Tuyển chon xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ Enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn P1

MẪU 14KHCN 1 BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CỦA HỆ ENZYME AMYLASE NGOẠI BÀO TỪ XẠ KHUẨN Mã số đề tài 184 TP13 Chủ nhiệm đề tài Nguyễn Thị Diệu Hạnh Đơn vị thực hiện Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh – 122020 2 LỜI CÁM ƠN Chúng tôi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh đã cấp kin.

BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CỦA HỆ ENZYME AMYLASE NGOẠI BÀO TỪ XẠ KHUẨN Mã số đề tài: 184.TP13 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Diệu Hạnh Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh – 12/2020 LỜI CÁM ƠN Chúng tơi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh cấp kinh phí tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu “Tuyển chọn xạ khuẩn phân tích đặc tính hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn” Chúng xin cám ơn phịng Quản lí Khoa học Hợp tác Quốc tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi hồn tất nghiên cứu Đồng thời, trân trọng cám ơn Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện sở vật chất, thiết bị cho việc thực thí nghiệm đề tài Chúng trân trọng cám ơn PGS TS Nguyễn Đình Qn, ThS Trần Thị Tưởng An - Phịng Thí nghiệm Biomass, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ chúng tơi q trình thực đề tài Chân thành cám ơn em sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo, Hứa Trường Chinh, Đặng Bích Ngân, Hứa Huỳnh Minh Thảo tất thành viên Phịng thí nghiêm Cơng nghệ Vi sinh hỗ trợ chúng tơi q trình thực đề tài Trân trọng cám ơn NHÓM TÁC GIẢ PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn xạ khuẩn phân tích đặc tính hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn 1.2 Mã số: 184.TP13 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Ngọc Ẩn Nguyễn Thị Thanh Thúy Nguyễn Thị Thu Trang Hứa Huỳnh Minh Thảo Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Viện CNSH&TP- Chủ nhiệm đề tài thực nội Trường ĐHCN Tp dung: - Tuyển chọn chủng xạ khuẩn HCM có hoạt tính sinh học - Sản xuất dung dich enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn - Các thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme, động học enzyme - Viết đề cương chi tiết - Chịu trách nhiệm tổng thể tất thí nghiệm đề tài - Viết báo cáo tổng kết đề tài, viết báo khoa học Viện CNSH&TP - - Thu thập mẫu đất từ Trường ĐHCN Tp nguồn khác để phân lập xạ khuẩn HCM - Tinh enzyme amylase - Xác định động học enzyme Viện CNSH&TP - - Tinh enzyme amylase Trường ĐHCN Tp - Phân tích kết định danh xạ khuẩn HCM - Xử lý số liệu ĐHSH11ATT- Viện - Phân lập xạ khuẩn CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả sinh enzyme ĐHCN Tp HCM amylase xạ khuẩn - Khảo sát điều kiện cảm ứng sản sinh amylase từ xạ khuẩn ĐHSH11A- Viện - Phân lập xạ khuẩn CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả sinh enzyme ĐHCN Tp HCM amylase xạ khuẩn - Khảo sát điều kiện cảm ứng sản sinh amylase từ xạ khuẩn ĐHSH10A- Viện - Quan sát cấu trúc đại thể, vi thể CNSH&TP -Trường xạ khuẩn ĐHCN Tp HCM - Xác định hoạt tính enzyme 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm 2020 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 11 năm 2018 đến tháng năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 40 triệu đồng (Bốn mươi triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Amylase nhóm enzyme quan trọng có khả thủy giải tinh bột tạo thành loại đường khác fructose, glucose, maltose dextrin trung gian Amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp thực phẩm, ngành công nghệ lên men, dệt may công nghệ sản xuất giấy [1, 2] Amylase sử dụng thành công q trình đường