Chƣơng III PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
3.3.5. Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ
Mơi trường kiểm tra khả năng chuyển hóa nitơ
Bảng 5. Nồng độ ammonium, nitrite, nitrate trong môi trƣờng kiểm tra
Hóa chất Nồng độ NH4Cl NaNO3 NaNO2 100 mM 100 mM 10 mM 200 mM 200 mM 20 mM 300 mM 300 mM 30 mM ... ... ...
Bốn loại môi trƣờng kiểm tra khả năng chuyển hóa nitơ (hay cịn gọi là môi trƣờng kiểm tra) có thành phần hóa chất tƣơng tự nhƣ mơi trƣờng phân lập nhƣng có nồng độ nitrite, nitrate và ammonium tăng dần (bảng 5). Môi trƣờng sau khi pha chế đƣợc vô trùng ở 1210C trong 20 phút sau đó đƣợc phân bố vào đĩa petri.
Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ
Khảo sát khả năng chuyển hóa nitơ của các dịng vi khuẩn phân lập bằng cách kiểm tra khả năng phát triển trên môi trƣờng kiểm tra chứa nồng ammonium, nitrite và nitrate tăng dần sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ.
Đầu tiên, các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc cấy lên 4 loại môi trƣờng kiểm tra H4 chứa 100 mM ammonium; O3 chứa 100 mM nitrate; O2 chứa 10 mM nitite; và T chứa đồng thời 100 mM ammonium, 100 mM nitratevà 10 mM nitrite (bảng 5).
Sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ, các dòng vi khuẩn đƣợc đánh giá khả năng phát triển theo tiêu chí ở bảng 6. Những dòng phát triển sẽ đƣợc cấy chuyển sang môi trƣờng kiểm tra H4 chứa 200 mM NH4+
, O3 chứa 200 mM NO3-, O2 chứa 20 mM NO2- và T chứa đồng thời 200 mM NH4+, 200 mM NO3-, 20 mM NO2-).
Sau khi ủ ở 300C trong 48 giờ, các dòng vi khuẩn tiếp tục đƣợc đánh giá khả năng phát triển và cấy sang mơi trƣờng kiểm tra có nồng đơ cao hơn.
Nồng độ các chất đƣợc tăng cho đến khi khơng cịn dịng nào có khả năng phát triển để chọn ra những dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao nhất.
Đánh giá khả năng phát triển
Khả năng phát triển của vi khuẩn trên môi trƣờng kiểm tra đƣợc đánh giá theo các mức độ ở bảng 6 và hình 9.
Bảng 6. Mức độ đánh giá khả năng phát triển và chuyển hóa nitơ
Mức phát triển Kí hiệu Mức chuyển hóa
Khơng phát triển - Khơng có khả năng chuyển hóa
Phát triển yếu + Khả năng chuyển hóa yếu
Phát triển trung bình ++ Khả năng chuyển hóa trung bình
Phát triển mạnh +++ Khả năng chuyển hóa mạnh
Hình 9. Các mức độ phát triển của vi khuẩn trên môi trƣờng kiểm tra
+ :phát triển yếu ++: phát triển trung bình +++: phát triển mạnh
3.3.6. Tuyển chọn dịng vi khuẩn có khả năng chuyển hóa nitơ cao
Sau khi đánh giá khả năng chuyển hóa từng dịng vi khuẩn phân lập, tiến hành tuyển chọn một dịng có khả năng chuyển hóa ở mức cao nhất, ổn định nhất cho từng loai chất thải và loại môi trƣờng (hay từng loại vi khuẩn chuyển hóa).
3.3.7. Nhận diện vi khuẩn
Ly trích DNA vi khuẩn
Q trình ly trích DNA vi khuẩn đƣợc thực hiện theo Breugelmans và Uyttebroek (2004). Các bƣớc tiến hành nhƣ sau:
Vi khuẩn đƣơc ni lắc qua đêm (120 vịng/ phút) ở nhiệt độ phịng trong 5ml
mơi trƣờng LB (Lauria Bertani).
