Bảng 15 và hình 18 cũng cho thấy đa phần vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải trại heo có dạng hình que ngắn, tồn tại riêng lẻ và có khả năng di động. Cụ thể là tế bào dạng que ngắn, riêng lẻ, di động chiếm tỉ lệ cao nhất (72,8%).
4.7. Khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn phân lập từ hai loại chất thải
Kết quả khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ của 409 dịng vi khuẩn đƣợc phân lập từ 29 mẫu chất thải đƣợc thể hiện chi tiết qua phụ bảng 6.
4.7.1. Khả năng oxi hóa ammonium của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra có khả năng oxi hóa ammonium ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 16.
Bảng 16. Khả năng oxi hóa ammonium của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Nồng độ ammonium Số dịng có khả năng oxi hóa
ammonium ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
100 mM 49 100,0 200 mM 49 100,0 300 mM 48 98,0 400 mM 47 95,9 500 mM 39 79,6 600 mM 33 67,3 700 mM 28 57,1 800 mM 13 26,5 900 mM 6 12,2 1000 mM 0 0,0
(Các dòng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên mơi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 16 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng oxi hóa ammonium tỉ lệ nghịch với nồng độ ammonium. Trong 49 dịng vi khuẩn oxi hóa ammonium phân lập từ chất thải ao cá tra, có 6 dịng có khả năng oxi hóa ammonium ở nồng độ cao nhất (900mM) và chiếm tỉ lệ 12,2%.
4.7.2. Khả năng khử nitrite của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra có khả năng khử nitrite ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 17.
Bảng 17. Khả năng khử nitrite của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Nồng độ nitrite Số dịng có khả năng khử
nitrite ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
10 mM 61 100,0 20 mM 61 100,0 30 mM 57 93,4 40 mM 49 80,3 50 mM 45 73,8 60 mM 32 52,5 70 mM 28 45,9 80 mM 15 24,6 90 mM 10 16,4 100 mM 0 0,0
(Các dòng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên môi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 17 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrite tỉ lệ nghịch với nồng độ nitrite. Trong 61 dòng vi khuẩn khử nitrite phân lập từ chất thải ao cá tra, có 10 dịng có khả năng khử nitrite ở nồng độ cao nhất (90mM) và chiếm tỉ lệ 16,4%.
4.7.3. Khả năng khử nitrate của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra có khả năng khử nitrate ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 18.
Bảng 18. Khả năng khử nitrate của vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Nồng độ nitrate Số dịng có khả năng khử nitrate
ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm 100 mM 54 100,0 200 mM 54 100,0 300 mM 50 92,6 400 mM 36 66,7 500 mM 31 57,4 600 mM 24 44,4 700 mM 21 38,9 800 mM 14 25,9 900 mM 7 13,0 1000 mM 0 0,0
(Các dòng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên mơi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 18 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrate tỉ lệ nghịch với nồng độ nitrate. Trong 54 dòng vi khuẩn khử nitrate phân lập từ chất thải ao cá tra, có 7 dịng có khả năng khử nitrate ở nồng độ cao nhất (900mM), chiếm tỉ lệ 13,0%.
4.7.4. Khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn T phân lập từ chất thải ao cá tra Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn T phân lập từ chất thải ao cá tra có khả năng chuyển hóa nitơ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 19.
Bảng 19. Khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn T phân lập từ chất thải ao cá tra
Nồng độ Số dịng có khả năng chuyển
hóa ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
Ammonium Nitrite Nitrate
100 mM 10 mM 100 mM 54 100,0
200 mM 20 mM 200 mM 17 31,5
300 mM 30 mM 300 mM 2 3,7
400 mM 40 mM 400 mM 0 0,0
(Các dòng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên môi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 19 cho thấy số lƣợng dòng vi khuẩn T có khả năng chuyển hóa nitơ tỉ lệ nghịch với nồng độ các hợp chất nitơ. Trong 54 dòng vi khuẩn T phân lập từ chất thải ao cá tra, có 2 dịng có khả năng chuyển hóa nitơ ở nồng độ cao nhất (300mM ammoinum, 300mM nitrate, 30mM nitrite), chiếm tỉ lệ 3,7%.
4.7.5. Khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn T phân lập từ chất thải trại heo
Bảng 20. Khả năng chuyển hóa nitơ của vi khuẩn T phân lập từ chất thải trại heo
Nồng độ Số dịng có khả năng chuyển
hóa ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
Ammonium Nitrite Nitrate
100 mM 10 mM 100 mM 48 100,0
200 mM 20 mM 200 mM 14 29,2
300 mM 30 mM 300 mM 2 4,2
400 mM 40 mM 400 mM 0 0,0
(Các dịng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên mơi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn T phân lập từ chất thải trại heo có khả năng chuyển hóa nitơ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 20.
Bảng 20 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn T có khả năng chuyển hóa nitơ tỉ lệ nghịch với nồng độ các hợp chất nitơ. Trong 48 dòng vi khuẩn T phân lập từ chất thải trại heo, có 2 dịng có khả năng chuyển hóa nitơ ở nồng độ cao nhất (300mM ammoinum, 300mM nitrate, 30mM nitrite) và chiếm tỉ lệ 4,2%.
4.7.6. Khả năng oxi hóa ammonium của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo có khả Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo có khả năng oxi hóa ammonium ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 21.
Bảng 21. Khả năng oxi hóa ammonium của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Nồng độ ammonium Số dịng có khả năng oxi
hóa ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
100 mM 48 100,0 200 mM 46 95,8 300 mM 41 85,4 400 mM 40 83,3 500 mM 37 77,1 600 mM 31 64,6 700 mM 26 54,2 800 mM 13 27,1 900 mM 8 16,7 1000 mM 0 0,0
(Các dịng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên môi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 21 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng oxi hóa ammonium tỉ lệ nghịch với nồng độ ammonium. Trong 48 dịng vi khuẩn oxi hóa ammonium phân lập từ chất thải trại heo có 8 dịng có khả năng oxi hóa ammonium ở nồng độ cao nhất (900mM), chiếm tỉ lệ 16,7%.
4.7.7. Khả năng khử nitrite của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo có khả năng khử nitrite ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 22.
Bảng 22. Khả năng khử nitrite của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Nồng độ nitrite Số dịng có khả năng khử
nitrite ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
10 mM 49 100,0 20 mM 49 100,0 30 mM 43 87,8 40 mM 37 75,5 50 mM 33 67,3 60 mM 25 51,0 70 mM 21 42,9 80 mM 14 28,6 90 mM 8 16,3 100 mM 0 0,0
(Các dịng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên mơi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 22 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrite tỉ lệ nghịch với nồng độ nitrite. Trong 49 dòng vi khuẩn khử nitrite phân lập từ chất thải trại heo có 8 dịng có khả năng khử nitrite ở nồng độ cao nhất (90mM), chiếm tỉ lệ 16,3%.
4.7.8. Khả năng khử nitrate của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Số lƣợng và tỉ lệ phần trăm dòng vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo có khả năng khử nitrate ở từng nồng độ đƣợc thể hiện chi tiết ở bảng 23.
Bảng 23. Khả năng khử nitrate của vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Nồng độ nitrate Số dịng có khả năng khử
nitrate ở nồng độ tƣơng ứng Tỉ lệ phần trăm
100 mM 46 100,0 200 mM 46 100,0 300 mM 44 95,7 400 mM 43 93,5 500 mM 41 89,1 600 mM 26 56,5 700 mM 19 41,3 800 mM 13 28,3 900 mM 8 17,4 1000 mM 0 0,0
(Các dịng vi khuẩn được đánh giá có khả năng chuyển hóa khi có sự phát triển trên mơi trường kiểm tra ở nồng độ tương ứng).
