3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
Quá trình nghiên cứu đƣợc thực hiện tuần tự theo sơ đồ hình 6. 3.3.1. Thu và bảo quản mẫu chất thải
Mẫu chất thải ao cá tra và trại heo (sau biogas) đƣợc thu từ các trại chăn nuôi heo trong địa bàn các quận, huyện ở thành phố Cần Thơ. Số lƣợng mẫu đƣợc phân phối dựa theo “diện tích ni trồng thủy sản và số lƣợng đàn gia súc” từ Cục Thống kê thành phố Cần Thơ (2010).
Thu mẫu chất thải trại heo (sau biogas)
Mẫu chất thải đƣợc thu ở đầu ra (sau biogas) của hệ thống hầm ủ hoặc túi ủ biogas ở các trại heo. Đầu tiên tráng dụng cụ chứa bằng chất thải hứng đƣợc từ ống thải, sau đó hứng lấy chất thải, đậy nắp, ghi nhãn, trữ lạnh, mang về phịng thí nghiệm và bảo quản.
Thu mẫu chất thải ao nuôi cá tra
Chỉ thu mẫu ở các ao cá tra đã đƣợc ni hơn 3 tháng vì giai đoạn này xuất hiện tình trạng ơ nhiễm ammonia do thức ăn thừa đƣợc vi sinh vật phân hủy. Mỗi ao cá tra đƣợc thu 2 loại mẫu (nƣớc và bùn).
(1) Mẫu nƣớc: tráng dụng cụ chứa bằng nƣớc ao thu mẫu, đậy nắp, ấn dụng cụ chứa xuống dƣới mặt nƣớc khoảng 0,2 – 0,3m; cách bờ khoảng 2 – 3m; mở nắp dụng cụ chứa cho nƣớc chảy vào từ từ, khi thấy khơng có bọt khí nổi lên tức là nƣớc đã vào đầy, đậy nắp, ghi nhãn và bảo quản.
(2) Mẫu bùn: bùn đáy ao đƣợc thu bằng dụng cụ lấy mẫu bùn, cho vào dụng cụ chứa, đậy nắp, ghi nhãn, trữ lạnh và mang về phịng thí nghiệm và bảo quản.
Bảo quản mẫu
Do không thể phân lập tất cả các mẫu chất thải thu đƣợc cùng một lúc nên các mẫu chất thải đƣợc bảo quản trong ngăn mát tủ lạnh (2 – 80C) tại phịng thí nghiệm.
Mẫu chất thải đƣợc mã hóa nhƣ sau: X.Y1
Với: X – loại mẫu chất thải; X có thể là CT (chất thải ao cá tra) hay TH (chất thải trại heo). Y – tên viết tắt của quận, huyện; Y có thể là CD (huyện Cờ Đỏ), PD (huyện Phong Điền), OM (quận Ơ Mơn),… 1 – Số thứ tự của mẫu theo
từng quận, huyện. Ví dụ: CT.TN1 là mẫu chất thải ao cá tra thứ nhất của quận Thốt Nốt.
3.3.2. Phân tích mẫu chất thải
Các mẫu chất thải đƣợc phân tích 2 chỉ tiêu pH và mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ [vi khuẩn oxi hóa ammonium, vi khuẩn khử nitrite, vi khuẩn khử nitrate và vi khuẩn T (vi khuẩn phát triển đƣợc trên môi trƣờng chứa cả ammonium, nitrite và nitrate)].
Xác định pH
Đo pH các mẫu chất thải bằng máy đo pH (Eutech – Malaysia). Các mẫu chất thải đƣợc lắc đều trƣớc khi đo. Riêng mẫu chất thải cá tra đƣợc lắc đều nƣớc và bùn cùng địa điểm theo tỉ lệ 1:1 (5g bùn: 5ml nƣớc).
Xác định mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mật số tế bào vi khuẩn đƣợc xác định bằng phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt (drop plate) theo Hoben và Somasegaran (1982) dựa vào sự hình thành khuẩn lạc trên môi trƣờng phân lập chứa agar (thành phần môi trƣờng nhƣ bảng 4).