Ly tâm dịch ni vi khuẩn 13.000 vịng/ phút trong 5 phút Loại bỏ phần nƣớc, thu phần cặn (sinh khối)
Hịa tan cặn bằng 250µl TE (pH = 8)
Thêm 50 µl SDS 10%, thêm tiếp 10µl proteinase K (10mg/ml) Ủ hỗn hợp ở 650C trong 20 phút, 5 phút đảo ngƣợc tuýp 1 lần
Thêm vào 400µl CTAB 10% 0,7M NaCl Tiếp tục ủ ở 650
C trong 20 phút
Thêm vào 600µl Chloroform: Isoamylalcohol (24:1)
Đảo ngƣợc tuýp vài lần trƣớc khi ly tâm 12.000 vòng/ phút trong 10 phút Chuyển 500µl phần dịch trong phía trên sang tuýp mới (thao tác hút cẩn thận
tránh làm vỡ màng ngăn giữa DNA và protein)
Thêm vào 1ml Isopropanol, lắc đều. Giữ tuýp ở -200C ít nhất 30 phút
Ly tâm với tốc độ 13.000 vòng trong 10 phút Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại phần cặn (DNA) DNA đƣợc rửa với 1ml ethanol 70%
Ly tâm với tốc độ 12.000 vòng trong 5 phút. Loại bỏ phần chất lỏng, giữ lại
Tiếp tục rửa DNA với 1ml ethanol 70%, ly tâm và giữ lại phần cặn nhƣ ở trên Sấy chân không ở 450C trong 15 phút
Hịa tan DNA trong 30µl nƣớc cất 2 lần khử ion, trữ DNA ở -200C để sử dụng.
Khuếch đại trình tự 16S rDNA
Sử dụng DNA của các dịng vi khuẩn làm khn trong phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16S rDNA với cặp mồi tổng 8F - 1492R (Turner et al., 1999) [bảng 7] và có thành phần, chu kỳ nhiệt nhƣ bảng 8 và 9.
Phản ứng PCR cho ra sản phẩm là các đoạn DNA có kích thƣớc khoảng 1.500bp, chúng là các đoạn 16S rDNA của vi khuẩn.
Bảng 7. Trình tự cặp mồi tổng 8F - 1492R (nguồn: Turner et al., 1999)
Primer Trình tự Sản phẩm
8F 5’ - AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG - 3’
1.500bp 1492R 5’ - TAC GGT TAC CTT GTT ACG ACT T - 3’
Bảng 8. Thành phần hóa chất cho một phản ứng PCR với thể tích 50µl
Thành phần Nồng độ Thể tích Nƣớc cất 2 lần khử ion 24µl Buffer + (NH4)2SO4 10X 5µl MgCl2 25mM 4µl dNTPs 2mM 8µl Mồi xi 8F 2,5µM 2µl Mồi ngƣợc 1492R 2,5µM 2µl BSA 10mg/ml 0,5µl
Taq DNA polymerase 5u/µl 0,5µl
Bảng 9. Chu kỳ nhiệt của phản ứng PCR khuếch đại trình tự 16s rDNA
Giai đoạn Nhiệt độ Thời gian
Biến tính 950C 5 phút Nhân bản (30 chu kỳ) Biến tính Bắt cặp Kéo dài 950C 550C 720C 30 giây 30 giây 1 phút 30 giây Hoàn tất 720C 100C 10 phút Điện di sản phẩm PCR
Các sản phẩm PCR đƣợc điện di trên trên gel agarose 1,2% (0,48g agarose trong 40ml TAE 1X) chứa 0,8µl ethidium bromide để kiểm tra chất lƣợng phản ứng PCR. Mẫu DNA đƣợc trộn với 6X loading buffer trƣớc khi load vào giếng. DNA đƣợc điện di trên gel ở 95V trong 45 phút. Sau điện di, gel đƣợc quan sát dƣới tia cực tím (bƣớc sóng 260nm) và đƣợc chụp ảnh để xác định chất lƣợng của DNA. Phản ứng PCR thành công khi đối chứng âm không xuất hiện băng (band), không hiện băng phụ, ...
Giải trình tự DNA
Mẫu sản phẩm PCR sau khi kiểm tra bằng điện di, đƣợc giải trình tự tại cơng ty Macrogen ở Hàn Quốc để có đƣợc chuỗi trình tự nucleic acid của đoạn gen 16S rDNA.
