Nồng độ Số lƣợng dòng vi khuẩn
Ammonium Nitrite Nitrate Chất thải ao cá tra Chất thải trại heo
900 mM 6 8
90 mM 10 8
900mM 7 8
300 mM 30 mM 300 mM 2 2
Bảng 25. Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc của tám dòng vi khuẩn đƣợc chọn nhận diện
Dòng vi
khuẩn Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc
Phân lập từ chất thải ao cá tra
T.T03 Que ngắn, di động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm O2.T50 Que ngắn, di động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, nhám, 0,7 – 0,9 mm O3.T54 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,8 – 1,0 mm H4.T21 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm
Phân lập từ chất thải trại heo
T.H26 Que ngắn, di động Trắng đục, tròn, nguyên, mô, nhám, 0,8 – 1,0 mm O2.H31 Que ngắn, bất động Trắng đục, tròn, nguyên, lài, nhám, 0,8 – 1,0 mm O3.H02 Que ngắn, di động Trắng đục, tròn, răng cƣa, lài, nhám, 1,3 – 1,5 mm H4.H27 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm
Có 8 dịng chọn nhận diện từ 51 dịng vi khuẩn phân lập có khả năng chuyển hóa nitơ cao (1 dòng cho mỗi loại vi khuẩn và mỗi loại chất thải). Các dòng đƣợc chọn là những dịng có khả năng chuyển hóa cao nhất ở từng loại vi khuẩn, loại chất thải, chuyển hóa mạnh và ổn định trong suốt q trình kiểm tra khả năng chuyển hóa. Bảng 25 và 26 trình bày đặc điểm hình thái và khả năng chuyển hóa của 8 dịng đƣợc chọn nhận diện.
Bảng 26. Khả năng chuyển hóa nitơ của 8 dịng vi khuẩn đƣợc chọn nhận diện
Dòng vi khuẩn Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 Nồng độ 4 Nồng độ 5 Nồng độ 6 Nồng độ 7 Nồng độ 8 Nồng độ 9
Phân lập từ chất thải ao cá tra
T.T03 +++ +++ +
O2.T50 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++
O3.T54 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++
H4.T21 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++
Phân lập từ chất thải trại heo
T.H26 +++ +++ ++
O2.H31 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O3.H02 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
H4.H27 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+ : chuyển hóa thấp ++: chuyển hóa trung bình +++: chuyển hóa cao Nồng độ 1 tương ứng với 100mM NH4+ , 100mM NO3-, 10mM NO2-, Nồng độ 2 tương ứng với 200mM NH4+ , 200mM NO3-, 20mM NO2-, ..., Nồng độ 9 tương ứng với 900mM NH4+ / 900mM NO3-/ 90mM NO2-
4.9. Nhận diện dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
4.9.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Hình 19 trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn cần nhận diện. Qua phổ điện di cho thấy sản phẩm PCR có chiều dài khoảng 1.500bp và khơng có các sản phẩm phụ.
Hình 19. Phổ điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ đoạn gen 16S rDNA của tám
dòng vi khuẩn cần nhận diện
(Giếng (1): thang chuẩn 100bp plus, (2): đối chứng âm, (3): dòng T.T03, (4): dòng T.H26, (5): dòng O2.T50, (6): dòng O2.H31, (7): dòng O3.T54, (8): dòng O3.H02, (9): dòng H4.T21 và (10): dòng H4.H27).
4.9.2. Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
Kết quả giải trình tự của 8 dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc trình bày ở phụ bảng 7. Chiều dài đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự của các dịng vi khuẩn nhận diện đƣợc trình bày ở bảng 27.
Bảng 27. Kích thƣớc đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự của tám dịng vi
khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Kí hiệu Chiều dài đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự
Phân lập từ chất thải ao cá tra
Dòng T.A13 1226 nucleotide
Dòng O2.T24 1082 nucleotide
Dòng O3.T42 1022 nucleotide
Dòng H4.E63 1078 nucleotide
Phân lập từ chất thải trại heo
Dòng T.N11 1022 nucleotide Dòng O2.N13 1161 nucleotide Dòng O3.B12 1145 nucleotide Dòng H4.N11 835 nucleotide 1.500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kết quả BLAST của dòng T.T03 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng T.T03 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp. và Arthrobacter nicotianae (JQ071518, JN411489).
Kết quả BLAST N của dòng O2.T50 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O2.T50 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dòng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng O3.T54 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O3.T54 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Kết quả BLAST N của dòng H4.T21 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng H4.T21 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng T.H26 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng T.H26 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dòng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng O2.H31 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O2.H31 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp., Arthrobacter protophormiae (AB210984) và Arthobacter mysorens
Kết quả BLAST N của dòng O3.H02 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O3.H02 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Bacillus subtilis và Bacillus sp. (HM566751).
Kết quả BLAST N của dòng H4.H27 trên cơ sở dữ liệu NCBI
Dịng H4.H27 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 98% với trình tự của các dòng
Arthrobacter nicotianae và Arthrobacter sp. (JF820100).
Nhƣ vây, qua BLAST N trên cơ sở dữ liệu NCBI có thể tạm khẳng định các dịng vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite và vi khuẩn T là những dòng Arthrobacter
sp.; những dòng khử nitrate là Bacillus sp. (bảng 28).
Các dòng Arthrobater sp. phân lập đƣợc từ hai loại chất thải có đặc điểm phù
hợp với miêu tả của Martin et al. (2006), Akiko et al. (2008). Theo Martin et al. (2006)
Arthrobater là vi khuẩn hóa dị dƣỡng, hiếu khí bắt buộc; có đƣờng kính tế bào 0,6 –
1,2 µm; catalase dƣơng tính, G + C = 59 – 70%; có khuẩn lạc màu trắng, màu kem (trắng đục) có thể ánh vàng. Arthrobater có nhiều hình dạng (thay dổi theo thời gian tăng trƣởng) từ hình que dài (dạng chữ V) đến que ngắn hay dạng cầu. Dạng hình que dài sẽ có gram âm và que ngắn hay cầu thì sẽ có gram dƣơng. Arthrobater khơng sinh bào tử, ít di động hay bất động (Akiko et al., 2008).
Các dòng Bacillus phân lập đƣợc nhận diện có vài đặc điểm phù hợp với miêu tả về Bacillus subtilis của Perez et al. (2000) và Schaechter et al. (2006). B. subtilis là vi
khuẩn hình que Gram dƣơng, sinh bào tử; có thể chuyển động và có thể tồn tại riêng lẻ hay thành chuỗi (Schaechter et al., 2006); hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi.
Bảng 28. Kết quả nhận diện vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Dòng vi khuẩn Loại vi khuẩn Nguồn gốc
Phân lâp từ chất thải ao cá tra
Arthrobacter sp. H4.T21 Vi khuẩn oxi hóa NH4+
Thạnh An – Ơ Mơn
Arthrobacter sp. O2.T50 Vi khuẩn khử NO2- Trung Nhất – Thốt Nốt
Arthrobacter sp. T.T03 Vi khuẩn T Thạnh Quới – Vĩnh Thạnh
Bacillus sp. O3.T54 Vi khuẩn khử NO3- Thuận An – Thốt Nốt
Phân lập từ chất thải trại heo
Arthrobacter sp. H4.H27 Vi khuẩn oxi hóa NH4+
Thạnh Hòa – Thốt Nốt
Arthrobacter sp. O2.H31 Vi khuẩn khử NO2- Nhơn Ái – Phong Điền
Arthrobacter sp. T.H26 Vi khuẩn T Long Hịa – Bình Thủy
Bacillus sp. O3.H02 Vi khuẩn khử NO3- Thạnh An – Vĩnh Thạnh
(Vi khuẩn T là vi khuẩn có khả năng oxi hóa ammonium/ khử nitrtite, nitrate)
Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn cho thấy các dịng vi khuẩn nitrate hóa đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra và trại heo thuộc các chi Arthrobacter. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Gunner (1963), Verstraete và Alexander (1972), Karl và Hans (1979), Pinar và Ramos (1998), Chung et al. (1997), Gerardi (2002), Verbaendert et al. (2011),… Hai loài Arthrobacter globiformis và Arthrobacter nicotianae có thể thích nghi với điều kiện han chế oxy và có thể sử dụng nitrate làm
chất nhận điện tử cuối cùng (Eschbach et al., 2003). Chúng là vi khuẩn nitrate hóa ammonium thành nitrate thơng qua nitrite (Pinar et al., 1998).