hóa tinh bột, cơng nghệ sản xuất rượu bia, cải thiện chất lượng bột công nghệ làm bánh thành phần công nghệ giặt tẩy [3-5] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy amylase ứng dụng y học, cơng nghệ sinh học hóa học [5, 6] Amylase ba nhóm enzyme sử dụng nhiều enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 25-33% thị trường enzyme toàn giới [7] Amylase thu nhận từ nhiều nguồn khác thực vật, động vật, vi sinh vật chủ yếu sản xuất từ vi sinh vật Amylase vi sinh vật đáp ứng nhu cầu cơng nghiệp gia tăng tổng hợp enzyme kỹ thuật di truyền, phương pháp nuôi cấy liên tục, cảm ứng tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng [8] Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất amylase thuộc chi Bacillus, Streptomyces, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Proteus, Aspergillus Serratia, chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ngày quan tâm [5, 9-12] Streptomyces nhóm vi sinh vật quan trọng có hiệu kinh tế cao thuộc họ actinobacteria Các chủng xạ khuẩn Streptomyces đối tượng sản xuất khoảng 50% hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt chất kháng sinh, kháng khối u, enzyme chất ức chế enzyme, hợp chất kháng khuẩn kháng oxy hóa, chất điều hịa thực vật vitamin [13-15] Streptomyces tham gia vào việc sản xuất nhiều loại enzyme khác đóng vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu cellulase, protease, keratinase, amylase, xylanase, lipase, chitinase, pectinase [5] Với đặc tính chịu nhiệt chịu kiềm cao, việc sản xuất amylase từ xạ khuẩn ngày quan tâm Các amylase chịu nhiệt sản xuất từ xạ khuẩn ứng dụng dễ dàng nhiều ngành cơng nghiệp khác [5] Do đó, việc phân lập chọn lọc chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh tối ưu hóa điều kiện sản xuất amylase từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu nhiều năm gần [16-19] Bên cạnh việc xác định môi trường ni cấy thích hợp để tạo điều kiện cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào xạ khuẩn, đặc tính sinh hóa enzyme cần quan tâm để có sở cho việc ứng dụng enzyme hiệu lĩnh vực khác Hiện nay, nghiên cứu đặc tính hệ enzyme xạ khuẩn Việt Nam nhiều hạn chế Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh amylase ngoại bào tiến hành phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme ngoại bào từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn được, cung cấp thêm đối tượng sản xuất amylase cho nghiên cứu nhiều mục đích khác Mục tiêu a Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh enzyme amylase ngoại bào phân tích đặc tính sinh học hệ enyme amylase từ chủng xạ khuẩn phân lập b Nội dung đề tài - Phân lập chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn sinh tổng hợp amylase Các mẫu đất thu thập từ nhiều địa phương khác tỉnh Tiền Giang Bến Tre, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh Mẫu đất sau pha lỗng nước muối sinh lý trải môi trường thạch Gause I (20,0 g tinh bột tan; 0,5 g MgSO4.7H2O; 3,0 g K2HPO4; 1,0 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 20,0 g agar; nước cất vừa đủ lít; pH 7,27,4) ủ 37C – 10 ngày Các khuẩn lạc riêng rẽ có đặc điểm đặc trưng xạ khuẩn có khả tạo vịng phân giải tinh bột có diện dung dịch lugol chọn cấy ria liên tiếp lần môi trường điều kiện để làm Các khuẩn lạc sau làm giữ giống glycerol 20% -46C cho thí nghiệm 3.2 Đánh giá sơ khả sinh tổng hợp amylase Khả sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn đánh giá sơ thơng qua vịng phân giải tinh bột mơi trường thạch Gause I có diện dung dịch lugol Các chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I 37C 10 ngày Sau thời gian ni ủ, vịng phân giải kiểm tra thuốc thử lugol Khả sản sinh amylase để phân giải tinh bột chủng xạ khuẩn xác định