Chƣơng III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.2. Phƣơng tiện nghiên cứu
3.2.1. Nguyên vật liệu
Mẫu chất thải ao nuôi cá tra công nghiệp (bùn đáy, nƣớc) và chất thải sau biogas của trại chăn nuôi heo đƣợc thu ở một số quận, huyện thuộc thành phố Cần Thơ. Cụ thể nhƣ các quận Ơ Mơn, Bình Thủy, Cái Răng, Thốt Nốt và các huyện nhƣ Vĩnh Thạnh, Cờ Đỏ, Phong Điền và Thới Lai.
3.2.2. Dụng cụ, thiết bị
Dụng cụ
Dụng cụ thu và trữ mẫu chất thải
o Dụng cụ thu mẫu bùn
o Keo nhựa, …
Dụng cụ phân lập, nuôi cấy vi khuẩn
o Đĩa petri
o Ống nghiệm
o Que cấy
Dụng cụ pha chế mơi trƣờng o Bình tam giác o Ống đong, cốc đong (10ml, 100ml, 500ml, …) Các dụng cụ khác o Micropipette (P20, P50, P200, P1000) [Gibson - Đức] o Eppendorf o Lame, lamelle, … Thiết bị
Thiết bị dùng trong phân lập vi khuẩn
o Tủ an toàn sinh học (Esco - Singapore)
o Tủ ủ (Binder - Đức)
o Nồi khử trùng nhiệt ƣớt (Pbinternational - Đức, Tuttnauer - Đức)
o Cân điện tử cấp chính xác 0,001g (Sartorius - Đức)
o Cân điện tử cấp chính xác 0,01g (Shimadzu - Nhật Bản)
o Kính hiển vi (Olympus - Nhật Bản)
o Máy đo pH (Eutech – Malaysia)
o Máy lắc vòng
o Máy khuấy từ
o Máy vortex
Thiết bị dùng trong trích DNA và PCR
o Máy li tâm (Heraus - Đức)
o Bộ điện di (BioRad - Mỹ)
o Máy đọc và chụp ảnh gel (BioRad - Mỹ)
o Máy PCR (Perkin Elmer - Mỹ, BioRad - Mỹ)
o Máy sấy chân không
3.2.3. Hóa chất
Hóa chất pha môi trƣờng: NaCl, Na2HPO4.12H2O, KH2PO4, vi lƣợng (MgSO4.7H2O, MnSO4, H3BO3, FeSO4.7H2O, CaCl2), NH4Cl, NaNO2, NaNO3, glucose, agar (theo Zhao et al., 2010).
Hóa chất ly trích DNA: LB (Laura Bertani medium); TE (pH = 8); SDS
10%; proteinase K (10mg/ml); CTAB 10% 0,7M NaCl; Chloroform: Isoamylalcohol (24:1); Isopropanol; ethanol 70%; nƣớc cất 2 lần khử ion (theo Breugelmans và Uyttebroek, 2004).
Hóa chất dùng trong phản ứng PCR: PCR buffer [10X Taq buffer
(NH4)2SO4], polymerisation MgCl2 (25mM), dNTPs, BSA (10 mg/ml),
Taq DNA polymerase (500u, 5 u/μl), nƣớc cất 2 lần khử ion.
Hóa chất dùng trong điện di sản phẩm PCR: agarose, TAE buffer 1X,
loading buffer, ethidium bromide, thang chuẩn 100bp plus.
Thu và bảo quản mẫu chất thải
Phân tích mẫu chất thải
(Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ, pH)
Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mơ tả đặc điểm khuẩn lạc và tế bào các dòng phân lập
Khảo sát khả năng chuyển hóa và tuyển chọn các dịng có khả năng cao
Nhận diện vi khuẩn đƣợc chọn
(Trích DNA, PCR, giải trình tự, BLAST N)
Phân tích phát sinh lồi các dịng vi khuẩn đƣợc nhận diện