím (bƣớc sóng 260nm) và đƣợc chụp ảnh để xác định chất lƣợng của DNA. Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng (band), khơng hiện băng phụ, ...
Giải trình tự DNA
Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di, đƣợc giải trình tự tại cơng ty Macrogen ở Hàn Quốc để có đƣợc chuỗi trình tự nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
BLAST N
Sử dụng chƣơng trình BLAST N (Nucleotide BLAST) để so sánh trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn đã phân lập với trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu NCBI (The National Center for Biotechnology Information).
Truy nhập vào http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tool/Blast Tool/ Nucleotide Blast
Dán trình tự DNA cần nghiên cứu vào hộp Enter Query Sequence
Có thể tùy chọn các mục ở các hộp Program Selection, General Parameters,…
Click BLAST, đợi đến khi xuất hiện kết quả
Di chuyển đến hộp Descriptions. Chọn đối tƣợng có trình tự gen tƣơng đồng cao (Max Ident cao) với trình tự gen của đối tƣợng tự đang nghiên cứu
Lƣu ý đến các đối tƣợng có Max Ident cao, khơng gây bệnh, có nguồn gốc tƣơng tự với đối tƣợng cần nghiên cứu
3.3.8. Phân tích quan hệ di truyền
Xây dựng phát sinh lồi (phân tích cây phả hệ) cho các dòng vi khuẩn phân lập theo phƣơng pháp Neighbour - joining (Saitou và Nei, 1987) [hình 10] dựa trên thuật toán dữ liệu ma trận khoảng cách (distance - matrix data) bằng phần mềm MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011). Các taxa (các thành viên) trong nhánh (cluster) có liên hệ với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap (Felsenstein, 1985). Chỉ số bootstrap (độ tin cậy của sự gần gũi giữa các thành viên trong cùng nhóm của cây phả hệ), chỉ số bootstrap đƣợc tính tốn trên cơ sở 1000 lần lặp lại.
Xây dựng phát sinh loài đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Tạo file chứa các trình tự vi khuẩn phân lập và vi khuẩn đƣợc chọn ở bƣớc BLAST bằng công cụ Notepad với chấm đuôi txt
Định dạng fasta với phần mềm BioEdit
Mở file fasta bằng phần mềm MEGA 5.05
Tiến hành Alignment (Align by ClustalW)
Click Data/ phylogenetic analysis
Click phylogeny (vẽ cây phả hệ)
Chọn Construct/ Test neighbor joining tree
Chọn Bootstrap method và 1000 lần lặp lại
Click Compute, chờ xuất hiện cây phả hệ và sử dụng chỉ số bootstrap để đánh giá cây phả hệ.
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu chất thải
Tồn thành phố Cần Thơ có 6 trên 9 quận, huyện đƣợc thu mẫu chất thải ao cá tra và có 8 trên 9 quận đƣợc thu mẫu chất thải trại heo (sau biogas) [bảng 10].
Tổng số mẫu chất thải đƣợc thu trong toàn thành phố Cần Thơ là 29 mẫu (với 14 mẫu chất thải ao cá tra và 15 mẫu chất thải trại heo). Họ tên hộ nuôi cá tra, chăn nuôi heo và địa chỉ chi tiết đƣợc thể hiện qua phụ bảng 1.
Bảng 10. Số mẫu chất thải ao cá tra và trại heo thu đƣợc ở các quận, huyện thuộc
thành phố Cần Thơ
Quận, Huyện Số lƣợng mẫu chất thải ao cá tra Số lƣợng mẫu chất thải trại heo Vĩnh Thạnh 2 2 Cái Răng 1 2 Ơ Mơn 5 2 Bình Thủy 1 2 Cờ Đỏ 1 1 Thốt Nốt 4 2 Thới Lai - 2 Phong Điền - 2
(Số lượng mẫu chất thải được phân phối dựa theo diện tích ni trồng thủy sản và số lượng đàn gia súc của thành phố Cần Thơ cuối năm 2010 được cung cấp bởi Cục Thống kê thành phố Cần Thơ).
4.2. Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong hai loại chất thải
Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ theo từng loại cho từng mẫu chất thải đƣợc thể hiện chi tiết qua phụ bảng 2.