Phƣơng pháp gồm các cơng đoạn: pha lỗng, nhỏ giọt, đếm khuẩn lạc và tính kết quả (hình 7).
Hình 7. Pha lỗng và nhỏ giọt trong phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt
10-2 10-3 10-4 10-2 10-3 10-4
Tiến trình thực hiện nhƣ sau:
Lắc đều mẫu chất thải trại heo hay hỗn hợp chất thải ao cá tra (hỗn hợp gồm
5g bùn và 5ml nƣớc), hút 1ml chất thải cho vào 99ml nƣớc cất vô trùng (vô trùng ở 1210C trong 20 phút), lắc đều thu đƣợc dịch pha loãng 102.
Lắc đều dịch pha loãng 102, hút 1ml cho vào 9ml nƣớc cất vô trùng, lắc đều thu đƣợc dịch pha loãng 103. Thực hiện tƣơng tự cho độ pha loãng tiếp theo.
Lắc đều các dịch pha loãng. Ở mỗi độ pha loãng, hút 20l nhỏ giọt lên đĩa
petri chứa môi trƣờng phân lập, hút 3 lần (tƣơng ứng với 3 giọt). Ủ đĩa ở 300C trong 48 giờ.
Sau khi ủ, chọn đĩa petri với độ pha lỗng có số lƣợng khuẩn lạc rời có thể
đếm đƣợc.
Tiến hành đếm số khuẩn lạc và tính kết quả theo cơng thức:
Mật số tế bào vi khuẩn = n
v.D (cfu/ml)
(n - Số khuẩn lạc trung bình trên một giọt. v - Thể tích mỗi giọt dịch mẫu được nhỏ giọt. D – Độ pha loãng)
3.3.3. Phƣơng pháp xử lý số liệu
Số liệu phân tích đƣợc xử lý bằng phƣơng pháp thống kê mô tả (Descriptive Statistics).
3.3.4. Phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Mơi trường phân lập
Sử dụng bốn loại mơi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ (hay cịn gọi là mơi trƣờng phân lập) theo nghiên cứu của Zhao et al. (2010), có thành phần hóa chất chi tiết nhƣ ở bảng 4.
Với môi trƣờng minimal bổ sung nitrite đƣợc gọi là môi trƣờng O2; bổ sung nitrate gọi là môi trƣờng O3; bổ sung ammonium đƣợc gọi là môi trƣờng H4 và môi trƣờng bổ sung cả nitrite, nitrate và ammonium đƣợc gọi là môi trƣờng T. Môi trƣờng sau khi pha chế đƣợc vô trùng ở 1210C trong 20 phút, sau đó đƣợc phân bố vào đĩa petri hay ống nghiệm.
Môi trƣờng H4 là mơi trƣờng phân lập vi khuẩn oxi hóa ammonium. Mơi trƣờng O2 là môi trƣờng phân lập vi khuẩn khử nitrite. Môi trƣờng O3 là môi trƣờng phân lập vi khuẩn khử nitrate. Môi trƣờng T là mơi trƣờng phân lập vi khuẩn có khả năng oxi hóa ammonium, khử nitrite, nitrate.
Bảng 4. Thành phần môi trƣờng phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Đơn vị tính: g (ml)/L
Hóa chất Mơi trƣờng O2 Môi trƣờng O3 Môi trƣờng H4 Môi trƣờng T
NH4Cl - - 0,12 0,12 NaNO3 - 0,04 - 0,04 NaNO2 0,04 - - 0,04 NaCl 4,0 4,0 4,0 4,0 Na2HPO4.12H2O 21,5 21,5 21,5 21,5 KH2PO4 0,9 0,9 0,9 0,9 Vi lƣợng* 3,0 3,0 3,0 3,0 Glucose 1,0 1,0 3,0 2,0 Agar 20 20 20 20
* Vi lƣợng (1 Lít): MgSO4.7H2O (0,3 g), MnSO4 (0,1 g), H3BO3 (0,112 g), FeSO4.7H2O (0,03 g),
CaCl2 (0,06 g).
Môi trường O2: Môi trường bổ sung nitrite Môi trường O3: Môi trường bổ sung nitrate Môi trường H4: Môi trường bổ sung ammonium
Môi trường T: Môi trường bổ sung nitrite, nitrate và ammonium
Kỹ thuật tách ròng vi khuẩn
Trong phân lập, vi khuẩn cần đƣợc tách rời từng tế bào và phát triển thành khuẩn lạc độc lập. Tế bào vi khuẩn đƣợc tách rời bằng kỹ thuật cấy ria tách rịng (hình 8).
Từ mẫu nƣớc thải trại heo (sau biogas), chất thải ao cá tra (đã trộn nƣớc và bùn), lắc đều, pha lỗng ở nồng độ thích hợp và hút 50µl trải lên đĩa mơi trƣờng phân lập, ủ đĩa ở 300
C trong 48 giờ.
Khi vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc, chọn những khuẩn lạc rời rạc và có đặc điểm hình thái khác nhau. Dùng que cấy vòng chấm nhẹ lên một khuẩn lạc, cấy ria sang một đĩa mới, ủ đĩa ở 300
C trong 48 giờ.
Tiến hành cấy chuyển lần 2, chọn một khẩn lạc rời giữa ba khuẩn lạc đồng nhất cấy ria sang một đĩa mới, ủ đĩa ở 300C trong 48 giờ. Cấy chuyển vài lần đến khi thấy toàn bộ các khuẩn lạc đồng nhất. Tiến hành trữ trong ống thạch nghiêng ở 2 – 80C.
Hình 8. Kỹ thuật cấy ria tách rịng.
Qui ước mã hóa các dịng vi khuẩn phân lập từ hai loại chất thải
Các dòng vi khuẩn sẽ đƣợc mã hóa để tiện theo dõi trong suốt q trình thực hiện đề tài. Các dịng đƣợc mã hóa nhƣ sau: A.B1
Với A là loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ; A có thể là H4 – vi khuẩn oxi hóa ammonium, O2 – khử nitrite, O3 – khử nitrate và T – có khả năng oxi hóa ammonium, khử nitrite, nitrate. B là loại chất thải; B có thể là T - chất thải ao cá tra, H – chất thải trại heo. 1 là số thứ tự của dòng vi khuẩn tương ứng với loại
chuyển hóa và loại mơi trường. Ví dụ: O3.T27, đây là dòng vi khuẩn khử nitrate thứ 27 phân lập từ chất thải ao cá tra.
Kiểm tra độ ròng bằng phương pháp giọt ép
Khử trùng lame và lamelle bằng cồn 960, làm khô trên ngọn lửa đèn cồn, hút khoảng 25l nƣớc cất vô trùng nhỏ lên lame. Vô trùng que cấy lấy một sinh khối vi khuẩn trong ống trữ trải đều trong giọt nƣớc cât trên lame.
Đậy giọt nƣớc cất chứa vi khuẩn bằng lamelle. Quan sát dƣới kính hiển vi quang học với độ phóng đại 400 lần. Mẫu rịng khi tất cả các tế bào vi khuẩn đều đồng dạng về hình dạng, kiểu chuyển động.
Mơ tả hình dạng khuẩn lạc và hình dạng tế bào vi khuẩn
Các dịng vi khuẩn đã rịng đƣợc cấy lên đĩa mơi trƣờng phân lập, ủ ở 30ºC trong 48 giờ để mô tả đặc điểm khuẩn lạc. Khuẩn lạc đƣợc mơ tả về hình dạng, màu sắc, độ nổi, dạng bìa, bề mặt và đƣờng kính. Vi khuẩn đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi ở độ phóng đại 400 lần để mơ tả dạng tế bào, khả năng chuyển động.
3.3.5. Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ
Mơi trường kiểm tra khả năng chuyển hóa nitơ
Bảng 5. Nồng độ ammonium, nitrite, nitrate trong mơi trƣờng kiểm tra
Hóa chất Nồng độ NH4Cl NaNO3 NaNO2 100 mM 100 mM 10 mM 200 mM 200 mM 20 mM 300 mM 300 mM 30 mM ... ... ...
Bốn loại môi trƣờng kiểm tra khả năng chuyển hóa nitơ (hay cịn gọi là mơi trƣờng kiểm tra) có thành phần hóa chất tƣơng tự nhƣ mơi trƣờng phân lập nhƣng có nồng độ nitrite, nitrate và ammonium tăng dần (bảng 5). Môi trƣờng sau khi pha chế đƣợc vơ trùng ở 1210C trong 20 phút sau đó đƣợc phân bố vào đĩa petri.
Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ
Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ của các dịng vi khuẩn phân lập bằng cách kiểm tra khả năng phát triển trên môi trƣờng kiểm tra chứa nồng ammonium, nitrite và nitrate tăng dần sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ.
Đầu tiên, các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc cấy lên 4 loại môi trƣờng kiểm tra H4 chứa 100 mM ammonium; O3 chứa 100 mM nitrate; O2 chứa 10 mM nitite; và T chứa đồng thời 100 mM ammonium, 100 mM nitratevà 10 mM nitrite (bảng 5).
Sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ, các dòng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả năng phát triển theo tiêu chí ở bảng 6. Những dòng phát triển sẽ đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng kiểm tra H4 chứa 200 mM NH4+
, O3 chứa 200 mM NO3-, O2 chứa 20 mM NO2- và T chứa đồng thời 200 mM NH4+, 200 mM NO3-, 20 mM NO2-).
Sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ, các dòng vi khuẩn tiếp tục đƣợc đánh giá khả năng phát triển và cấy sang mơi trƣờng kiểm tra có nồng đơ cao hơn.
Nồng độ các chất đƣợc tăng cho đến khi khơng cịn dịng nào có khả năng phát triển để chọn ra những dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao nhất.
Đánh giá khả năng phát triển
Khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trƣờng kiểm tra đƣợc đánh giá theo các mức độ ở bảng 6 và hình 9.
Bảng 6. Mức độ đánh giá khả năng phát triển và chuyển hóa nitơ
Mức phát triển Kí hiệu Mức chuyển hóa
Khơng phát triển - Khơng có khả năng chuyển hóa
Phát triển yếu + Khả năng chuyển hóa yếu
Phát triển trung bình ++ Khả năng chuyển hóa trung bình
Phát triển mạnh +++ Khả năng chuyển hóa mạnh
Hình 9. Các mức độ phát triển của vi khuẩn trên môi trƣờng kiểm tra
+ :phát triển yếu ++: phát triển trung bình +++: phát triển mạnh
3.3.6. Tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Sau khi đánh giá khả năng chuyển hóa từng dịng vi khuẩn phân lập, tiến hành tuyển chọn một dịng có khả năng chuyển hóa ở mức cao nhất, ổn định nhất cho từng loai chất thải và loại môi trƣờng (hay từng loại vi khuẩn chuyển hóa).
3.3.7. Nhận diện vi khuẩn
Ly trích DNA vi khuẩn
Q trình ly trích DNA vi khuẩn đƣợc thực hiện theo Breugelmans và Uyttebroek (2004). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Vi khuẩn đƣơc ni lắc qua đêm (120 vịng/ phút) ở nhiệt độ phịng trong 5ml
mơi trƣờng LB (Lauria Bertani).
Ly tâm dịch ni vi khuẩn 13.000 vịng/ phút trong 5 phút Loại bỏ phần nƣớc, thu phần cặn (sinh khối)
Hịa tan cặn bằng 250µl TE (pH = 8)
Thêm 50 µl SDS 10%, thêm tiếp 10µl proteinase K (10mg/ml) Ủ hỗn hợp ở 650C trong 20 phút, 5 phút đảo ngƣợc tuýp 1 lần
Thêm vào 400µl CTAB 10% 0,7M NaCl Tiếp tục ủ ở 650
C trong 20 phút
Thêm vào 600µl Chloroform: Isoamylalcohol (24:1)
Đảo ngƣợc tuýp vài lần trƣớc khi ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút Chuyển 500µl phần dịch trong phía trên sang tp mới (thao tác hút cẩn thận
tránh làm vỡ màng ngăn giữa DNA và protein)
Thêm vào 1ml Isopropanol, lắc đều. Giữ tuýp ở -200C ít nhất 30 phút
Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng trong 10 phút Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại phần cặn (DNA) DNA đƣợc rửa với 1ml ethanol 70%
Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 5 phút. Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại
Tiếp tục rửa DNA với 1ml ethanol 70%, ly tâm và giữ lại phần cặn nhƣ ở trên Sấy chân không ở 450C trong 15 phút
Hịa tan DNA trong 30µl nƣớc cất 2 lần khử ion, trữ DNA ở -200C để sử dụng.
Khuếch đại trình tự 16S rDNA
Sử dụng DNA của các dịng vi khuẩn làm khn trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi tổng 8F - 1492R (Turner et al., 1999) [bảng 7] và có thành phần, chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 8 và 9.
Phản ứng PCR cho ra sản phẩm là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1.500bp, chúng là các đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
Bảng 7. Trình tự cặp mồi tổng 8F - 1492R (nguồn: Turner et al., 1999)
Primer Trình tự Sản phẩm
8F 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’
1.500bp 1492R 5’ - TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’
Bảng 8. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với thể tích 50µl
Thành phần Nồng độ Thể tích Nƣớc cất 2 lần khử ion 24µl Buffer + (NH4)2SO4 10X 5µl MgCl2 25mM 4µl dNTPs 2mM 8µl Mồi xi 8F 2,5µM 2µl Mồi ngƣợc 1492R 2,5µM 2µl BSA 10mg/ml 0,5µl
Taq DNA polymerase 5u/µl 0,5µl
Bảng 9. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16s rDNA
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 950C 5 phút Nhân bản (30 chu kỳ) Biến tính Bắt cặp Kéo dài 950C 550C 720C 30 giây 30 giây 1 phút 30 giây Hoàn tất 720C 100C 10 phút Điện di sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên trên gel agarose 1,2% (0,48g agarose trong 40ml TAE 1X) chứa 0,8µl ethidium bromide để kiểm tra chất lƣợng phản ứng PCR. Mẫu DNA đƣợc trộn với 6X loading buffer trƣớc khi load vào giếng. DNA đƣợc điện di trên gel ở 95V trong 45 phút. Sau điện di, gel đƣợc quan sát dƣới tia cực tím (bƣớc sóng 260nm) và đƣợc chụp ảnh để xác định chất lƣợng của DNA. Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng (band), khơng hiện băng phụ, ...
Giải trình tự DNA
Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di, đƣợc giải trình tự tại cơng ty Macrogen ở Hàn Quốc để có đƣợc chuỗi trình tự nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
BLAST N
Sử dụng chƣơng trình BLAST N (Nucleotide BLAST) để so sánh trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn đã phân lập với trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu NCBI (The National Center for Biotechnology Information).
Truy nhập vào http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tool/Blast Tool/ Nucleotide Blast
Dán trình tự DNA cần nghiên cứu vào hộp Enter Query Sequence
Có thể tùy chọn các mục ở các hộp Program Selection, General Parameters,…
Click BLAST, đợi đến khi xuất hiện kết quả
Di chuyển đến hộp Descriptions. Chọn đối tƣợng có trình tự gen tƣơng đồng cao (Max Ident cao) với trình tự gen của đối tƣợng tự đang nghiên cứu
Lƣu ý đến các đối tƣợng có Max Ident cao, khơng gây bệnh, có nguồn gốc tƣơng tự với đối tƣợng cần nghiên cứu
3.3.8. Phân tích quan hệ di truyền
Xây dựng phát sinh lồi (phân tích cây phả hệ) cho các dòng vi khuẩn phân lập theo phƣơng pháp Neighbour - joining (Saitou và Nei, 1987) [hình 10] dựa trên thuật toán dữ liệu ma trận khoảng cách (distance - matrix data) bằng phần mềm MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011). Các taxa (các thành viên) trong nhánh (cluster) có liên hệ với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap (Felsenstein, 1985). Chỉ số bootstrap (độ tin cậy của sự gần gũi giữa các thành viên trong cùng nhóm của cây phả hệ), chỉ số bootstrap đƣợc tính tốn trên cơ sở 1000 lần lặp lại.