cách so sánh độ lớn vòng phân giải A = D – d với D đường kính vịng phân giải d đường kính khuẩn lạc xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh chọn để nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào 3.3 Định danh xạ khuẩn Căn vào kết khảo sát sơ khả sinh tổng hợp amylase, chủng xạ khuẩn chọn nuôi môi trường Gause I 10 ngày 37C quan sát hình thái đại thể Cấu trúc cuống sinh bào tử quan sát tiêu phòng ẩm kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Chủng xạ khuẩn định danh mức phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA với cặp mồi 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' phương trình PCR sau 95°C - phút, 30 chu kỳ (95°C - 30 giây; 55°C - 40 giây; 72°C - 90 giây) 72°C - phút công ty Nam Khoa Biotek (793/62 Trần Xuân Hưng, Quận 7, Hồ Chí Minh) kết giải trình tự so sánh với sở liệu 16S-rRNA xạ khuẩn có sẵn National Center for Biotechnology Information (NCBI) công cụ BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết giải trình tự chiều vùng trình tự 16S ribosomal RNA kiểm tra độ xác thiết lập trình tự consensus phần mềm FinchTV Seaview Các trình tự gióng phần mềm ClustalX2.1 Cây phả hệ thể mối quan hệ di truyền Mẫu nghiên cứu loài thuộc chi Streptomyces có liệu GenBank xây dựng phầm mềm MrBayes (hoặc Mega5) theo phương pháp Bayesian (hoặc Neighbor joining) 3.4 Xác định hoạt độ amylase phƣơng pháp Bernfeld Hoạt độ amylase enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn xác định thông qua lượng đường khử tạo thành sau phản ứng dịch enzyme thô chất tinh bột 1% Phương pháp dựa sở sử dụng thuốc thử 3,5-acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng sau cho phản ứng với đường khử (sản phẩm thủy phân cellulose) tạo thành 3amino,5-nitro salicylic acid màu đỏ cam có khả hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm [20] Dịch ni cấy xạ khuẩn điều kiện thích hợp thu nhận loại bỏ tế bào cách ly tâm (6.000 vòng/phút 10 phút 4C) để thu nhận dịch enzyme thô amylase ngoại bào Dịch enzyme cho phản ứng với dung dịch tinh bột 1% 10 phút thuốc thử DNS thêm vào để xác định lượng đường khử giải phóng Đơn vị hoạt tính (U) amylase xác định lượng enzyme cần thiết để giải phóng micromole đường khử 37℃ phút 3.5 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gause I lỏng 37C, 150 vòng/phút ngày sử dụng nguồn giống tăng sinh cho thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp enzyme ảnh hưởng nguồn chất, nitơ, điều kiện nhiệt độ, pH khác Hoạt tính amylase dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau loại bỏ tế bào phương pháp ly tâm 6.000 vòng/phút 4C xác định sau 24 nuôi cấy phương pháp Bernfeld Để khảo sát ảnh hưởng nguồn chất, môi trường Gause II với thành phần bao gồm 3,0 g cao thịt; 5,0 g pepton; 5,0 g NaCl; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4 bổ sung 10,0 g chất khác tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp Cơ chất cho kết tổng hợp enzyme cao sử dụng cho thí nghiệm khảo sát Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylase kiểm tra môi trường Gause II với thành phần cacbon cho kết cao thí nghiệm thay nguồn nitơ g tryptone, cao nấm men, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, ure Nguồn chất nitơ cho kết hoạt tính amylase dịch ni cấy cao chọn để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi mơi trường thử nghiệm có nguồn chất nitơ thích hợp ni ủ điều kiện nhiệt độ khác 25C, 30C, 35C, 37C, 40C ± 0,1C Kết chọn lọc từ điều kiện thích hợp nguồn chất, nitơ phù hợp sử dụng khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Môi trường thử nghiệm điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 ± 0,1 nuôi ủ nhiệt độ thích hợp chọn lọc 3.6 Xác định đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn Dung dịch ni cấy có chứa amylase từ xạ khuẩn thu nhận tủa muối (NH4)2SO4 Thu nhận tủa phương pháp ly tâm 13.000 rpm 4C Phần tủa tái hòa tan dung dịch đệm A (glycerol 10%; Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Mercapmetanol 2%) Dung dịch enzyme sau tái hòa tan thẩm tách với màng dialysis có kích thước 3kDa để loại bỏ muối dung dịch 4C qua đêm Dung dịch enzyme sau thẩm tách tiếp tục tinh phương pháp sắc ký trao đổi (HiTrap Q HP × mL; GE Healthcare) Dung dịch cân Buffer A (Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%) dung dịch để rửa giải Buffer B (TrisCl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%; NaCl 1,0M) Tổng thể tích gradient nồng độ NaCl sử dụng 100 ml, tốc độ dòng chảy giữ mức 2ml/phút; phân đoạn với thể tích 2ml thu nhận Kết tinh kiểm tra gel SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 3.7 Xác định đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn Đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn kiểm tra điều kiện phản ứng khác nhiệt độ (25-80°C), giá trị pH (3,0-12,0), ảnh hưởng ion kim loại (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Na+, Ca2+) lên hoạt tính enzyme, độ bền nhiệt enzyme nhiệt độ khác (25-85°C) Hoạt tính enzyme xác định phương pháp Bernfeld (2.2.4) 3.8 Động học enzyme Động học enzyme xác định dựa lực liên kết chất khả xúc tác phản ứng thông qua giá trị Km Vmax phương trình Mechalis-Menten, số liệu phân tích phần mềm Prism 3.0 3.9 Ứng dụng xạ khuẩn xử lý nƣớc thải giàu tinh bột Các chủng xạ khuẩn ni mơi trường thích hợp sản sinh amylase ngoại bào Dịch nuôi cấy sử dụng để xử lý nước thải giàu tinh bột từ sở sản xuất bún tỉnh Tiền Giang Kiểm tra số BOD5, COD, pH, giảm hàm lượng tinh bột nước thải sau trình xử lý với chế phẩm xạ khuẩn Kiểm tra tác động nước thải sau xử lý xạ khuẩn phát triển hạt đậu xanh để khẳng định hiệu xử lý xạ khuẩn lên hệ sinh thái tự nhiên 3.10 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu Giá trị kết thí nghiệm trung bình lần lặp lại Số liệu tính tốn, vẽ biểu đồ Microsoft Excel 2013 xử lý thống kê phương pháp ANOVA phần mềm Statgraphics Centurion 18 Tổng kết kết nghiên cứu Kết nghiên cứu đề tài đạt số hiệu mặt khoa học đào tạo sau: - Phân lập chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào mạnh với chủng RBXK3 - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn xây dựng quy trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn - Tinh amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn với độ tinh ~95% - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn với đặc điểm sinh hóa động học enzyme - Kết đề tài góp phần đào tạo kỹ sư ngành Công nghệ sinh học thơng qua khóa luận tốt nghiệp, bảo vệ thành công vào tháng 5/2019 sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy (DHSH11ATT) Nguyễn Thị Thu Trang (DHSH11A) Đánh giá kết đạt đƣợc kết luận Từ nguồn mẫu đất khác nhau, 20 chủng xạ khuẩn phân lập kiểm tra sinh tổng hợp amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể sinh tổng hợp amylase cao định danh phân tích trình tự 16S rRNA So sánh với ngân hàng liệu NCBI, chủng RBXK3 xác định thuộc chi Streptomyces Điều kiện sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn kiểm tra xác định Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể tổng hợp enzyme tốt mơi trường Gause II có bổ sung 1% chất tinh bột, 0,5% NH4NO3 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme kiểm tra điều kiện khảo sát tương ứng xác định thời gian tối thích 96 ni ủ điều kiện nhiệt độ 37C pH môi trường thích hợp 8,0 Khả hoạt động tốt xạ khuẩn RBXK môi trường pH 8,0 cho thấy tiềm cao việc ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý chất thải tinh bột giặt tẩy chất bẩn có nguồn gốc từ tinh bột điều kiện kiềm hóa cách hiệu quả, đặc biệt hỗ trợ việc phát triển bền vững môi trường đời sống Về đặc tính sinh học hệ enzyme amylase xác định Amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn RBXK3 tinh thể trọng lượng phân tử khoảng 24kDa Các đặc điểm sinh hóa enzyme xác định với điều kiện hoạt động tốt 65°C pH 10,0 Sự diện ion kim loại Na+ với nồng độ thấp (~1mM) điều kiện phản ứng cho hoạt tính cao enzyme thể bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính trì xử lý với nhiệt độ 85°C Các thông số động học amylase cho thấy khả xúc tác mạnh enzyme với Vmax = 1,38 x 109 U/mg Km = 6,05 mg/ml Chế phẩm xạ khuẩn thô thử nghiệm xử lý với nước thải giàu tinh bột Kết cho thấy nước thải nghiệm thức xử lý với chế phẩm xạ khuẩn giảm số BOD5, COD, hàm lượng tinh bột tương đối giá trị pH cân gần trung tính (6,0-6,9) thử nghiệm với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ 0,5%, 1,0%, 2,0% Ngoài ra, kết khảo sát ảnh hưởng nước thải sau xử lý xạ khuẩn lên phát triển hạt đậu xanh khẳng định thêm tiềm ứng dụng loại vi sinh vật Như vậy, việc sử dụng xạ khuẩn hay yếu tố sinh học xử lý nước thải, giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất xử lý mơi trường, góp phần tạo nên mơi trường sống bền vững Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Vi sinh vật có vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu tự nhiên đối tượng cho việc sản xuất enzyme giới Trong đó, amylase ba enzyme sử dụng nhiều thị trường enzyme công nghiệp việc tìm kiếm đối tượng vi sinh vật sản xuất amylase mạnh có khả hoạt động tốt điều kiện cực đoan cần thiết, đặc biệt xạ khuẩn đối tượng tiềm cho sản xuất amylase công nghiệp Trong nghiên cứu này, 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiều mẫu đất khác nhau, chủng xạ khuẩn RBXK3 tuyển chọn định danh thuộc chi Streptomyces Chủng xạ khuẩn thể khả sinh tổng hợp amylase tốt môi trường Gause II chứa 1% chất tinh bột 0,5% NH4NO3 với pH 8,0 37C thời gian lên men 96 Amylase từ chủng RBXK3 có trọng lượng phân tử khoảng 24kDa hoạt động tốt 65°C, pH 10,0 diện ion kim loại Na+ với nồng độ ~1mM Enzyme thể bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính trì xử lý với nhiệt độ 85°C Giá trị Vmax Km xác định tương ứng 1,38 x 109 U/mg 6,05 mg/ml Chế phẩm xạ khuẩn thô giảm số BOD5, COD, hàm lượng tinh bột tương đối giá trị pH cân gần trung tính ứng dụng xử lý nước thải 10 giàu tinh bột Chủng xạ khuẩn RBXK3 cho thấy tiềm sản xuất amylase mơi trường kiềm thay trung tính chủng xạ khuẩn khác ứng dụng nhiều lĩnh vực khác Từ khóa: xạ khuẩn, amylase, phân giải tinh bột, Streptomyces, tinh sạch, đặc tính sinh hóa Tiếng Anh: Microorganisms play an important role in the breakdown of organic compounds in nature and are the object of enzyme production in the world In particular, amylase is one of the three largest used groups in the industrial enzymes, and it is always necessary to select high amylase-producing microorganisms that can work under extreme conditions Notably, actinomycetes are the potential targets for industrial amylase production In this study, 20 strains of actinomycetes were isolated from many different soil samples, of which RBXK3 was selected and identified as Streptomyces sp This strain showed high amylase biosynthesis in Gause II medium containing 1% starch substrate and 0.5% NH4NO3 with pH 8.0 at 37C for 96 hours Amylase from RBXK3 has a molecular weight of about 24kDa and catalyzes starch hydrolysis at condition of 65C, pH 10.0 in the presence of ~1mM Na+ The enzyme exhibits high thermal stability with ~ 90% of the reduced activity after treated with 85°C Vmax and Km values were also determined as 1.38 x 109 U/mg and 6.05 mg/ml, respectively Crude culture of actinomyces decreased the value of BOD5, COD, relative starch content and balanced pH value to near neutral when applied to treat starch-rich wastewater The RBXK3 strain shows superior potential to produce amylase in an alkaline environment instead of the neutral one like other actinomycetes and thus can be applied in many different fields Key words: Actinomyces, amylase, starch hydrolysis, Streptomyces, purification, biochemical characteristics III Sản phẩm đề tài, công bố kết đào tạo 3.1 Kết nghiên cứu (sản phẩm dạng 1,2,3) Yêu cầu khoa học hoặc/và tiêu TT kinh tế - kỹ thuật Tên sản phẩm Đăng ký Đạt đƣợc 11 Giống vi sinh vật (xạ Ít chủng có hoạt -10 chủng xạ khuẩn có khuẩn) hoạt tính sản sinh tính sinh học enzyme chủng định danh phương pháp sinh học phân tử Qui trình sản xuất amylase Đầy đủ thông số kỹ Qui ngoại bào từ xạ khuẩn thuật qui trình, thu amylase ngoại bào từ xạ 10 ml dung dịch khuẩn với thông số enzyme amylase (15- nguồn chất, nitơ, 20U/ml) nhiệt độ pH trình sản xuất 10ml dung dịch enzyme amylase (>2000U/ml) Bài báo IUH Tham gia đào tạo báo khoa học cấp Đã chấp nhận đăng Trường Tạp chí IUH Sinh viên đại học Sinh viên đại học bảo vệ Khóa luận tốt nghiệp Ghi chú: - Các ấn phẩm khoa học (bài báo, báo cáo KH, sách chuyên khảo…) chấp nhận có ghi nhận địa cảm ơn trường ĐH Công Nghiệp Tp HCM cấp kính phí thực nghiên cứu theo quy định - Các ấn phẩm (bản photo) đính kèm phần phụ lục minh chứng cuối báo cáo (đối với ấn phẩm sách, giáo trình cần có photo trang bìa, trang trang cuối kèm thông tin định số hiệu xuất bản) 3.2 Kết đào tạo TT Họ tên Thời gian Tên đề tài thực đề tài Tên chuyên đề NCS Đã bảo vệ Tên luận văn Cao học Sinh viên Đại học 12 Nguyễn Thị tháng Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme amylase Thanh Thúy khảo sát điều kiện sinh tổng hợp X hệ enzyme Nguyễn Thị Thu tháng Tuyển chọn chủng xạ khuẩn sinh tổng hợp enzyme amylase Trang khảo sát điều kiện sinh tổng hợp X hệ enzyme Ghi chú: - Kèm photo trang bìa chuyên đề nghiên cứu sinh/ luận văn/ khóa luận bằng/giấy chứng nhận nghiên cứu sinh/thạc sỹ học viên bảo vệ thành công luận án/ luận văn;( thể phần cuối báo cáo khoa học) IV Tình hình sử dụng kinh phí T Nội dung chi T Kinh phí Kinh phí đƣợc duyệt thực (triệu đồng) (triệu đồng) A Chi phí trực tiếp Th khốn chun mơn Ngun, nhiên vật liệu, 7,6 7,6 Thiết bị, dụng cụ 29,4 29,4 Cơng tác phí Dịch vụ thuê Hội nghị, hội thảo,thù lao nghiệm thu kỳ In ấn, Văn phòng phẩm 3,0 3,0 Chi phí khác B Chi phí gián tiếp Quản lý phí Chi phí điện, nước Ghi Tổng số 13 V Kiến nghị (về phát triển kết nghiên cứu đề tài) - Tiếp tục nghiên cứu thêm đặc tinh sinh học enzyme khả sản sinh kháng sinh chủng xạ khuẩn khác sưu tập đạt - Amylase chủng xạ khuẩn RBXK3 có tính bền nhiệt cao khả hoạt động môi trường tính kiềm cao, mở khả ứng dụng công nghiệp enzyme từ chủng xạ khuẩn này, cần nghiên cứu thêm việc ứng dụng enzyme lĩnh vực cụ thể chăn nuôi, môi trường… VI Phụ lục sản phẩm (liệt kê minh chứng sản phẩm nêu Phần III) - Quy trình sản xuất amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 - Kết định danh chủng xạ khuẩn - Giấy chấp nhận đăng báo Tạp chí IUH - Kết đào tạo Sinh viên Đại học Thành phố Hồ Chí Minh, ngày 10 tháng 12 năm 2020 Chủ nhiệm đề tài Phịng QLKH&HTQT Viện Cơng nghệ Sinh học & Thực Phẩm 14 PHẦN II BÁO CÁO CHI TIẾT ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC (báo cáo tổng kết sau nghiệm thu, bao gồm nội dung góp ý hội đồng nghiệm thu) CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Xạ khuẩn Xạ khuẩn (Actinomycetes) thuộc nhóm Procaryotes, nhóm vi khuẩn Gram dương, chu trình sống có hình thành hệ sợi khuẩn ty, khơng vách ngăn, đầu cuống bào tử hình thành bào tử riêng lẻ chuỗi Đa số xạ khuẩn có cấu tạo dạng sợi (khuẩn ty), khuẩn ty liên kết với tạo thành khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác trắng, vàng, nâu, tím, xám Màu sắc xạ khuẩn đặc điểm phân loại quan trọng Đường kính khuẩn ty xạ khuẩn khoảng từ 0,1 – 0,5 μm Xạ khuẩn hình thành hai loại khuẩn ty khác Khuẩn ty khí sinh hệ sợi mọc bề mặt môi trường tạo thành bề mặt khuẩn lạc xạ khuẩn, từ phát sinh bào tử Khuẩn ty chất hệ sợi cắm sâu vào môi trường làm nhiệm vụ hấp thu chất dinh dưỡng Khuẩn ty chất sinh sắc tố thấm vào mơi trường, sắc tố thường có màu khác với màu khuẩn ty khí sinh Đây đặc điểm phân loại quan trọng Hình 1.1: Hình dạng khuẩn lạc xạ khuẩn với màu sắc khuẩn ty chất khuẩn ty khí sinh sắc tố tạo thành khác từ chủng xạ khuẩn Streptomyces spp [21] Khuẩn lạc xạ khuẩn thường rắn chắc, xù xì, có dạng da, dạng phấn, dạng nhung, dạng vơi phụ thuộc vào kích thước bào tử Trường hợp khơng có khuẩn ty khí sinh, khuẩn lạc có dạng màng dẻo Kích thước khuẩn lạc thay đổi tuỳ lồi xạ khuẩn tuỳ điều 15 kiện ni cấy Khuẩn lạc thường có dạng phóng xạ (vì mà gọi xạ khuẩn), số có dạng vòng tròn đồng tâm cách khoảng định Nguyên nhân tượng vòng tròn đồng tâm xạ khuẩn sinh chất ức chế sinh trưởng, sợi mọc qua vùng chúng sinh trưởng yếu đi, qua vùng có chất ức chế chúng lại sinh trưởng mạnh thành vòng tiếp theo, vòng lại sinh chất ức chế sinh trưởng sát với khiến khuẩn ty lại phát triển yếu Cứ tạo thành khuẩn lạc có dạng vịng trịn đồng tâm Xạ khuẩn sinh sản sinh dưỡng bào tử Bào tử hình thành nhánh phân hố từ khuẩn ty khí sinh gọi cuống sinh bào tử Cuống sinh bào tử loài xạ khuẩn có kích thước hình dạng khác nhau, có lồi dài tới 100 - 200 nm, có lồi khoảng 20 - 30 nm, có lồi cấu trúc theo hình lượn sóng, có lồi lị xo hay xoắn ốc Đồng thời, xếp cuống sinh bào tử khác Các cuống sinh bào tử xếp theo kiểu mọc đơn, mọc đơi, mọc vịng chùm Đặc điểm hình dạng cuống sinh bào tử tiêu chuẩn để phân loại xạ khuẩn Bào tử hình thành từ cuống sinh bào tử theo kiểu kết đoạn (fragmentation) cắt khúc (segmentation) Ngồi hình thức sinh sản bào tử, xạ khuẩn cịn sinh sản khuẩn ty Các đoạn khuẩn ty gãy môi trường phát triển thành hệ khuẩn ty [21] Hình 1.2: Hình dạng cuống sinh bào tử Streptomyces spp sơ đồ SEM [21] Xạ khuẩn nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi tự nhiên, có nhiều đất, chúng tham gia vào trình phân giải mạnh hợp chất hữu cellulose, tinh bột, protein, chitin, keratin, pectin, lignin, góp phần khép kín vịng tuần hồn vật chất tự nhiên Đặc tính cịn ứng dụng trình chế biến, phân huỷ chất thải Nhiều xạ khuẩn có khả tổng hợp mạnh enzyme protease, amylase, 16 chitinase, cellulase Đặc điểm sử dụng nghiên cứu sản xuất chế phẩm dùng nông nghiệp, bảo quản thực phẩm xử lý môi trường [22] 1.2 Enzyme amylase Amylase loại enzyme thuỷ phân tinh bột quan trọng cơng nghệ sinh học, có khả phân cắt liên kết chất amylose amylopectin, làm tăng tốc độ đường hoá tinh bột nguyên liệu giúp phản ứng xảy nhanh chóng, rút ngắn thời gian hình thành sản phẩm Amylase thu nhận từ vi sinh vật nói chung, từ xạ khuẩn nói riêng có nhiều ưu điểm bật loại amylase từ thực vật động vật hoạt tính cao hơn, khả chịu nhiệt cao, sản xuất quy mô công nghiệp với nguồn nguyên liệu đơn giản rẻ tiền Với ưu trội, xạ khuẩn trở thành nguồn nguyên liệu dồi dào, đầy hứa hẹn cho ngành công nghiệp sản xuất enzyme Do đó, vịng năm gần đây, chế phẩm enzyme từ xạ khuẩn dần thay enzyme từ động vật Với phạm vi ứng dụng nhiều lĩnh vực khác công nghệ thực phẩm, dược phẩm, công nghệ lên men, công nghệ dệt nên khối lượng chế phẩm amylase sản xuất hàng năm giới lên tới hàng chục vạn ngày gia tăng Chính vậy, việc tìm kiếm chủng xạ khuẩn sinh amylase cao thu hút quan tâm nhiều nhà khoa học ngồi nước  Phân Loại Hình 1.3: Phân loại amylase Enzyme α-amylase (1,4-α-D-glucan glucanohydrolase; glycogenase) 17 α-amylase xúc tác thủy phân ngẫu nhiên liên kết α-1,4-glycoside tinh bột polysaccharide khác α-amylase có nguồn gốc khác có nhiều điểm giống Dưới tác dụng α-amylase, chất bị chuyển hóa thành maltose, glucose dextrin có khối lượng phân tử thấp Tuy nhiên, sản phẩm thủy phân thông thường αamylase chủ yếu dextrin có khối lượng phân tử thấp (khơng cho màu với iodine) maltose Khả dextrin hóa cao xem tính chất đặc trưng α-amylase Vì vậy, α-amylase cịn gọi amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Enzyme β-amylase (1,4-α-D-glucan maltohydrolase; glycogenase) β-amylase xúc tác thủy phân liên kết α-1,4-glycoside thứ hai mạch tinh bột để tạo thành đường đôi maltose β-amylase xúc tác trình thủy phân đầu khơng khử nhánh ngồi chất β-amylase xúc tác trình thủy phân liên kết α-1,4-glycoside gặp liên kết α-1,4-glycoside đứng kế cận liên kết α-1,6-glycoside ngừng xúc tác Tinh bột bị thuỷ phân khoảng 95% có xúc tác α-amylase β-amylase Enzyme γ-amylase (Glucan 1,4-α-glucosidase; amyloglucosidase; Exo-1,4-α-glucosidase; 1,4-α-D-glucan glucohydrolase): γ-amylase giúp xúc tác thủy phân liên kết α-1,6-glycoside liên kết cuối α1,4-glycoside mạch polysaccharide từ đầu không khử, tách gốc glucose từ đầu không khử mạch để tạo gốc glucose tự 1.3 Một số nghiên cứu thực tiễn Ứng dụng xạ khuẩn nghiên cứu nhiều lĩnh vực khác hệ enzyme amylase, protease… Hệ enzyme phong phú xạ khuẩn nghiên cứu nhiều lĩnh vực xử lý rác thải môi trường, xử lí nước thải, thuốc kháng sinh [5] Nhiều nghiên cứu thực để tìm chủng xạ khuẩn có khả sản sinh enzyme ngoại bào cao, đặc biệt amylase Nhóm tác giả Sathya Rengasamy tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả phân giải tinh bột tổng số 65 chủng phân lập từ mẫu nước biển khác [16] Chủng xạ khuẩn Streptomyces sp Al-Dhabi-46 với khả sinh tổng hợp amylase cao tuyển chọn từ 17 chủng xạ khuẩn nghiên cứu Naif Abdullah AlDhabi công (2020) [23], chủng Streptomyces fragilis DA7-7 sàng lọc từ 134 18 chủng phân lập từ mẫu đất sa mạc nghiên cứu Krishnasamy Nithya cộng [24] chủng Streptomyces sp SLBA-08 chọn lọc từ 286 chủng xạ khuẩn nghiên cứu Santos cộng (2012) [25] Bên cạnh nghiên cứu tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase, nhiều nghiên cứu thực để khảo sát điều kiện môi trường cho sinh tổng hợp enzyme từ chủng xạ khuẩn tiềm [18, 25, 26] Ngoài ra, nghiên cứu tinh kiểm tra đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn thực năm gần [19, 23, 24, 27] Các nghiên cứu cho thấy tiềm ứng dụng amylase chủng xạ khuẩn lĩnh vực khác thực tiễn Wael N Hozzein, Mohammed Bastawy Ahmed and Marzouka Shaban Abdel Tawab (2012) phân lập tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả xử lý loại bỏ kim loại nặng từ nước thải [2] Ở Việt Nam có nhiều nghiên cứu ứng xạ khuẩn lĩnh vực nông nghiệp, y học, môi trường gần năm 2018 có sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo cộng sản xuất chế phẩm bước đầu xử lí nước thải nghề làm bún giàu tinh bột thành phần khác trường Đại Học Công Nghiệp TP HCM (Khoá luận tốt nghiệp sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo, năm 2018) 19 ... tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh enzyme amylase ngoại bào phân tích đặc tính sinh học hệ enyme amylase từ chủng xạ khuẩn phân lập b Nội dung đề tài - Phân lập chủng xạ khuẩn. .. chủng xạ khuẩn chọn xây dựng quy trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn - Tinh amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn với độ tinh ~95% - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn. .. khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn - Phân tích đặc tính sinh