4.2.1.Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chất thải ao cá tra
Hình 10A và phụ lục 1 trình bày mật số từng loại vi khuẩn trung bình và độ lệch chuẩn của 14 mẫu chất thải ao cá tra. Ở các mẫu đều có sự hiện diện của vi khuẩn chuyển hóa nitơ (vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrate).
Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ (tổng mật số từng loại vi khuẩn) khoảng 6,0.105 cfu/ml và mật số giữa các mẫu có sự chênh lệch với nhau (hình 10A).
A.
B.
Hình 10. Mật số từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong 14 mẫu chất thải ao cá
tra (A) và 15 mẫu chất thải trai heo (B)
Giá trị hiển thị: Mật số trung bình ± độ lệch chuẩn
Vi khuẩn T là vi khuẩn phát triển trên môi trường T (chứa ammonium, nitrite, nitrate) Vi khuẩn O2 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrite
Vi khuẩn O3 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrate Vi khuẩn H4 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa ammonium
4.2.1.Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chất thải trại heo
Tƣơng tự ở chất thải ao cá tra, trong 15 mẫu chất thải trại heo đều có sự hiện diện của từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Hình 10B và phụ lục 2 trình bày mật số từng loại vi khuẩn và độ lệch chuẩn.
Hình 10B cho thấy mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong mẫu chất thải trại heo khoảng 106
cfu/ml và mật số giữa các mẫu cũng có sự chênh lệch với nhau.
Nhƣ vậy qua khảo sát mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ cho thấy trong mẫu chất thải ao cá tra và trại heo có sự hiện diện của vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrte. Nên có thể sử dụng cả hai loại chất thải này làm nguồn vật liệu phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ.
4.3. Giá trị pH của hai loại chất thải
Giá trị pH của các mẫu chất thải ao cá tra và trại heo đƣợc trình bày chi tiết trong phụ bảng 3. Hình 11 trình bày giá trị pH trung bình của chất thải ao cá tra và trại heo.
Giá trị pH của chất thải ao cá tra dao động trong khoảng 6,2 – 7,0; sự chênh lệch giữa các mẫu thấp (phụ lục 3). Ngun nhân do nơng dân sử dụng hóa chất (vơi) để duy trì giá trị pH thích hợp cho cá tra trong q trình ni.
Giá trị pH của chất thải trại heo dao động trong khoảng 5,0 – 7,0; sự chênh lệch giữa các mẫu cao (hình 11 và phụ lục 3). Các mẫu chất thải trại heo có pH khoảng trung tính điều này phù hợp với nghiên cứu của Patil et al. (2010) ở Úc [pH: 6,6 – 7,2]; Dy (2004) ở Hàn Quốc [pH: 7,1 – 8,9] và Sun et al. (2012) ở Hangzhou – Trung Quốc [pH: 6,4 – 7,0].
Hình 11. Giá trị pH trung bình của chất thải ao cá tra và trại heo
Giá trị pH có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng. Hay pH có sự tác động đến mật số khuẩn chuyển hóa nitơ trong các mẫu chất thải, thể hiện qua hệ số tƣơng quan (r). Qua hình 12A và 12B cho thấy mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và pH có sự tƣơng quan chặc chẽ với nhau (mức ý nghĩa 1%).
A. B.
Hình 12. Tƣơng quan có ý nghĩa ở mức 1% giữa mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và
giá trị pH trong mẫu chất thải ao cá tra (A) và trong mẫu chất thải trại heo (B)
** Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và pH có sự tương quan với nhau ở mức ý nghĩa 1%.
Theo Villaverde et al. (1997) giá trị pH có 3 ảnh hƣởng lớn đến vi khuẩn chuyển hóa nitơ: (1) hoạt hóa hay ức chế vi khuẩn chuyển hóa nitơ, (2) ảnh hƣởng đến dinh dƣỡng của vi khuẩn, (3) ức chế vi khuẩn thông qua nồng độ NH3 và HNO2.
Thật vậy, theo Gerardi (2002) pH thích hợp cho sự chuyển hóa nitơ là 7 – 8,5. Anthonisen et al. (1976) sử dụng pH 7,5 – 8,5; Eum và Choi (2006) sử dụng pH lớn hơn 8,0; Su et al. (2006) sử dụng pH 7,5 để tối ƣu sự chuyển hóa nitơ trong chất thải trại heo. Chen et al. ( 2006) sử dụng pH 7,0 – 8,8 để tối ƣu sự chuyển hóa nitơ trong chất thải nuôi trồng thủy sản.
4.4. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Bốn trăm lẻ chín dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ 29 mẫu chất thải ao cá tra và trại heo. Số lƣợng theo loại vi khuẩn, loại chất thải và địa điểm thu mẫu đƣợc trình bày ở phụ bảng 4.
Từ 14 mẫu chất thải ao cá tra, 218 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập và 191 dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ 15 mẫu chất thải trại heo. Số lƣợng từng loại vi khuẩn và tỉ lệ phần trăm tƣơng ứng đƣợc trình bày ở bảng 11. Tổng cộng có 102 dịng
vi khuẩn T, 110 dòng vi khuẩn O2, 110 dòng vi khuẩn O3 và 97 dòng vi khuẩn H4. Tỉ lệ phần trăm từng loại vi khuẩn tƣơng đƣơng nhau.
Bảng 11. Số dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ hai loại chất thải
Loại vi khuẩn Số dòng Tỉ lệ phần trăm
Phân lập từ chất thải ao cá tra
Vi khuẩn T 54 24,8
Vi khuẩn O2 61 28,0
Vi khuẩn O3 54 24,8
Vi khuẩn H4 49 22,5
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ 218 100,0
Phân lập từ chất thải trại heo
Vi khuẩn T 48 24,8
Vi khuẩn O2 49 28,0
Vi khuẩn O3 46 24,8
Vi khuẩn H4 48 22,5
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ 191 100,0
Vi khuẩn T là vi khuẩn phát triển trên môi trường T (chứa ammonium, nitrite, nitrate) Vi khuẩn O2 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrite
Vi khuẩn O3 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrate Vi khuẩn H4 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa ammonium Vi khuẩn chuyển hóa nitơ là tổng các loại vi khuẩn T, O2, O3 và H4
4.5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các dịng vi khuẩn phân lập
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của từng dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ hai loại chất thải đƣợc trình bày chi tiết trong phụ bảng 5.
4.5.1. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Số lƣợng từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua bảng 12. Tỉ lệ phần trăm từng đặc điểm khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua hình 13.
Hình 13 cho thấy các đặc điểm chiếm tỉ lệ cao nhƣ sau: 98,6% khuẩn lạc dạng tròn; 70,2% khuẩn lạc màu trắng đục; 80,3% bìa ngun; 70,6% mơ; 70,2% bề mặt trơn láng; 57,8% đƣờng kính 0,5 – 1,0mm.
Hình 15 trình bày đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra. Các dòng vi khuẩn phân lập từ loại chất thải này chủ yếu có khuẩn lạc hình trịn, màu trắng đục hay trắng trong, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn láng và đƣờng kính 0,5 – 1,0 mm.
4.5.2. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Số lƣợng từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải trại heo tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua bảng 13. Tỉ lệ phần trăm từng đặc điểm khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua hình 14.
Hình 14 cho thấy các đặc điểm chiếm tỉ lệ cao nhƣ sau: dạng tròn chiếm 99,0%, trắng đục chiếm 66,0%, bìa ngun chiếm 84,3%, mơ chiếm 79,6%, trơn láng chiếm 75,9%, đƣờng kính 0,5 – 1,0 mm chiếm 60,2%.
Hình 16 trình bày hình thái khuẩn lạc của một số dòng vi khuẩn đƣợc phân lập từ chất thải trại heo. Các dòng vi khuẩn phân lập từ loại chất thải này cũng tƣơng tự nhƣ từ chất thải ao cá tra. Khuẩn lạc của chúng chủ yếu có hình trịn, trắng đục hay trắng trong, ngun, mơ, trơn láng và đƣờng kính 0,5 – 1,0 mm.
