Chƣơng III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.4. Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mơi trường phân lập
Sử dụng bốn loại mơi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (hay cịn gọi là mơi trƣờng phân lập) theo nghiên cứu của Zhao et al. (2010), có thành phần hóa chất chi tiết nhƣ ở bảng 4.
Với môi trƣờng minimal bổ sung nitrite đƣợc gọi là môi trƣờng O2; bổ sung nitrate gọi là môi trƣờng O3; bổ sung ammonium đƣợc gọi là môi trƣờng H4 và môi trƣờng bổ sung cả nitrite, nitrate và ammonium đƣợc gọi là môi trƣờng T. Môi trƣờng sau khi pha chế đƣợc vô trùng ở 1210C trong 20 phút, sau đó đƣợc phân bố vào đĩa petri hay ống nghiệm.
Môi trƣờng H4 là môi trƣờng phân lập vi khuẩn oxi hóa ammonium. Mơi trƣờng O2 là mơi trƣờng phân lập vi khuẩn khử nitrite. Môi trƣờng O3 là môi trƣờng phân lập vi khuẩn khử nitrate. Môi trƣờng T là mơi trƣờng phân lập vi khuẩn có khả năng oxi hóa ammonium, khử nitrite, nitrate.
Bảng 4. Thành phần mơi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Đơn vị tính: g (ml)/L
Hóa chất Mơi trƣờng O2 Môi trƣờng O3 Môi trƣờng H4 Môi trƣờng T
NH4Cl - - 0,12 0,12 NaNO3 - 0,04 - 0,04 NaNO2 0,04 - - 0,04 NaCl 4,0 4,0 4,0 4,0 Na2HPO4.12H2O 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 0,9 0,9 0,9 0,9 Vi lƣợng* 3,0 3,0 3,0 3,0 Glucose 1,0 1,0 3,0 2,0 Agar 20 20 20 20
* Vi lƣợng (1 Lít): MgSO4.7H2O (0,3 g), MnSO4 (0,1 g), H3BO3 (0,112 g), FeSO4.7H2O (0,03 g),
CaCl2 (0,06 g).
Môi trường O2: Môi trường bổ sung nitrite Môi trường O3: Môi trường bổ sung nitrate Môi trường H4: Môi trường bổ sung ammonium
Môi trường T: Môi trường bổ sung nitrite, nitrate và ammonium
Kỹ thuật tách ròng vi khuẩn
Trong phân lập, vi khuẩn cần đƣợc tách rời từng tế bào và phát triển thành khuẩn lạc độc lập. Tế bào vi khuẩn đƣợc tách rời bằng kỹ thuật cấy ria tách rịng (hình 8).
Từ mẫu nƣớc thải trại heo (sau biogas), chất thải ao cá tra (đã trộn nƣớc và bùn), lắc đều, pha lỗng ở nồng độ thích hợp và hút 50µl trải lên đĩa mơi trƣờng phân lập, ủ đĩa ở 300
C trong 48 giờ.
Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc rời rạc và có đặc điểm hình thái khác nhau. Dùng que cấy vòng chấm nhẹ lên một khuẩn lạc, cấy ria sang một đĩa mới, ủ đĩa ở 300
C trong 48 giờ.
Tiến hành cấy chuyển lần 2, chọn một khẩn lạc rời giữa ba khuẩn lạc đồng nhất cấy ria sang một đĩa mới, ủ đĩa ở 300C trong 48 giờ. Cấy chuyển vài lần đến khi thấy toàn bộ các khuẩn lạc đồng nhất. Tiến hành trữ trong ống thạch nghiêng ở 2 – 80C.
Hình 8. Kỹ thuật cấy ria tách rịng.
Qui ước mã hóa các dịng vi khuẩn phân lập từ hai loại chất thải
Các dòng vi khuẩn sẽ đƣợc mã hóa để tiện theo dõi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Các dịng đƣợc mã hóa nhƣ sau: A.B1
Với A là loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ; A có thể là H4 – vi khuẩn oxi hóa ammonium, O2 – khử nitrite, O3 – khử nitrate và T – có khả năng oxi hóa ammonium, khử nitrite, nitrate. B là loại chất thải; B có thể là T - chất thải ao cá tra, H – chất thải trại heo. 1 là số thứ tự của dòng vi khuẩn tương ứng với loại
chuyển hóa và loại mơi trường. Ví dụ: O3.T27, đây là dịng vi khuẩn khử nitrate thứ 27 phân lập từ chất thải ao cá tra.
Kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép
Khử trùng lame và lamelle bằng cồn 960, làm khô trên ngọn lửa đèn cồn, hút khoảng 25l nƣớc cất vô trùng nhỏ lên lame. Vô trùng que cấy lấy một sinh khối vi khuẩn trong ống trữ trải đều trong giọt nƣớc cât trên lame.
Đậy giọt nƣớc cất chứa vi khuẩn bằng lamelle. Quan sát dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Mẫu rịng khi tất cả các tế bào vi khuẩn đều đồng dạng về hình dạng, kiểu chuyển động.
Mơ tả hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn
Các dịng vi khuẩn đã rịng đƣợc cấy lên đĩa mơi trƣờng phân lập, ủ ở 30ºC trong 48 giờ để mô tả đặc điểm khuẩn lạc. Khuẩn lạc đƣợc mơ tả về hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa, bề mặt và đƣờng kính. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần để mơ tả dạng tế bào, khả năng chuyển động.