BLAST N
Sử dụng chƣơng trình BLAST N (Nucleotide BLAST) để so sánh trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn đã phân lập với trình tự đoạn gen của các dịng vi khuẩn có trong cơ sở dữ liệu NCBI (The National Center for Biotechnology Information).
Truy nhập vào http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Tool/Blast Tool/ Nucleotide Blast
Dán trình tự DNA cần nghiên cứu vào hộp Enter Query Sequence
Có thể tùy chọn các mục ở các hộp Program Selection, General Parameters,…
Click BLAST, đợi đến khi xuất hiện kết quả
Di chuyển đến hộp Descriptions. Chọn đối tƣợng có trình tự gen tƣơng đồng cao (Max Ident cao) với trình tự gen của đối tƣợng tự đang nghiên cứu
Lƣu ý đến các đối tƣợng có Max Ident cao, khơng gây bệnh, có nguồn gốc tƣơng tự với đối tƣợng cần nghiên cứu
3.3.8. Phân tích quan hệ di truyền
Xây dựng phát sinh lồi (phân tích cây phả hệ) cho các dịng vi khuẩn phân lập theo phƣơng pháp Neighbour - joining (Saitou và Nei, 1987) [hình 10] dựa trên thuật tốn dữ liệu ma trận khoảng cách (distance - matrix data) bằng phần mềm MEGA 5.05 (Tamura et al., 2011). Các taxa (các thành viên) trong nhánh (cluster) có liên hệ với nhau thể hiện qua chỉ số bootstrap (Felsenstein, 1985). Chỉ số bootstrap (độ tin cậy của sự gần gũi giữa các thành viên trong cùng nhóm của cây phả hệ), chỉ số bootstrap đƣợc tính tốn trên cơ sở 1000 lần lặp lại.
Xây dựng phát sinh loài đƣợc thực hiện nhƣ sau:
Tạo file chứa các trình tự vi khuẩn phân lập và vi khuẩn đƣợc chọn ở bƣớc BLAST bằng công cụ Notepad với chấm đuôi txt
Định dạng fasta với phần mềm BioEdit
Mở file fasta bằng phần mềm MEGA 5.05
Tiến hành Alignment (Align by ClustalW)
Click Data/ phylogenetic analysis
Click phylogeny (vẽ cây phả hệ)
Chọn Construct/ Test neighbor joining tree
Chọn Bootstrap method và 1000 lần lặp lại
Click Compute, chờ xuất hiện cây phả hệ và sử dụng chỉ số bootstrap để đánh giá cây phả hệ.
CHƢƠNG IV
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Kết quả thu mẫu chất thải
Tồn thành phố Cần Thơ có 6 trên 9 quận, huyện đƣợc thu mẫu chất thải ao cá tra và có 8 trên 9 quận đƣợc thu mẫu chất thải trại heo (sau biogas) [bảng 10].
Tổng số mẫu chất thải đƣợc thu trong toàn thành phố Cần Thơ là 29 mẫu (với 14 mẫu chất thải ao cá tra và 15 mẫu chất thải trại heo). Họ tên hộ nuôi cá tra, chăn nuôi heo và địa chỉ chi tiết đƣợc thể hiện qua phụ bảng 1.
Bảng 10. Số mẫu chất thải ao cá tra và trại heo thu đƣợc ở các quận, huyện thuộc
thành phố Cần Thơ
Quận, Huyện Số lƣợng mẫu chất thải ao cá tra Số lƣợng mẫu chất thải trại heo Vĩnh Thạnh 2 2 Cái Răng 1 2 Ơ Mơn 5 2 Bình Thủy 1 2 Cờ Đỏ 1 1 Thốt Nốt 4 2 Thới Lai - 2 Phong Điền - 2
(Số lượng mẫu chất thải được phân phối dựa theo diện tích ni trồng thủy sản và số lượng đàn gia súc của thành phố Cần Thơ cuối năm 2010 được cung cấp bởi Cục Thống kê thành phố Cần Thơ).
4.2. Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong hai loại chất thải
Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ theo từng loại cho từng mẫu chất thải đƣợc thể hiện chi tiết qua phụ bảng 2.
4.2.1.Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chất thải ao cá tra
Hình 10A và phụ lục 1 trình bày mật số từng loại vi khuẩn trung bình và độ lệch chuẩn của 14 mẫu chất thải ao cá tra. Ở các mẫu đều có sự hiện diện của vi khuẩn chuyển hóa nitơ (vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrate).
Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ (tổng mật số từng loại vi khuẩn) khoảng 6,0.105 cfu/ml và mật số giữa các mẫu có sự chênh lệch với nhau (hình 10A).
A.
B.
Hình 10. Mật số từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong 14 mẫu chất thải ao cá
tra (A) và 15 mẫu chất thải trai heo (B)
Giá trị hiển thị: Mật số trung bình ± độ lệch chuẩn
Vi khuẩn T là vi khuẩn phát triển trên môi trường T (chứa ammonium, nitrite, nitrate) Vi khuẩn O2 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrite
Vi khuẩn O3 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrate Vi khuẩn H4 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa ammonium
4.2.1.Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong chất thải trại heo
Tƣơng tự ở chất thải ao cá tra, trong 15 mẫu chất thải trại heo đều có sự hiện diện của từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ. Hình 10B và phụ lục 2 trình bày mật số từng loại vi khuẩn và độ lệch chuẩn.
Hình 10B cho thấy mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ trong mẫu chất thải trại heo khoảng 106
cfu/ml và mật số giữa các mẫu cũng có sự chênh lệch với nhau.
Nhƣ vậy qua khảo sát mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ cho thấy trong mẫu chất thải ao cá tra và trại heo có sự hiện diện của vi khuẩn oxi hóa ammonium, khử nitrite, khử nitrte. Nên có thể sử dụng cả hai loại chất thải này làm nguồn vật liệu phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ.
4.3. Giá trị pH của hai loại chất thải
Giá trị pH của các mẫu chất thải ao cá tra và trại heo đƣợc trình bày chi tiết trong phụ bảng 3. Hình 11 trình bày giá trị pH trung bình của chất thải ao cá tra và trại heo.
Giá trị pH của chất thải ao cá tra dao động trong khoảng 6,2 – 7,0; sự chênh lệch giữa các mẫu thấp (phụ lục 3). Nguyên nhân do nông dân sử dụng hóa chất (vơi) để duy trì giá trị pH thích hợp cho cá tra trong q trình ni.
Giá trị pH của chất thải trại heo dao động trong khoảng 5,0 – 7,0; sự chênh lệch giữa các mẫu cao (hình 11 và phụ lục 3). Các mẫu chất thải trại heo có pH khoảng trung tính điều này phù hợp với nghiên cứu của Patil et al. (2010) ở Úc [pH: 6,6 – 7,2]; Dy (2004) ở Hàn Quốc [pH: 7,1 – 8,9] và Sun et al. (2012) ở Hangzhou – Trung Quốc [pH: 6,4 – 7,0].
Hình 11. Giá trị pH trung bình của chất thải ao cá tra và trại heo
Giá trị pH có ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng của vi sinh vật nói chung và vi khuẩn nói riêng. Hay pH có sự tác động đến mật số khuẩn chuyển hóa nitơ trong các mẫu chất thải, thể hiện qua hệ số tƣơng quan (r). Qua hình 12A và 12B cho thấy mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và pH có sự tƣơng quan chặc chẽ với nhau (mức ý nghĩa 1%).
A. B.
Hình 12. Tƣơng quan có ý nghĩa ở mức 1% giữa mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và
giá trị pH trong mẫu chất thải ao cá tra (A) và trong mẫu chất thải trại heo (B)
** Mật số vi khuẩn chuyển hóa nitơ và pH có sự tương quan với nhau ở mức ý nghĩa 1%.
Theo Villaverde et al. (1997) giá trị pH có 3 ảnh hƣởng lớn đến vi khuẩn chuyển hóa nitơ: (1) hoạt hóa hay ức chế vi khuẩn chuyển hóa nitơ, (2) ảnh hƣởng đến dinh dƣỡng của vi khuẩn, (3) ức chế vi khuẩn thông qua nồng độ NH3 và HNO2.
Thật vậy, theo Gerardi (2002) pH thích hợp cho sự chuyển hóa nitơ là 7 – 8,5. Anthonisen et al. (1976) sử dụng pH 7,5 – 8,5; Eum và Choi (2006) sử dụng pH lớn hơn 8,0; Su et al. (2006) sử dụng pH 7,5 để tối ƣu sự chuyển hóa nitơ trong chất thải trại heo. Chen et al. ( 2006) sử dụng pH 7,0 – 8,8 để tối ƣu sự chuyển hóa nitơ trong chất thải ni trồng thủy sản.
4.4. Kết quả phân lập vi khuẩn chuyển hóa nitơ
Bốn trăm lẻ chín dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ 29 mẫu chất thải ao cá tra và trại heo. Số lƣợng theo loại vi khuẩn, loại chất thải và địa điểm thu mẫu đƣợc trình bày ở phụ bảng 4.
Từ 14 mẫu chất thải ao cá tra, 218 dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập và 191 dịng vi khuẩn đƣợc phân lập từ 15 mẫu chất thải trại heo. Số lƣợng từng loại vi khuẩn và tỉ lệ phần trăm tƣơng ứng đƣợc trình bày ở bảng 11. Tổng cộng có 102 dịng
vi khuẩn T, 110 dịng vi khuẩn O2, 110 dòng vi khuẩn O3 và 97 dòng vi khuẩn H4. Tỉ lệ phần trăm từng loại vi khuẩn tƣơng đƣơng nhau.
Bảng 11. Số dòng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ hai loại chất thải
Loại vi khuẩn Số dòng Tỉ lệ phần trăm
Phân lập từ chất thải ao cá tra
Vi khuẩn T 54 24,8
Vi khuẩn O2 61 28,0
Vi khuẩn O3 54 24,8
Vi khuẩn H4 49 22,5
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ 218 100,0
Phân lập từ chất thải trại heo
Vi khuẩn T 48 24,8
Vi khuẩn O2 49 28,0
Vi khuẩn O3 46 24,8
Vi khuẩn H4 48 22,5
Vi khuẩn chuyển hóa nitơ 191 100,0
Vi khuẩn T là vi khuẩn phát triển trên môi trường T (chứa ammonium, nitrite, nitrate) Vi khuẩn O2 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrite
Vi khuẩn O3 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa nitrate Vi khuẩn H4 là vi khuẩn phát triển trên môi trường chứa ammonium Vi khuẩn chuyển hóa nitơ là tổng các loại vi khuẩn T, O2, O3 và H4
4.5. Đặc điểm hình thái khuẩn lạc các dịng vi khuẩn phân lập
Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của từng dịng vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ hai loại chất thải đƣợc trình bày chi tiết trong phụ bảng 5.
4.5.1. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chất thải ao cá tra
Số lƣợng từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua bảng 12. Tỉ lệ phần trăm từng đặc điểm khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua hình 13.
Hình 13 cho thấy các đặc điểm chiếm tỉ lệ cao nhƣ sau: 98,6% khuẩn lạc dạng tròn; 70,2% khuẩn lạc màu trắng đục; 80,3% bìa nguyên; 70,6% mô; 70,2% bề mặt trơn láng; 57,8% đƣờng kính 0,5 – 1,0mm.
Hình 15 trình bày đặc điểm hình thái khuẩn lạc một số dịng vi khuẩn đƣợc phân lập từ chất thải ao cá tra. Các dòng vi khuẩn phân lập từ loại chất thải này chủ yếu có khuẩn lạc hình trịn, màu trắng đục hay trắng trong, bìa ngun, mơ, bề mặt trơn láng và đƣờng kính 0,5 – 1,0 mm.
4.5.2. Đặc điểm khuẩn lạc vi khuẩn phân lập từ chất thải trại heo
Số lƣợng từng loại vi khuẩn chuyển hóa nitơ đƣợc phân lập từ chất thải trại heo tƣơng ứng với từng đặc điểm hình thái khuẩn lạc đƣợc thể hiện chi tiết qua bảng 13. Tỉ