Bảng 12. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Đặc điểm khuẩn lạc Vi khuẩn T Vi khuẩn O2 Vi khuẩn O3 Vi khuẩn H4
Màu sắc Trắng đục 14 17 15 12 Trắng trong 37 43 36 37 Vàng nhạt 3 1 3 0 Hình dạng Trịn 53 60 54 48 Không đều 1 1 0 1 Dạng bìa Nguyên 41 54 46 34 Răng cƣa 13 7 8 15 Độ nổi Mô 38 44 45 27 Lài 16 17 9 22 Bề mặt Trơn láng 35 48 40 34 Nhám 12 10 9 13 Nhớt 7 3 5 2 Kích thƣớc (mm) < 0,5 14 9 11 8 0,5 – 1,0 27 38 32 29 >1,0 13 14 11 12
(Các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập được mơ tả đặc điểm hình dạng, màu sắc, dạng bìa, độ nổi, bề mặt và kích thước của khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 300C trên môi trường phân lập).
Bảng 13. Đặc điểm khuẩn lạc của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Đặc điểm khuẩn lạc Vi khuẩn T Vi khuẩn O2 Vi khuẩn O3 Vi khuẩn H4
Màu sắc Trắng đục 19 17 13 14 Trắng trong 28 32 32 34 Vàng nhạt 1 0 1 0 Hình dạng Tròn 48 48 45 48 Không đều 0 1 1 0 Dạng bìa Nguyên 40 44 38 39 Răng cƣa 8 5 8 9 Độ nổi Mô 34 41 37 40 Lài 14 8 9 8 Bề mặt Trơn láng 39 40 35 31 Nhám 5 6 10 10 Nhớt 4 3 1 6 Kích thƣớc (mm) < 0,5 16 14 12 14 0,5 – 1,0 26 29 30 30 >1,0 6 6 4 4
(Các dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập được mơ tả đặc điểm hình dạng, màu sắc, dạng bìa, độ nổi, bề mặt và kích thước của khuẩn lạc sau 48 giờ ủ ở 300C trên mơi trường phân lập).
Hình 13. Tỉ lệ phần trăm đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ
chất thải ao cá tra
Hình 14. Tỉ lệ phần trăm đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ
Hình 15. Khuẩn lạc một số dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải
ao cá tra
(Khuẩn lạc được mô tả sau 48 giờ phát triển ở 300C trên mơi trường phân lập. Các dịng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra chủ yếu có khuẩn lạc hình trịn, màu trắng đục hay trắng trong, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn láng và đường kính 0,5 – 1,0 mm).
Hình 16. Khuẩn lạc một số dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải
trại heo
(Khuẩn lạc được mô tả sau 48 giờ phát triển ở 300C trên mơi trường phân lập. Các dịng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra chủ yếu có khuẩn lạc hình trịn, màu trắng đục hay trắng trong, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn láng và đường kính 0,5 – 1,0 mm).
1,0 mm
4.6. Đặc điểm hình thái tế bào các dòng vi khuẩn phân lập
Đặc điểm tế bào của 409 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ 29 mẫu chất thải đƣợc trình bày chi tiết trong phụ bảng 5.
4.6.1. Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Bảng 14 trình bày số dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ chất thải ao cá tra tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái tế bào. Hình 17 trình bày tỉ lệ phần trăm từng đặc điểm tế bào vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ chất thải ao cá tra.
Bảng 14. Đặc điểm tế bào của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Đặc điểm tế bào Vi khuẩn T Vi khuẩn O2 Vi khuẩn O3 Vi khuẩn H4
Que ngắn 54 61 52 48 Que dài 0 0 2 1 Riêng lẻ 49 54 45 40 Liên kết 5 7 9 9 Di động 47 41 45 28 Bất động 7 20 9 21
Bảng 14 và hình 17 cho thấy trong 218 dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra; các đặc điểm que ngắn, tồn tại riêng lẻ và di động chiếm số lƣợng lớn ở cả bốn loại vi khuẩn phân lập. Tế bào có dạng que ngắn - riêng lẻ - di động chiếm tỉ lệ cao nhất (72,5%).
4.6.2. Đặc điểm tế bào vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Bảng 15 trình bày số dịng vi khuẩn phân lâp từ chất thải trại heo tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái tế bào. Hình 18 trình bày tỉ lệ phần trăm đặc điểm tế bào vi khuẩn chuyển hóa nitơ phân lập từ chất thải trại heo.
Bảng 15. Đặc điểm tế bào của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo