Chƣơng III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.7. Nhận diện vi khuẩn
Ly trích DNA vi khuẩn
Q trình ly trích DNA vi khuẩn đƣợc thực hiện theo Breugelmans và Uyttebroek (2004). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Vi khuẩn đƣơc ni lắc qua đêm (120 vịng/ phút) ở nhiệt độ phịng trong 5ml
mơi trƣờng LB (Lauria Bertani).
Ly tâm dịch ni vi khuẩn 13.000 vịng/ phút trong 5 phút Loại bỏ phần nƣớc, thu phần cặn (sinh khối)
Hịa tan cặn bằng 250µl TE (pH = 8)
Thêm 50 µl SDS 10%, thêm tiếp 10µl proteinase K (10mg/ml) Ủ hỗn hợp ở 650C trong 20 phút, 5 phút đảo ngƣợc tuýp 1 lần
Thêm vào 400µl CTAB 10% 0,7M NaCl Tiếp tục ủ ở 650
C trong 20 phút
Thêm vào 600µl Chloroform: Isoamylalcohol (24:1)
Đảo ngƣợc tuýp vài lần trƣớc khi ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút Chuyển 500µl phần dịch trong phía trên sang tuýp mới (thao tác hút cẩn thận
tránh làm vỡ màng ngăn giữa DNA và protein)
Thêm vào 1ml Isopropanol, lắc đều. Giữ tuýp ở -200C ít nhất 30 phút
Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng trong 10 phút Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại phần cặn (DNA) DNA đƣợc rửa với 1ml ethanol 70%
Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 5 phút. Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại
Tiếp tục rửa DNA với 1ml ethanol 70%, ly tâm và giữ lại phần cặn nhƣ ở trên Sấy chân không ở 450C trong 15 phút
Hịa tan DNA trong 30µl nƣớc cất 2 lần khử ion, trữ DNA ở -200C để sử dụng.
Khuếch đại trình tự 16S rDNA
Sử dụng DNA của các dịng vi khuẩn làm khn trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi tổng 8F - 1492R (Turner et al., 1999) [bảng 7] và có thành phần, chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 8 và 9.
Phản ứng PCR cho ra sản phẩm là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1.500bp, chúng là các đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
Bảng 7. Trình tự cặp mồi tổng 8F - 1492R (nguồn: Turner et al., 1999)
Primer Trình tự Sản phẩm
8F 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’
1.500bp 1492R 5’ - TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’
Bảng 8. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với thể tích 50µl
Thành phần Nồng độ Thể tích Nƣớc cất 2 lần khử ion 24µl Buffer + (NH4)2SO4 10X 5µl MgCl2 25mM 4µl dNTPs 2mM 8µl Mồi xi 8F 2,5µM 2µl Mồi ngƣợc 1492R 2,5µM 2µl BSA 10mg/ml 0,5µl
Taq DNA polymerase 5u/µl 0,5µl
Bảng 9. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16s rDNA
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 950C 5 phút Nhân bản (30 chu kỳ) Biến tính Bắt cặp Kéo dài 950C 550C 720C 30 giây 30 giây 1 phút 30 giây Hoàn tất 720C 100C 10 phút Điện di sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên trên gel agarose 1,2% (0,48g agarose trong 40ml TAE 1X) chứa 0,8µl ethidium bromide để kiểm tra chất lƣợng phản ứng PCR. Mẫu DNA đƣợc trộn với 6X loading buffer trƣớc khi load vào giếng. DNA đƣợc điện di trên gel ở 95V trong 45 phút. Sau điện di, gel đƣợc quan sát dƣới tia cực tím (bƣớc sóng 260nm) và đƣợc chụp ảnh để xác định chất lƣợng của DNA. Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng (band), không hiện băng phụ, ...
Giải trình tự DNA
Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di, đƣợc giải trình tự tại cơng ty Macrogen ở Hàn Quốc để có đƣợc chuỗi trình tự nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
BLAST N
Sử dụng chƣơng trình BLAST N (Nucleotide BLAST) để so sánh trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn đã phân lập với trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu NCBI (The National Center for Biotechnology Information).
Truy nhập vào http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tool/Blast Tool/ Nucleotide Blast
Dán trình tự DNA cần nghiên cứu vào hộp Enter Query Sequence
Có thể tùy chọn các mục ở các hộp Program Selection, General Parameters,…
Click BLAST, đợi đến khi xuất hiện kết quả
Di chuyển đến hộp Descriptions. Chọn đối tƣợng có trình tự gen tƣơng đồng cao (Max Ident cao) với trình tự gen của đối tƣợng tự đang nghiên cứu
Lƣu ý đến các đối tƣợng có Max Ident cao, khơng gây bệnh, có nguồn gốc tƣơng tự với đối tƣợng cần nghiên cứu