Các dòng vi khuẩn khử nitrate đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra và trại heo thuộc chi Bacillus, điều này phù hợp với nghiên cứu của Kim et al. (2005), Lin et al.
(2007), Zhao et al. (2010), Yang et al. (2011), Wang và Zhao (2012)… Trƣớc đây,
Bacillus subtilis đƣợc biết đến nhƣ là lồi vi khuẩn khử nitrate kỵ khí. Trong điều kiện
thiếu oxy, Bacillus subtilis có thể hơ hấp sinh ra ATP thông qua sự khử nitrate. B. subtilis có thể sử dụng nitrate nhƣ là chất nhận điện tử cuối cùng do có hai thể nitrate
reductase. Ngày nay, theo Verbaendert et al. (2011) nhiều thành viên thuộc gống
Bacillus có hệ enzyme nitrite reductase và nitrate reductase cùng với các gen nirS, nirK, chứng tỏ các thành viên này vừa là vi khuẩn dị dƣỡng nitrate hóa vừa là vi khuẩn
hiếu khí khử nitrate. B. subtilis đóng vi trị quan trọng trong chu trình carbon và nitơ trong tự nhiên.
Hình 20. Hình thái tế bào các dịng Arthrobacter sp. và Bacillus sp. phân lập từ chất
thải ao cá tra và trại heo đƣợc quan sát trên kích hiển vi điện tử quét
Arthrobacter sp. T.T03 Arthrobacter sp. O2.T50 Bacillus sp. O3.T54 Arthrobacter sp. H4.H27 Arthrobacter sp. T.H26 Bacillus sp. O3.H02
Hình 20 trình bày hình thái tế bào của một số dịng vi khuẩn Arthrobacter sp. và
Bacillus sp. có khả năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra và
trại heo. Các dòng vi khuẩn này chủ yếu có dạng que ngắn, dài khoảng 1,0 – 1,5µm.
4.10. Phân tích quan hệ di truyền các dịng vi khuẩn đƣợc nhận diện
4.10.1. Quan hệ di truyền của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Hình 21. Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền của bốn dịng vi khuẩn có khả
năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra
(Cây phả hệ được vẽ theo phương pháp Neighbour-joining dựa vào trình tự 16S rDNA, ở nút là các giá trị bootstrap trên cơ sở 1000 lần lặp lại, theo sau các dòng vi khuẩn là accession number, các dịng vi khuẩn đươc đánh dấu hình tam giác là các dịng vi khuẩn phân lập).
Cây phả hệ ở hình 21 trình bày mối quan hệ di truyền giữa bốn dịng vi khuẩn có khả năng chuyển nitơ cao phân lập từ chất thải ao cá tra và các dòng trong cơ sở dữ liệu NCBI (các dòng tỉ lệ tƣơng đồng ≥ 98% với các dòng phân lập).
Arthrobacter nicotianae EU857420
Arthrobacter nicotianae JN411489
Arthrobacter sp. H4.T21
Arthrobacter sp. T.T03
Arthrobacter mysorens AJ639831
Arthrobacter mysorens NR025613
Arthrobacter arilaitensis JN571036
Arthrobacter sp. O2.T50
Arthrobacter protophormiae EU430097
Arthrobacter protophormiae EU294415
Bacillus subtilis EU221345
Bacillus subtilis HQ536000
Bacillus flexus HM003219
Bacillus megaterium EU979528
Bacillus megaterium JF496309 Bacillus sp. O3.T54 100 100 100 100 100 100 100 92 91 82 87 70 0.00 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10 Nhánh II Nhánh I
Hình 21 cho thấy cây phả hệ có 2 nhánh lớn (nhánh I và nhánh II):
Nhánh I chứa các dòng Arthrobacter sp. đƣợc phân lập (T.T03, H4.T21,
O2.T50) và các thành viên thuộc chi Arthrobacter nhƣ dòng Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter arilaitensis, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter protophormia.
Nhánh II chứa dòng Bacillus sp. O3.T54 (dòng vi khuẩn phân lập) và các
thành viên thuộc chi Bacillus nhƣ Bacllus flexus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium.
Các thành viên trong nhánh có quan hệ gần gũi với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap của nhánh. Các dòng phân lập nhƣ Arthrobacter sp. T.T03, H4.T21 và
O2.T50 có quan hệ gần với các thành viên của chi Arthrobacter. Cụ thể nhƣ sau: dòng
Arthrobacter sp. T.T03, H4.T21 có quan hệ rất gần với các dòng Arthrobacter nicotianae (EU857420, JN411489), dòng Arthrobacter sp. O2.T50 quan hê rất gần với Arthrobacter arilaitensis (JN571036). Trong khi đó, dịng Bacillus sp. O3.T54 có quan
hệ gần với các thành viên của chi Bacillus, cụ thể là quan hệ rất gần với Bacillus megaterium (EU979528, JF496309).
4.10.2. Quan hệ di truyền của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Cây phả hệ ở hình 22 trình bày mối quan hệ di truyền giữa bốn dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo và các dịng có trong cơ sở dữ liệu NCBI (các dòng tỉ lệ tƣơng đồng ≥ 98% với các dịng phân lập).
Hình 22 cho thấy cây phả hệ có 2 nhánh lớn (nhánh I và nhánh II):
Nhánh I chứa các dòng vi khuẩn phân lập (Arthrobacter sp. T.H26, O2.H31, H4.H27) và các thành viên của chi Arthrobacter nhƣ Arthrobacter nicotianae, Arthrobacter arilaitensis, Arthrobacter mysorens, Arthrobacter protophormia.
Nhánh II chứa dòng Bacillus sp. O3.H02 (dòng vi khuẩn phân lập) và các thành viên thuộc chi Bacillus nhƣ Bacllus flexus, Bacillus subtilis, Bacillus megaterium.
Hình 22. Cây phả hệ trình bày mối quan hệ di truyền của bốn dịng vi khuẩn có khả
năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc phân lập từ chất thải trại heo
(Cây phả hệ được vẽ theo phương pháp Neighbour-joining dựa vào trình tự 16S rDNA, ở nút là các giá trị bootstrap trên cơ sở 1000 lần lặp lại, theo sau các dòng vi khuẩn là accession number, các dịng vi khuẩn đươc đánh dấu hình tam giác là các dòng vi khuẩn phân lập).
Các thành viên trong nhánh có quan hệ gần gũi với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap của nhánh. Các dòng phân lập nhƣ Arthrobacter sp. T.H26, O2.H31,
H4.H27 có quan hệ gần với các thành viên của chi Arthrobacter. Cụ thể nhƣ sau: dịng
Arthrobacter sp. O2.H31 có quan hệ rất gần với các dòng Arthrobacter mysorens
(AJ639831, NR025613); dòng Arthrobacter sp. T.H26 có quan hệ rất gần với các dịng
Arthrobacter arilaitensis (JN571036); dòng Arthrobacter sp. H4.H27 có quan hệ rất
gần với các dòng Arthrobacter nicotianae (JQ071518, NR026190). Trong khi đó, dịng Bacillus sp. O3.H02 có quan hệ rất gần với các thành viên của chi Bacillus, chi tiết là Bacillus subtilis (FJ976614, HM753632).
Arthrobacter mysorens AJ639831 Arthrobacter mysorens NR025613 Arthrobacter sp. O2.H31 Arthrobacter arilaitensis JN571036 Arthrobacter sp. T.H26 Arthrobacter sp. H4.H27 Arthrobacter nicotianae JQ071518 Arthrobacter nicotianae NR026190 Arthrobacter protophormiae EU294415 Arthrobacter protophormiae EU874451
Bacillus subtilis FJ976614 Bacillus subtilis HM753632
Bacillus sp. O3.H02
Bacillus flexus HQ234345 Bacillus flexus EU071549 Bacillus megaterium EU979528 Bacillus megaterium JF496309 100 100 100 100 98 97 99 100 98 77 77 56 0.02 Nhánh II Nhánh I
Qua cây phả hệ ở hình 26 và 27 cho thấy kết quả nghiên cứu phù hợp với kết luận của Reddy et al. (2000), các loài của chi Arthrobacter đƣợc chia nhóm dựa vào cấu tạo của vách peptidoglycan. Nhóm I–Arthrobacter chứa A4-peptidoglycan (với peptidoglycan có dạng L-Lys-Ala-Glu hay L-Lys-L-Glu), nhóm này gồm có A. nicotianae, A. uratoxydans, A. protophormiae, A. sulfureus, A. rhombi,…. Nhóm II– Arthrobacter chứa A3-peptidoglycan (cầu nối giữa các peptide là monocarboxylic l–
amino acid hay glycine hoặc cả hai), nhóm này gồm có A. globiformis, A. oxydans, …. Khi phân tích cây phả hệ các thành viên thuộc chi Bacillus dựa vào trình tự 16S
rDNA; Fitch và Margoliash (1967), Sneath và Sokal (1973), Saitou và Nei (1987), Stackebrandt et al. (1987) đã cho thấy các loài Bacillus subtilis, Bacillus cereus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium,… và các lồi có bào từ hình elip khác
đƣợc xếp vào Nhánh I-Bacillus subtilis (Bacillus subtilis cluster I). Điều này phù hợp với kết quả phân tích cây phả hệ ở hình 21 và 22.
CHƢƠNG V
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 5.1. Kết luận
Bốn trăm lẻ chín dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ 29 mẫu chất thải ao cá tra và trại heo thu ở các quận, huyện thuộc thành phố Cần Thơ. Trong đó có 97 dịng oxi hóa ammonium, 110 dịng khử nitrite, 100 dịng khử nitrate và 102 dòng vi khuẩn T (có khả năng oxi hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrate). Các dịng phân lập đƣợc chủ yếu có khuẩn lạc dạng trịn, màu trắng, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn láng, đƣờng kính 0,5 - 1,0mm và tế bào chủ yếu là hình que di động.
Năm mƣơi mốt dịng có khả năng chuyển hóa nitơ cao: 14 dịng oxi hóa ammonium ở nồng độ 900mM; 18 dòng khử nitrite ở nồng độ 90mM; 15 dòng khử nitrate ở nồng độ 900mM và 4 dịng T chuyển hóa đƣợc 300mM ammonium, 300mM nitrate, 30mM nitrite.
Hai dịng vi khuẩn oxi hóa ammonium (H4.T21 và H4.H27), hai dịng khử nitrite (O2.T50 và O2.H31), hai dòng vi khuẩn T [oxi hóa ammonium, khử nitrite, nitrate] (T.T03, T.H26) tƣơng đồng 99% với các thành viên thuộc chi Arthrobacter và hai dòng khử nitrate (O3.T54 và O3.H02) tƣơng đồng 99% với các thành viên thuộc chi
Bacillus.
Qua phân tích phát sinh loài cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa dòng phân lập
Arthrobacter sp. T.T03, H4T21, H4.H27 và Arthrobacter nicotianae; giữa các dòng Arthrobacter sp. T.H26, O2.T50 và Arthrobacter arilaitensis; giữa dòng Arthrobacter
sp. O2.H31 và Arthrobacter mysorens; giữa dòng Bacillus sp. O3.T54 và Bacillus megaterium; giữa dòng Bacillus sp. O3.H02 và Bacillus subtilis.
5.2. Kiến nghị
Tiếp tục khảo sát hiệu suất, tốc độ chuyển hóa và các điều kiện tác động đến khả năng chuyển hóa của các dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc nhận diện ở qui mơ phịng thí nghiệm.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt
Cao Ngọc Điệp. 2010. Sách chuyên khảo, Vi khuẩn nội sinh thực vật, Nxb. Đại học Cần Thơ. Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp. 2002. Thực tập Vi sinh vật đại cương, Viện Nghiên
cứu và Phát triển Công nghệ Sinh học, Trƣờng Đại học Cần Thơ.