Bảng 23 cho thấy số lƣợng dịng vi khuẩn có khả năng khử nitrate tỉ lệ nghịch với nồng độ nitrate. Trong 46 dòng vi khuẩn khử nitrate phân lập từ chất thải trại heo có 8 dịng có khả năng khử nitrate ở nồng độ cao nhất (900mM), chiếm tỉ lệ 17,4%.
4.8. Tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Sau khi khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ của 409 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập. Năm mƣơi mốt dịng có khả năng chuyển hóa nitơ ở nồng độ cao đƣợc tuyển chọn. Số lƣợng và khả năng chuyển hóa nitơ đƣợc trình bày ở bảng 24.
Bảng 24. Kết quả tuyển chọn vi khuẩn phân lập có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Nồng độ Số lƣợng dòng vi khuẩn
Ammonium Nitrite Nitrate Chất thải ao cá tra Chất thải trại heo
900 mM 6 8
90 mM 10 8
900mM 7 8
300 mM 30 mM 300 mM 2 2
Bảng 25. Đặc điểm tế bào và khuẩn lạc của tám dòng vi khuẩn đƣợc chọn nhận diện
Dòng vi
khuẩn Đặc điểm tế bào Đặc điểm khuẩn lạc
Phân lập từ chất thải ao cá tra
T.T03 Que ngắn, di động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm O2.T50 Que ngắn, di động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, nhám, 0,7 – 0,9 mm O3.T54 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,8 – 1,0 mm H4.T21 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm
Phân lập từ chất thải trại heo
T.H26 Que ngắn, di động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, nhám, 0,8 – 1,0 mm O2.H31 Que ngắn, bất động Trắng đục, tròn, nguyên, lài, nhám, 0,8 – 1,0 mm O3.H02 Que ngắn, di động Trắng đục, tròn, răng cƣa, lài, nhám, 1,3 – 1,5 mm H4.H27 Que ngắn, bất động Trắng đục, trịn, ngun, mơ, trơn láng, 0,9 – 1,1 mm
Có 8 dịng chọn nhận diện từ 51 dịng vi khuẩn phân lập có khả năng chuyển hóa nitơ cao (1 dòng cho mỗi loại vi khuẩn và mỗi loại chất thải). Các dòng đƣợc chọn là những dịng có khả năng chuyển hóa cao nhất ở từng loại vi khuẩn, loại chất thải, chuyển hóa mạnh và ổn định trong suốt quá trình kiểm tra khả năng chuyển hóa. Bảng 25 và 26 trình bày đặc điểm hình thái và khả năng chuyển hóa của 8 dịng đƣợc chọn nhận diện.
Bảng 26. Khả năng chuyển hóa nitơ của 8 dịng vi khuẩn đƣợc chọn nhận diện
Dòng vi khuẩn Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 Nồng độ 4 Nồng độ 5 Nồng độ 6 Nồng độ 7 Nồng độ 8 Nồng độ 9
Phân lập từ chất thải ao cá tra
T.T03 +++ +++ +
O2.T50 +++ +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++
O3.T54 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++
H4.T21 +++ +++ +++ +++ +++ ++ +++ +++ +++
Phân lập từ chất thải trại heo
T.H26 +++ +++ ++
O2.H31 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
O3.H02 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
H4.H27 +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++ +++
+ : chuyển hóa thấp ++: chuyển hóa trung bình +++: chuyển hóa cao Nồng độ 1 tương ứng với 100mM NH4+ , 100mM NO3-, 10mM NO2-, Nồng độ 2 tương ứng với 200mM NH4+ , 200mM NO3-, 20mM NO2-, ..., Nồng độ 9 tương ứng với 900mM NH4+ / 900mM NO3-/ 90mM NO2-
4.9. Nhận diện dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
4.9.1. Kết quả điện di sản phẩm PCR
Hình 19 trình bày kết quả điện di sản phẩm PCR khuếch đại trình tự gen 16S rDNA của 8 dòng vi khuẩn cần nhận diện. Qua phổ điện di cho thấy sản phẩm PCR có chiều dài khoảng 1.500bp và khơng có các sản phẩm phụ.
Hình 19. Phổ điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ đoạn gen 16S rDNA của tám
dòng vi khuẩn cần nhận diện
(Giếng (1): thang chuẩn 100bp plus, (2): đối chứng âm, (3): dòng T.T03, (4): dòng T.H26, (5): dòng O2.T50, (6): dòng O2.H31, (7): dòng O3.T54, (8): dòng O3.H02, (9): dòng H4.T21 và (10): dịng H4.H27).
4.9.2. Kết quả giải trình tự và nhận diện vi khuẩn
Kết quả giải trình tự của 8 dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao đƣợc trình bày ở phụ bảng 7. Chiều dài đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự của các dịng vi khuẩn nhận diện đƣợc trình bày ở bảng 27.
Bảng 27. Kích thƣớc đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự của tám dịng vi
khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Kí hiệu Chiều dài đoạn gen 16S rDNA đƣợc giải trình tự
Phân lập từ chất thải ao cá tra
Dòng T.A13 1226 nucleotide
Dòng O2.T24 1082 nucleotide
Dòng O3.T42 1022 nucleotide
Dòng H4.E63 1078 nucleotide
Phân lập từ chất thải trại heo
Dòng T.N11 1022 nucleotide Dòng O2.N13 1161 nucleotide Dòng O3.B12 1145 nucleotide Dòng H4.N11 835 nucleotide 1.500 bp 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Kết quả BLAST của dòng T.T03 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng T.T03 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp. và Arthrobacter nicotianae (JQ071518, JN411489).
Kết quả BLAST N của dòng O2.T50 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O2.T50 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dòng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng O3.T54 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O3.T54 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Kết quả BLAST N của dòng H4.T21 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng H4.T21 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng T.H26 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng T.H26 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dòng
Arthrobacter sp..
Kết quả BLAST N của dòng O2.H31 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O2.H31 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Arthrobacter sp., Arthrobacter protophormiae (AB210984) và Arthobacter mysorens
Kết quả BLAST N của dòng O3.H02 trên cơ sở dữ liệu NCBI:
Dịng O3.H02 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 99% với trình tự của các dịng
Bacillus subtilis và Bacillus sp. (HM566751).
Kết quả BLAST N của dòng H4.H27 trên cơ sở dữ liệu NCBI
Dịng H4.H27 có trình tự 16S rDNA tƣơng đồng 98% với trình tự của các dòng
Arthrobacter nicotianae và Arthrobacter sp. (JF820100).
Nhƣ vây, qua BLAST N trên cơ sở dữ liệu NCBI có thể tạm khẳng định các dịng vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite và vi khuẩn T là những dòng Arthrobacter
sp.; những dòng khử nitrate là Bacillus sp. (bảng 28).
Các dòng Arthrobater sp. phân lập đƣợc từ hai loại chất thải có đặc điểm phù
hợp với miêu tả của Martin et al. (2006), Akiko et al. (2008). Theo Martin et al. (2006)
Arthrobater là vi khuẩn hóa dị dƣỡng, hiếu khí bắt buộc; có đƣờng kính tế bào 0,6 –
1,2 µm; catalase dƣơng tính, G + C = 59 – 70%; có khuẩn lạc màu trắng, màu kem (trắng đục) có thể ánh vàng. Arthrobater có nhiều hình dạng (thay dổi theo thời gian tăng trƣởng) từ hình que dài (dạng chữ V) đến que ngắn hay dạng cầu. Dạng hình que dài sẽ có gram âm và que ngắn hay cầu thì sẽ có gram dƣơng. Arthrobater khơng sinh bào tử, ít di động hay bất động (Akiko et al., 2008).
Các dòng Bacillus phân lập đƣợc nhận diện có vài đặc điểm phù hợp với miêu tả về Bacillus subtilis của Perez et al. (2000) và Schaechter et al. (2006). B. subtilis là vi
khuẩn hình que Gram dƣơng, sinh bào tử; có thể chuyển động và có thể tồn tại riêng lẻ hay thành chuỗi (Schaechter et al., 2006); hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi.