Tuyển chon xạ khuẩn và phân tích đặc tính của hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn

BỘ CÔNG THƢƠNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH BÁO CÁO TỔNG KẾT ĐỀ TÀI KHOA HỌC KẾT QUẢ THỰC HIỆN ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU KHOA HỌC CẤP TRƢỜNG Tên đề tài: TUYỂN CHỌN XẠ KHUẨN VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CỦA HỆ ENZYME AMYLASE NGOẠI BÀO TỪ XẠ KHUẨN Mã số đề tài: 184.TP13 Chủ nhiệm đề tài: Nguyễn Thị Diệu Hạnh Đơn vị thực hiện: Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm Tp Hồ Chí Minh – 12/2020 LỜI CÁM ƠN Chúng tơi xin chân thành cám ơn Trường Đại học Công nghiệp Thành phố Hồ Chí Minh cấp kinh phí tạo điều kiện thuận lợi cho nghiên cứu “Tuyển chọn xạ khuẩn phân tích đặc tính hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn” Chúng xin cám ơn phịng Quản lí Khoa học Hợp tác Quốc tạo điều kiện thuận lợi cho chúng tơi hồn tất nghiên cứu Đồng thời, trân trọng cám ơn Viện Công nghệ Sinh học Thực phẩm tạo điều kiện sở vật chất, thiết bị cho việc thực thí nghiệm đề tài Chúng trân trọng cám ơn PGS TS Nguyễn Đình Qn, ThS Trần Thị Tưởng An - Phịng Thí nghiệm Biomass, Trường Đại học Bách Khoa Thành phố Hồ Chí Minh hỗ trợ chúng tơi q trình thực đề tài Chân thành cám ơn em sinh viên Bùi Thảo Vy, Đặng Lương Phương Thảo, Hứa Trường Chinh, Đặng Bích Ngân, Hứa Huỳnh Minh Thảo tất thành viên Phịng thí nghiêm Cơng nghệ Vi sinh hỗ trợ chúng tơi q trình thực đề tài Trân trọng cám ơn NHÓM TÁC GIẢ PHẦN I THƠNG TIN CHUNG I Thơng tin tổng quát 1.1 Tên đề tài: Tuyển chọn xạ khuẩn phân tích đặc tính hệ enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn 1.2 Mã số: 184.TP13 1.3 Danh sách chủ trì, thành viên tham gia thực đề tài TT Họ tên (học hàm, học vị) TS Nguyễn Thị Diệu Hạnh TS Phạm Tấn Việt TS Nguyễn Ngọc Ẩn Nguyễn Thị Thanh Thúy Nguyễn Thị Thu Trang Hứa Huỳnh Minh Thảo Đơn vị cơng tác Vai trị thực đề tài Viện CNSH&TP- Chủ nhiệm đề tài thực nội Trường ĐHCN Tp dung: - Tuyển chọn chủng xạ khuẩn HCM có hoạt tính sinh học - Sản xuất dung dich enzyme amylase ngoại bào từ xạ khuẩn - Các thí nghiệm xác định hoạt tính enzyme, động học enzyme - Viết đề cương chi tiết - Chịu trách nhiệm tổng thể tất thí nghiệm đề tài - Viết báo cáo tổng kết đề tài, viết báo khoa học Viện CNSH&TP - - Thu thập mẫu đất từ Trường ĐHCN Tp nguồn khác để phân lập xạ khuẩn HCM - Tinh enzyme amylase - Xác định động học enzyme Viện CNSH&TP - - Tinh enzyme amylase Trường ĐHCN Tp - Phân tích kết định danh xạ khuẩn HCM - Xử lý số liệu ĐHSH11ATT- Viện - Phân lập xạ khuẩn CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả sinh enzyme ĐHCN Tp HCM amylase xạ khuẩn - Khảo sát điều kiện cảm ứng sản sinh amylase từ xạ khuẩn ĐHSH11A- Viện - Phân lập xạ khuẩn CNSH&TP -Trường - Khảo sát khả sinh enzyme ĐHCN Tp HCM amylase xạ khuẩn - Khảo sát điều kiện cảm ứng sản sinh amylase từ xạ khuẩn ĐHSH10A- Viện - Quan sát cấu trúc đại thể, vi thể CNSH&TP -Trường xạ khuẩn ĐHCN Tp HCM - Xác định hoạt tính enzyme 1.4 Đơn vị chủ trì: Viện Công nghệ sinh học thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp Tp Hồ Chí Minh 1.5 Thời gian thực hiện: 1.5.1 Theo hợp đồng: từ tháng 10 năm 2018 đến tháng 10 năm 2019 1.5.2 Gia hạn (nếu có): đến tháng năm 2020 1.5.3 Thực thực tế: từ tháng 11 năm 2018 đến tháng năm 2020 1.6 Những thay đổi so với thuyết minh ban đầu (nếu có): Khơng có thay đổi so với thuyết minh ban đầu 1.7 Tổng kinh phí đƣợc phê duyệt đề tài: 40 triệu đồng (Bốn mươi triệu đồng chẵn) II Kết nghiên cứu Đặt vấn đề Amylase nhóm enzyme quan trọng có khả thủy giải tinh bột tạo thành loại đường khác fructose, glucose, maltose dextrin trung gian Amylase ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực khác công nghiệp thực phẩm, ngành công nghệ lên men, dệt may công nghệ sản xuất giấy [1, 2] Amylase sử dụng thành công q trình đường hóa tinh bột, cơng nghệ sản xuất rượu bia, cải thiện chất lượng bột công nghệ làm bánh thành phần công nghệ giặt tẩy [3-5] Ngoài ra, nhiều nghiên cứu cho thấy amylase ứng dụng y học, cơng nghệ sinh học hóa học [5, 6] Amylase ba nhóm enzyme sử dụng nhiều enzyme công nghiệp, chiếm khoảng 25-33% thị trường enzyme toàn giới [7] Amylase thu nhận từ nhiều nguồn khác thực vật, động vật, vi sinh vật chủ yếu sản xuất từ vi sinh vật Amylase vi sinh vật đáp ứng nhu cầu cơng nghiệp gia tăng tổng hợp enzyme kỹ thuật di truyền, phương pháp nuôi cấy liên tục, cảm ứng tối ưu hóa điều kiện sinh trưởng [8] Các chủng vi sinh vật thường sử dụng để sản xuất amylase thuộc chi Bacillus, Streptomyces, Micrococcus, Pseudomonas, Arthrobacter, Escherichia, Proteus, Aspergillus Serratia, chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces ngày quan tâm [5, 9-12] Streptomyces nhóm vi sinh vật quan trọng có hiệu kinh tế cao thuộc họ actinobacteria Các chủng xạ khuẩn Streptomyces đối tượng sản xuất khoảng 50% hợp chất trao đổi thứ cấp, đặc biệt chất kháng sinh, kháng khối u, enzyme chất ức chế enzyme, hợp chất kháng khuẩn kháng oxy hóa, chất điều hịa thực vật vitamin [13-15] Streptomyces tham gia vào việc sản xuất nhiều loại enzyme khác đóng vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu cellulase, protease, keratinase, amylase, xylanase, lipase, chitinase, pectinase [5] Với đặc tính chịu nhiệt chịu kiềm cao, việc sản xuất amylase từ xạ khuẩn ngày quan tâm Các amylase chịu nhiệt sản xuất từ xạ khuẩn ứng dụng dễ dàng nhiều ngành cơng nghiệp khác [5] Do đó, việc phân lập chọn lọc chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh tối ưu hóa điều kiện sản xuất amylase từ chủng xạ khuẩn nghiên cứu nhiều năm gần [16-19] Bên cạnh việc xác định môi trường ni cấy thích hợp để tạo điều kiện cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào xạ khuẩn, đặc tính sinh hóa enzyme cần quan tâm để có sở cho việc ứng dụng enzyme hiệu lĩnh vực khác Hiện nay, nghiên cứu đặc tính hệ enzyme xạ khuẩn Việt Nam nhiều hạn chế Do đó, chúng tơi tiến hành nghiên cứu tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh amylase ngoại bào tiến hành phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme ngoại bào từ chủng xạ khuẩn tuyển chọn được, cung cấp thêm đối tượng sản xuất amylase cho nghiên cứu nhiều mục đích khác Mục tiêu a Mục tiêu đề tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh enzyme amylase ngoại bào phân tích đặc tính sinh học hệ enyme amylase từ chủng xạ khuẩn phân lập b Nội dung đề tài - Phân lập chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn Phƣơng pháp nghiên cứu 3.1 Phân lập tuyển chọn xạ khuẩn sinh tổng hợp amylase Các mẫu đất thu thập từ nhiều địa phương khác tỉnh Tiền Giang Bến Tre, Tây Ninh, Tp Hồ Chí Minh Mẫu đất sau pha lỗng nước muối sinh lý trải môi trường thạch Gause I (20,0 g tinh bột tan; 0,5 g MgSO4.7H2O; 3,0 g K2HPO4; 1,0 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; 20,0 g agar; nước cất vừa đủ lít; pH 7,27,4) ủ 37C – 10 ngày Các khuẩn lạc riêng rẽ có đặc điểm đặc trưng xạ khuẩn có khả tạo vịng phân giải tinh bột có diện dung dịch lugol chọn cấy ria liên tiếp lần môi trường điều kiện để làm Các khuẩn lạc sau làm giữ giống glycerol 20% -46C cho thí nghiệm 3.2 Đánh giá sơ khả sinh tổng hợp amylase Khả sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn đánh giá sơ thơng qua vịng phân giải tinh bột mơi trường thạch Gause I có diện dung dịch lugol Các chủng xạ khuẩn nuôi cấy môi trường Gause I 37C 10 ngày Sau thời gian ni ủ, vịng phân giải kiểm tra thuốc thử lugol Khả sản sinh amylase để phân giải tinh bột chủng xạ khuẩn xác định cách so sánh độ lớn vòng phân giải A = D – d với D đường kính vịng phân giải d đường kính khuẩn lạc xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp amylase mạnh chọn để nghiên cứu điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase ngoại bào 3.3 Định danh xạ khuẩn Căn vào kết khảo sát sơ khả sinh tổng hợp amylase, chủng xạ khuẩn chọn nuôi môi trường Gause I 10 ngày 37C quan sát hình thái đại thể Cấu trúc cuống sinh bào tử quan sát tiêu phòng ẩm kính hiển vi độ phóng đại 1000 lần Chủng xạ khuẩn định danh mức phân tử phương pháp giải trình tự đoạn gen 16S-rRNA với cặp mồi 27F 5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3' 1492R 5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3' phương trình PCR sau 95°C - phút, 30 chu kỳ (95°C - 30 giây; 55°C - 40 giây; 72°C - 90 giây) 72°C - phút công ty Nam Khoa Biotek (793/62 Trần Xuân Hưng, Quận 7, Hồ Chí Minh) kết giải trình tự so sánh với sở liệu 16S-rRNA xạ khuẩn có sẵn National Center for Biotechnology Information (NCBI) công cụ BLASTN (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi) Kết giải trình tự chiều vùng trình tự 16S ribosomal RNA kiểm tra độ xác thiết lập trình tự consensus phần mềm FinchTV Seaview Các trình tự gióng phần mềm ClustalX2.1 Cây phả hệ thể mối quan hệ di truyền Mẫu nghiên cứu loài thuộc chi Streptomyces có liệu GenBank xây dựng phầm mềm MrBayes (hoặc Mega5) theo phương pháp Bayesian (hoặc Neighbor joining) 3.4 Xác định hoạt độ amylase phƣơng pháp Bernfeld Hoạt độ amylase enzyme ngoại bào từ xạ khuẩn xác định thông qua lượng đường khử tạo thành sau phản ứng dịch enzyme thô chất tinh bột 1% Phương pháp dựa sở sử dụng thuốc thử 3,5-acid dinitrosalicylic (DNS) có màu vàng sau cho phản ứng với đường khử (sản phẩm thủy phân cellulose) tạo thành 3amino,5-nitro salicylic acid màu đỏ cam có khả hấp thụ cực đại bước sóng 540 nm [20] Dịch ni cấy xạ khuẩn điều kiện thích hợp thu nhận loại bỏ tế bào cách ly tâm (6.000 vòng/phút 10 phút 4C) để thu nhận dịch enzyme thô amylase ngoại bào Dịch enzyme cho phản ứng với dung dịch tinh bột 1% 10 phút thuốc thử DNS thêm vào để xác định lượng đường khử giải phóng Đơn vị hoạt tính (U) amylase xác định lượng enzyme cần thiết để giải phóng micromole đường khử 37℃ phút 3.5 Khảo sát điều kiện nuôi cấy thích hợp cho sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi môi trường Gause I lỏng 37C, 150 vòng/phút ngày sử dụng nguồn giống tăng sinh cho thí nghiệm khảo sát điều kiện sinh tổng hợp enzyme ảnh hưởng nguồn chất, nitơ, điều kiện nhiệt độ, pH khác Hoạt tính amylase dịch nuôi cấy xạ khuẩn sau loại bỏ tế bào phương pháp ly tâm 6.000 vòng/phút 4C xác định sau 24 nuôi cấy phương pháp Bernfeld Để khảo sát ảnh hưởng nguồn chất, môi trường Gause II với thành phần bao gồm 3,0 g cao thịt; 5,0 g pepton; 5,0 g NaCl; nước cất vừa đủ lít; pH 7,2-7,4 bổ sung 10,0 g chất khác tinh bột, bột gạo, bột mì, bột bắp Cơ chất cho kết tổng hợp enzyme cao sử dụng cho thí nghiệm khảo sát Ảnh hưởng nguồn nitơ lên sinh tổng hợp amylase kiểm tra môi trường Gause II với thành phần cacbon cho kết cao thí nghiệm thay nguồn nitơ g tryptone, cao nấm men, NaNO3, (NH4)2SO4, NH4NO3, NH4Cl, ure Nguồn chất nitơ cho kết hoạt tính amylase dịch ni cấy cao chọn để tiếp tục khảo sát ảnh hưởng nhiệt độ nuôi cấy lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn nuôi mơi trường thử nghiệm có nguồn chất nitơ thích hợp ni ủ điều kiện nhiệt độ khác 25C, 30C, 35C, 37C, 40C ± 0,1C Kết chọn lọc từ điều kiện thích hợp nguồn chất, nitơ phù hợp sử dụng khảo sát ảnh hưởng pH môi trường lên sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn Môi trường thử nghiệm điều chỉnh giá trị pH ban đầu khác 4,0; 5,0; 6,0; 7,0; 8,0; 9,0 ± 0,1 nuôi ủ nhiệt độ thích hợp chọn lọc 3.6 Xác định đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn Dung dịch ni cấy có chứa amylase từ xạ khuẩn thu nhận tủa muối (NH4)2SO4 Thu nhận tủa phương pháp ly tâm 13.000 rpm 4C Phần tủa tái hòa tan dung dịch đệm A (glycerol 10%; Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Mercapmetanol 2%) Dung dịch enzyme sau tái hòa tan thẩm tách với màng dialysis có kích thước 3kDa để loại bỏ muối dung dịch 4C qua đêm Dung dịch enzyme sau thẩm tách tiếp tục tinh phương pháp sắc ký trao đổi (HiTrap Q HP × mL; GE Healthcare) Dung dịch cân Buffer A (Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%) dung dịch để rửa giải Buffer B (TrisCl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%; NaCl 1,0M) Tổng thể tích gradient nồng độ NaCl sử dụng 100 ml, tốc độ dòng chảy giữ mức 2ml/phút; phân đoạn với thể tích 2ml thu nhận Kết tinh kiểm tra gel SDSPAGE (Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) 3.7 Xác định đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn Đặc tính sinh hóa amylase từ xạ khuẩn kiểm tra điều kiện phản ứng khác nhiệt độ (25-80°C), giá trị pH (3,0-12,0), ảnh hưởng ion kim loại (Mg2+, Mn2+, Zn2+, Cu2+, Fe2+, Fe3+, K+, Na+, Ca2+) lên hoạt tính enzyme, độ bền nhiệt enzyme nhiệt độ khác (25-85°C) Hoạt tính enzyme xác định phương pháp Bernfeld (2.2.4) 3.8 Động học enzyme Động học enzyme xác định dựa lực liên kết chất khả xúc tác phản ứng thông qua giá trị Km Vmax phương trình Mechalis-Menten, số liệu phân tích phần mềm Prism 3.0 3.9 Ứng dụng xạ khuẩn xử lý nƣớc thải giàu tinh bột Các chủng xạ khuẩn ni mơi trường thích hợp sản sinh amylase ngoại bào Dịch nuôi cấy sử dụng để xử lý nước thải giàu tinh bột từ sở sản xuất bún tỉnh Tiền Giang Kiểm tra số BOD5, COD, pH, giảm hàm lượng tinh bột nước thải sau trình xử lý với chế phẩm xạ khuẩn Kiểm tra tác động nước thải sau xử lý xạ khuẩn phát triển hạt đậu xanh để khẳng định hiệu xử lý xạ khuẩn lên hệ sinh thái tự nhiên 3.10 Phƣơng pháp thống kê xử lý số liệu Giá trị kết thí nghiệm trung bình lần lặp lại Số liệu tính tốn, vẽ biểu đồ Microsoft Excel 2013 xử lý thống kê phương pháp ANOVA phần mềm Statgraphics Centurion 18 Tổng kết kết nghiên cứu Kết nghiên cứu đề tài đạt số hiệu mặt khoa học đào tạo sau: - Phân lập chủng xạ khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào mạnh với chủng RBXK3 - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn xây dựng quy trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn - Tinh amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn với độ tinh ~95% - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn với đặc điểm sinh hóa động học enzyme - Kết đề tài góp phần đào tạo kỹ sư ngành Công nghệ sinh học thơng qua khóa luận tốt nghiệp, bảo vệ thành công vào tháng 5/2019 sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thúy (DHSH11ATT) Nguyễn Thị Thu Trang (DHSH11A) Đánh giá kết đạt đƣợc kết luận Từ nguồn mẫu đất khác nhau, 20 chủng xạ khuẩn phân lập kiểm tra sinh tổng hợp amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể sinh tổng hợp amylase cao định danh phân tích trình tự 16S rRNA So sánh với ngân hàng liệu NCBI, chủng RBXK3 xác định thuộc chi Streptomyces Điều kiện sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn kiểm tra xác định Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể tổng hợp enzyme tốt mơi trường Gause II có bổ sung 1% chất tinh bột, 0,5% NH4NO3 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme kiểm tra điều kiện khảo sát tương ứng xác định thời gian tối thích 96 ni ủ điều kiện nhiệt độ 37C pH môi trường thích hợp 8,0 Khả hoạt động tốt xạ khuẩn RBXK môi trường pH 8,0 cho thấy tiềm cao việc ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý chất thải tinh bột giặt tẩy chất bẩn có nguồn gốc từ tinh bột điều kiện kiềm hóa cách hiệu quả, đặc biệt hỗ trợ việc phát triển bền vững môi trường đời sống Về đặc tính sinh học hệ enzyme amylase xác định Amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn RBXK3 tinh thể trọng lượng phân tử khoảng 24kDa Các đặc điểm sinh hóa enzyme xác định với điều kiện hoạt động tốt 65°C pH 10,0 Sự diện ion kim loại Na+ với nồng độ thấp (~1mM) điều kiện phản ứng cho hoạt tính cao enzyme thể bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính trì xử lý với nhiệt độ 85°C Các thông số động học amylase cho thấy khả xúc tác mạnh enzyme với Vmax = 1,38 x 109 U/mg Km = 6,05 mg/ml Chế phẩm xạ khuẩn thô thử nghiệm xử lý với nước thải giàu tinh bột Kết cho thấy nước thải nghiệm thức xử lý với chế phẩm xạ khuẩn giảm số BOD5, COD, hàm lượng tinh bột tương đối giá trị pH cân gần trung tính (6,0-6,9) thử nghiệm với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ 0,5%, 1,0%, 2,0% Ngoài ra, kết khảo sát ảnh hưởng nước thải sau xử lý xạ khuẩn lên phát triển hạt đậu xanh khẳng định thêm tiềm ứng dụng loại vi sinh vật Như vậy, việc sử dụng xạ khuẩn hay yếu tố sinh học xử lý nước thải, giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất xử lý mơi trường, góp phần tạo nên mơi trường sống bền vững Tóm tắt kết (tiếng Việt tiếng Anh) Tiếng Việt: Vi sinh vật có vai trị quan trọng việc phân hủy hợp chất hữu tự nhiên đối tượng cho việc sản xuất enzyme giới Trong đó, amylase ba enzyme sử dụng nhiều thị trường enzyme công nghiệp việc tìm kiếm đối tượng vi sinh vật sản xuất amylase mạnh có khả hoạt động tốt điều kiện cực đoan cần thiết, đặc biệt xạ khuẩn đối tượng tiềm cho sản xuất amylase công nghiệp Trong nghiên cứu này, 20 chủng xạ khuẩn phân lập từ nhiều mẫu đất khác nhau, chủng xạ khuẩn RBXK3 tuyển chọn định danh thuộc chi Streptomyces Chủng xạ khuẩn thể khả sinh tổng hợp amylase tốt môi trường Gause II chứa 1% chất tinh bột 0,5% NH4NO3 với pH 8,0 37C thời gian lên men 96 Amylase từ chủng RBXK3 có trọng lượng phân tử khoảng 24kDa hoạt động tốt 65°C, pH 10,0 diện ion kim loại Na+ với nồng độ ~1mM Enzyme thể bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính trì xử lý với nhiệt độ 85°C Giá trị Vmax Km xác định tương ứng 1,38 x 109 U/mg 6,05 mg/ml Chế phẩm xạ khuẩn thô giảm số BOD5, COD, hàm lượng tinh bột tương đối giá trị pH cân gần trung tính ứng dụng xử lý nước thải 10 51,53% 55,32% sau 10 ngày xử lý [35] thấp nghiên cứu xử lý nước thải xạ khuẩn Wael N Hozzein cộng (2012) với việc giảm giá trị BOD5 COD tương ứng 68,1-95,4% 47,7-84,7% [36], nghiên cứu More cộng (2001) với giảm COD 70-80% [37] Ngoài ra, giá trị pH nước thải ban đầu từ 3,2 dần điều chỉnh tăng mức acid yếu (pH 6,0) gần trung tính (pH 6,9) xử lý với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác Sự điều chỉnh giá trị pH mức cần ghi nhận nghiên cứu sử dụng chủng xạ khuẩn để xử lý nước thải Amany G Madkour cộng (2019) với giá trị pH điều chỉnh từ pH 9,32 thành pH 8,283 [38] Bên cạnh đó, kết hàm lượng tinh bột tương đối nước thải giảm chứng minh khả chuyển hóa hợp chất hữu để phục vụ cho sinh trưởng phát triển xạ khuẩn, giảm thiểu chất hữu gây nhiễm nước thải Ngồi ra, kết phân tích thống kê cho thấy khơng có khác biệt đáng kể nghiệm thức bổ sung tỉ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác (0,5%-2,0%) (ANOVA, n=3, độ tin cậy 95%) lên thay đổi giá trị BOD5, tinh bột pH nước thải sau xử lý Do đó, với kết thu nhận cho thấy hiệu tích cực đối tượng vi sinh vật việc xử lý nước thải giàu tinh bột Hình 3.16 Các tiêu nước thải giàu tinh bột sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn (A) Chỉ tiêu BOD5 20C; (B) Chỉ tiêu COD 20C; (C) Sự thay đổi hàm lượng tinh bột (D) Sự thay đổi giá trị pH sau xử lý chế phẩm xạ khuẩn 43 Ngoài ra, ảnh hưởng nước thải giàu tinh bột xử lý với chế phẩm xạ khuẩn lên phát triển hạt đậu xanh kiểm tra để đánh giá tác động lên sinh trưởng sinh vật Nước thải từ nhiều nguồn khác thải môi trường, thấm vào đất, mạch nước ngầm, vào ao, hồ, sông, suối ảnh hưởng lớn đến sinh trưởng phát triển nhiều loài sinh vật khác Để đánh giá hiệu xử lý nước thải giàu tinh bột chế phẩm xạ khuẩn, tiến hành nuôi ủ hạt đậu xanh quan sát phát triển chúng tưới nước thải không xử lý, nước thải xử lý với tỷ lệ chế phẩm xạ khuẩn khác 0,5%, 1,0%, 2,0%, mẫu tưới nước cất nghiệm thức đối chứng dương Sau ngày nuôi ủ, kết phát triển hạt đậu xanh quan sát thấy thể hình 3.17 Hình 3.17: Đặc điểm phát triển hạt đậu xanh tưới nước thải sản xuất bún sau xử lý với chế phẩm xạ khuẩn Kết quan sát phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải xử lý chế phẩm xạ khuẩn cho kết tốt cách rõ rệt không xử lý với xạ khuẩn Sự phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải không xử lý với chế phẩm xạ khuẩn với thân ngắn, cong, rễ ngắn, phần lớn mầm bị nhiễm khuẩn, thối nhũn Quan sát phát triển hạt đậu xanh tưới với nước thải xử lý với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ 1,0% 2,0% cho thấy thân dài xấp xỉ mẫu đối chứng (75%-100% chiều dài thân so với đối chứng), nhiễm khuẩn thối nhũn bề mặt mầm giảm đáng kể với số lượng diện tích thối nhũn bề mặt giảm (1 cây/13 bị thối nhũn) Mặc dù phát triển hạt đậu xanh khơng hồn tồn tương tự đối chứng kết xác nhận hiệu xử lý nước thải giàu tinh bột chế phẩm xạ khuẩn Việc sản sinh chất trao đổi thứ cấp có khả ức chế phát triển vi khuẩn xạ khuẩn quan sát thấy nhiều nghiên cứu khác nhau, ứng dụng sản xuất kháng sinh từ xạ khuẩn, giảm thiểu tượng nhiễm khuẩn thối nhũn bề mặt 44 mầm khẳng định hoạt động hiệu xạ khuẩn chế phẩm xử lý nước thải giàu tinh bột [13-15] CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1 Kết luận Qua đề tài, đạt kết sau: - Từ nguồn mẫu đất khác nhau, 20 chủng xạ khuẩn phân lập kiểm tra sinh tổng hợp amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể sinh tổng hợp amylase cao định danh phân tích trình tự 16S rRNA So sánh với ngân hàng liệu NCBI, chủng RBXK3 xác định thuộc chi Streptomyces Điều kiện sinh tổng hợp amylase chủng xạ khuẩn kiểm tra xác định Chủng xạ khuẩn RBXK3 thể tổng hợp enzyme tốt mơi trường Gause II có bổ sung 1% chất tinh bột, 0,5% NH4NO3 Thời gian thích hợp cho sinh tổng hợp enzyme kiểm tra điều kiện khảo sát tương ứng xác định thời gian tối thích 96 ni ủ điều kiện nhiệt độ 37C pH môi trường thích hợp 8,0 Khả hoạt động tốt xạ khuẩn RBXK môi trường pH 8,0 cho thấy tiềm cao việc ứng dụng tạo chế phẩm sinh học để xử lý chất thải tinh bột giặt tẩy chất bẩn có nguồn gốc từ tinh bột điều kiện kiềm hóa cách hiệu quả, đặc biệt hỗ trợ việc phát triển bền vững môi trường đời sống - Amylase ngoại bào chủng xạ khuẩn RBXK3 tinh thể trọng lượng phân tử khoảng 24kDa Các đặc điểm sinh hóa enzyme xác định với điều kiện hoạt động tốt 65°C pH 10,0 Sự diện ion kim loại Na+ với nồng độ thấp (~1mM) điều kiện phản ứng cho hoạt tính cao enzyme thể bền nhiệt cao với ~90% hoạt tính trì xử lý với nhiệt độ 85°C Các thông số động học amylase cho thấy khả xúc tác mạnh enzyme với Vmax = 1,38 x 109 U/mg Km = 6,05 mg/ml - Chế phẩm xạ khuẩn thô thử nghiệm xử lý với nước thải giàu tinh bột Kết cho thấy nước thải nghiệm thức xử lý với chế phẩm xạ khuẩn giảm số BOD5 (61,6-65,1%), COD (48,7-53,8%), hàm lượng tinh bột tương đối (31,1-38,4%) giá trị pH cân gần trung tính (6,0-6,9) thử nghiệm với chế phẩm xạ khuẩn tỷ lệ 0,5%, 1,0%, 2,0% Ngoài ra, kết khảo sát ảnh hưởng nước thải sau xử lý xạ khuẩn lên phát triển hạt đậu xanh khẳng định thêm tiềm ứng 45 dụng loại vi sinh vật Sự phát triển hạt đậu xanh thử nghiệm tưới nước thải có xử lý với chế phẩm xạ khuẩn tương tự với nghiệm thức đối chứng hạt đậu xanh tưới nước cất, có khác biệt đáng kể với nghiệm thức tưới nước thải không xử lý Như vậy, việc sử dụng xạ khuẩn hay yếu tố sinh học xử lý nước thải, giúp giảm thiểu việc sử dụng hóa chất xử lý mơi trường, góp phần tạo nên môi trường sống bền vững 4.2 Kiến nghị Căn vào kết đạt được, chúng tơi có kiến nghị sau: - Amylase sinh tổng hợp từ chủng xạ khuẩn RBXK3 thể hoạt tính xúc tác khả chịu nhiệt cao, cần có nghiên cứu sản xuất chế phẩm nhằm ứng dụng enzyme vào thực tiễn - Nghiên cứu thêm đặc tính enzyme hoạt tính sinh học khác chủng xạ khuẩn số 20 chủng xạ khuẩn phân lập TÀI LIỆU THAM KHẢO Rajagopalan G, K.C., Alpha amylase production from catabolic depressed Bacillus subtilis KCC103 utilizing sugarcane bagasse hydrolysate Bioresource Technology, 2008 99: p 3044-3050 Reddy NS, N.A., Sambasiva Rao KRS , An overview of the microbial amylase family African Journal of Biotechnology, 2003 2: p 645-648 Gupta R, G.P., Mohapatra H, Goswami VK, Chauhan B., Microbial amylases a biotechnological perspective Process Biochemistry, 2003 38: p 1599-1616 A Pandey, P.N., C R Soccol, V T Soccol, D Singh, and R.Mohan, , Advances in microbial amylases Biotechnology and Applied Biochemistry, 2000 31: p 135-152 Salma Mukhtar, A.Z., Dalaq Aiysha, Kauser Abdulla Malik and Samina Mehnaz, Actinomycetes: A Source of Industrially Important Enzymes Journal of Proteomics & Bioinformatics, 2017 10: p 316-319 Kira O, C.U., Arikan B, Effects of carbon sources and various chemicals on production of a novel amylase from a thermophilic Bacillus sp K-12 Enzyme 2004 29: p 99-103 Q D Nguyen, J.M.R.-S., M Claeyssens, I Stals, and Á Hoschke, Purification and characterisation of amylolytic enzymes from thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus strain ATCC 34626 Enzyme and Microbial Technology,, 2002 31: p 345-352 Pandey A, S.C., Mitchell D , New developments in solid state fermentation: Bioprocess and products Process Chemistry, 2000 35: p 1153-1169 46 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Van der Maarel J.M., V.d.V.B., Uitdehaag J.C., Leemhuis H., Dijkhuizen L., Properties and applications of starch converting enzymes of the alfa amylase family Journal of Bacteriology, 2002 94: p 137-155 Shafiei M., Z.A.A., Amoozegar M.A , Purification and characterization of an organic- solvent-tolerant halophilic a-amylase from the moderately halophilic Nesterenkonia sp strain F Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology, 2011 38: p 275-281 Ashwini Krishnan, S.S.K., Optimization of alpha amylase extracted from marine actinomycetes -Streptomyces gancidicus_ASD-KT852565 International Research Journal of Pharmacy, 2015 6: p 729-735 Abdullah R, S.N., Iqtedar M, Naz S, Iftikhar T., Optimization of cultural conditions for the production of alphaamylase by Aspergillus niger (BTM-26) in solid state fermentation Pakistan Journal of Botany, 2014 46.(1071-1078) Bull AT, S.J., Ward AC, Goodfellow M , Marine actinobacteria; perspectives, challenges, future directions Antonie Van Leeuwehoek, 2005 87: p 65-79 Sreejetha M, D., Veena S, Kokati Venkata BR , The bioactive potential of Streptomyces variabilis-DV-35 isolated from Thottada Marine sediments, Kannur, Kerala Asian Journal of Pharmaceutical and Clinical Research, 2016 9: p 67-71 Kamjam M, S.P., Deng Z, Hong K (2017) 8: 760, Deep Sea Actinomycetes and Their Secondary Metabolites Frontier in Microbiology, 2017 8: p 760 Sathya Rengasamy, U.t., Isolation, screening and determination of a-amylase activity from marine Streptomyces species International Journal of Pharmacy and Pharmaceutical Sciences, 2018 10: p 122-127 Padhmadas, R.R.a.R., Production, purification and characterization of - amylase using Streptomyces spp PDS1 and Rhodococcus spp Isolated from Western Ghats 2013 2: p 206-214 Tanupriya Ojha, K.D., Anjulata Vishwakarma, Production of amylase and lipase enzymes from actinomycetes World Journal of Pharmaceutical Sciences, 2016 4: p 353-356 Renu Singh, V.K., and Vishal Kapoor, Partial Purification and Characterization of a Heat Stable a-Amylase from a Thermophilic Actinobacteria, Streptomyces sp MSC702 Hindawi Publishing Corporation Enzyme Research, 2014 2014: p 1-8 Bernfeld, P., Amylase, α and β Methods in Enzymology, 1955 1: p 149-158 Joachim Wink, F.M., and Hamed Kazemi Shariat Panahi, Biology and Biotechnology of Actinobacteria-Chapter 11: Practical Aspects of Working with Actinobacteria Springer International Publishing AG, 2017: p 329-376 María Julia Amoroso, C.S.B., Sergio Antonio Cuozzo, ACTINOBACTERIAApplication in Bioremediation and Production of Industrial Enzymes CRC PressTaylor & Francis Group, LLC, US, 2013 Naif Abdullah Al-Dhabi, G.A.E., Abdul-Kareem Mohammed Ghilan, Mariadhas Valan Arasu, Veeramuthu Duraipandiyan, Karuppiah Ponmurugan, Isolation and purification of starch hydrolysing amylase from Streptomyces sp Al-Dhabi-46 obtained from the Jazan region of Saudi Arabia with industrial applications Journal of King Saud University – Science, 2020 32: p 1226-1232 Krishnasamy Nithya, C.M., Shine Kadaikunnan, Naiyf S Alharbi, Jamal M Khaled, Dharumadurai Dhanasekaran, Purification, characterization, and statistical optimization of a thermostable a-amylase from desert actinobacterium Streptomyces fragilis DA7-7 Bioech, 2017 7: p 350 47 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Édilla Ribeiro dos Santos, Z.N.S.T., Núria Mariana Campos, Diogo Angeli Jacinto de Souza, Aline Simões da Rocha Bispo and Rodrigo Pires Nascimento, Production of a-Amylase from Streptomyces sp SLBA-08 Strain Using AgroIndustrial By-Products Brazilian Archives Of Biology and Technology, 2012 55: p 793-800 Yasser R Abdel-Fattah, N.A.S., Nabil M El-Toukhy,Hamada El-Gendi, and Rania S Ahmed, Production, Purification, and characterization of Thermostable Amylase Produced by Bacillus licheniformis Isolate AI20 Hindawi Publishing Corporation -Journal of Chemistry, 2013 Volume 2013, Article ID 673173, 11 pages Dastager G Syed, D.A., Ashok Pandey, Production and partial purification of aamylase from a novel isolate Streptomyces gulbargensis Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology 2009 36: p 189–194 Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC147 “Chất lượng nước”, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6001-1 : 2008 (ISO 5815-1 : 2003), Chất lượng nước-Xác định nhu cầu oxy sinh hóa sau n ngày (BODn) – Phần 1: phương pháp pha loãng cấy có bổ sung allylthiourea Bộ Khoa học Cơng nghệ ban hành Ban kỹ thuật tiêu chuẩn TCVN/TC147 “Chất lượng nước”, Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6491: 1999 (ISO 6060: 1989), Chất lượng nước - Xác định nhu cầu oxy hóa học Bộ Khoa học Cơng nghệ ban hành Holmbom, L.V.a.B., Reliable spectrophotometric determination of starch concentration in papermaking process waters Nordic Pulp and Paper Research Journa, 2004 19: p 75-77 Chakraborty S, K.A., Kokare C, Mahadik K, Chopade B , Isolation and characterization of novel a-amylase from marine Streptomyces sp D1 Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2009 58: p 17-23 Chakraborty S, R.G., Khopade A, Mahadik K, Kokare C et al., Study on calcium ion independent a-amylase from halo-alkaliphilic marine Streptomyces strain A3 Indian Journal Biotechnology, 2012 11: p 427-437 T Krishnan , A.K.C., Purification and Characterization of -Amylase from Bacillus licheniformis CUMC305 Applied and Environmental Microbiology, 1983 46: p 430-437 Abdulaal, W.H., Purification and characterization of α-amylase from Trichoderma pseudokoningii BMC Biochemistry 2018 19(4): p B Sathy Priya, T.S.a.K.S., Ecosafe bioremediation of dairy industry effluent using Streptomyces indiaensis ACT and Streptomyces hygroscopicus ACT 14 and application for seed germination of Vigna radiata African Journal of Microbiology Research, 2014 8(23): p 2286-2289 Wael, N.H., Efficiency of some actinomycete isolates in biological treatment and removal of heavy metals from wastewater African Journal of Biotechnology, , 2012 11(5): p 1163-1168 More SV, J.S., Rao BS, Nair BU, Laxman RS., Chromium removal and reduction in COD of tannery effluents by actinomycetes Indian journal of environmental health, 2001 43: p 108-113 Amany G Madkour, M.M.H.a.M.A.D., Removal of ammonia and orthophosphate from domestic wastewater using marine actinomycetes Egyptian Journal of Aquatic Biology & Fisheries, 2019 23: p 455 – 465 48 PHỤ LỤC QUY TRÌNH CƠNG NGHỆ Qui trình sản xuất amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 Hình S1: Qui trình sản xuất amylase ngoại bào từ xạ khuẩn RBXK3 Thuyết minh quy trình: a Chủng RBXK3: khuẩn lạc chủng xạ khuẩn RBXK3 nuôi 10 ml môi trường Gause I lỏng (20,0 g tinh bột tan; 0,5 g MgSO4.7H2O; 3,0 g K2HPO4; 1,0 g KNO3; 0,5 g NaCl; 0,1 g FeSO4; nước cất 1000ml; pH 7,2-7,4) 37C, 150 rpm ngày thu giống tăng sinh Giống tăng sinh cấy vào 100 ml môi trường nuôi cấy với tỷ lệ giống 2% b Môi trường nuôi cấy: môi trường nuôi cấy với thành phần bao gồm tinh bột 10g, NH4NO3 5g, NaCl 5g, nước cất 1000ml, pH 8,0 c Nuôi ủ: lọ môi trường nuôi cấy ủ điều kiện 37°C, 150rpm, 96 d Ly tâm: dịch nuôi cấy ly tâm 6.000rpm nhiệt độ phòng để loại bỏ tế bào; dịch sau tủa (NH4)2SO4 ly tâm 13.000rpm nhiệt độ phòng để thu pellet 49 e Tủa (NH4)2SO4: dịch enzyme thô tủa cách phối trộn với muối (NH4)2SO4 với nồng độ cuối 70% f Hòa tan pellet: Pellet sau tủa hòa tan với dung dịch đệm chứa glycerol 10%; Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Mercapmetanol 2% g Thẩm tách: tình thẩm tách nhằm loại bỏ lượng muối thừa mẫu Dung dịch enzyme cho vào màng dialyse có kích thước 3000Da ngâm ngập 10X thể tích dung dịch đệm chứa glycerol 10%; Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Mercapmetanol 2% 4°C 16 giờ, khuấy đảo nhẹ h Tinh sắc ký trao đổi ion: dung dịch enzyme sau thẩm tách tinh sắc ký trao đổi ion (HiTrap Q HP × mL; GE Healthcare) với dung dịch cân Buffer A (Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%) dung dịch để rửa giải Buffer B (Tris-Cl 50 mM pH 7,0; Glycerol 10%; Mercapmetanol 2%; NaCl 1,0M) i Thu fraction: Các fraction thu sau q trình tinh kiểm tra hoạt tính sơ với 1% chất tinh bột thuốc thử lugol Các fraction có hoạt tính thu gom kiểm tra điện di SDS-PAGE j Concentrate: Các fraction concentrate Concentrator Amicon 3000Da, nồng độ protein xác định phương pháp Bradford với chuẩn Bovine Serum Albumin k Kiểm tra hoạt tính: Hoạt tính enzyme xác định phương pháp Bernfeld l Enzyme/enzyme thô: dung dịch enzyme bảo quản điều kiện -20°C 50 Kết định danh chủng xạ khuẩn -Chủng xạ khuẩn RBXK3 Trình tự 16SrRNA: GACCTGCGGCGTGCTTACCATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGC GAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGG GTCTAATACCGGATAACACTATCGCAGGCATCCTTGAGGGTTAAAAAGCTCCGGCGGTGAA GGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGACGACGGG TAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACGCTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGG GAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAG GGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACC TGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCACGCCCCGGCGGTAA Xây dựng phả hệ 51 -Chủng xạ khuẩn RBXK2 – (Mẫu CNXK84) Trình tự 16SrRNA: GACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCTCCTTCGGGAGGG GATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCC TGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACGACTGCGGAAGGCATCTTCCGCGGTGGAAAGCTCC GGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGC GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGA CTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACG CCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGT GACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCC Xây dựng phả hệ 52 -Chủng xạ khuẩn RBXK7 - (Mẫu CNXK31.2) Trình tự 16SrRNA: GAACCACTTCGGTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGC ACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGATCCTCGCAGGCATCTG CGAGGTTCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTAGTTGGTGAGG TAACGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGA CTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAA AGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGC AGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAG CCGCGGTAATGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGC CTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGC GGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGG AAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGC CAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGG TGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGC CGGTACAATGAGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCG GATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATT GCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTA ACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAG Xây dựng phả hệ 53 -Chủng xạ khuẩn RBXK16 - (Mẫu XK-T72) Trình tự 16SrRNA: GGTTCCCCAAGGGGAGGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGGGCCCGGCCCAATTGGGA CTGGGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATTTTGCCCAATGGGC GAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCT TTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTAC GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA AAGAGCTCGTAGGCGGCCTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGT CTGCATTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAG CGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCC GATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA GTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCG CAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCG AAGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACACCCAGAGATGGGTGCCCCCTTG TGGTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTA AGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGG GGACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTC ATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAAAGAGCTGC GATACCGCAAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGC AACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGA ATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCG AAGCCCGTGGCCCA Xây dựng phả hệ Streptomyces thermogriseus (NR 041434.1) Streptomyces thermovulgaris (NR 026528.1) Streptomyces thermodiastaticus (NR 036816.1) Streptomyces griseosporeus (NR 041140.1) Streptomyces bangladeshensis (NR 043164.1) XK-T72 Streptomyces fradiae (NR 112270.1) Streptomyces thermolilacinus (NR 125444.1) 54 -Chủng xạ khuẩn VTXK10- (Mẫu XK3) Trình tự 16SrRNA: GCGACGACGGGTACCGGCCTGATAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGC CCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATG CAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCGCCAGGGAC GAAGCGCAAGTGACGGTACCTGGATAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCC GCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAG GCGGTTTGTCGCGTCGGCCGTGAAATCTCCACGCTTAACGTGGAGCGTGCGGTCGATA CGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCG CAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTG AGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAA ACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTA AGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGG CCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTG GGCTTGACATGCGCCAGACATCCCCAGAGATGGGGCTTCCCTTGTGGTTGGTGTACAG GTGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGC GCAACCCTTATCCTACGTTGCCAGCGCGTCATGGCGGGGACTCGTGGGAGACTGCCGG GGTCAACTCGGAGAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCTAAGTCCGTNTCCG GAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGCCGTGAAATCTCCA CGCTTAACGTGAGCGTGCGGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGG AATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGGCGAGG CGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGAT TAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGCGACATTCCA CGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAG GCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAA TTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGCGCCAGACATCCCCAGAGA TGGGGCTTCCCTTGTGGTTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGT GAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTACGTTGCCAGCGCGT CATGGCGGGGACTCGTGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAAGGTGGGGATGA CGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGTTTCACACATGCTACAATGGCTGGTACA GAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCAGTTCGGTTC GCAGTCTGCAACTCGAGTGCGTGTAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCCAC GCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTC Xây dựng phả hệ Amycolatopsis tolypomycina (NR 114882.1) Amycolatopsis albidoflavus (NR 112695.1) XK3 Amycolatopsis orientalis (NR 042104.1) Amycolatopsis coloradensis (NR 042038.1) Amycolatopsis minnesotensis (NR 043528.1) Amycolatopsis saalfeldensis (NR 043964.1) 55 -Chủng xạ khuẩn VTXK11- (Mẫu XK3) Trình tự 16SrRNA: GTGCACCTACGAGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGATAGGGTGACCGGCCACACTGGG ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGG GCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCT CTTTCGCCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGGATAAGAAGCACCGGCTAACTA CGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGT AAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGCCGTGAAATCTCCACGCTTAACGTGGAG CGTGCGGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTA GCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGC CGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGT AGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTTGTCCGTGCC GTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAA GGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGC GAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGCGCCAGACATCCCCAGAGATGGGGCTTCCCTT GTGGTTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTT AAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTACGTGGCCAGCGCGTCATGGCGGGGACT CGTGGGAGACTGCCGGGGTCACTCGGAGAAAGGTGGGGATGACGTCAAGTCATCATG AGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGGCCG TGAAATCTCCACGCTTAACGTGGAGCGTGCGGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGC AGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACC GGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGA GCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCTGTAAACGTTGGGCGCTAGGTGTGG GCGACATTCCACGTTGTCCGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGT ACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGC ATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGCTTGACATGCGCCAGAC ATCCCCAGAGATGGGGCTTCCCTTGTGGTTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCA GCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATCCTACGTT GCCAGCGCGTCATGGCGGGGACTCGTGGGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGG TGGGGATGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGTTTCACACATGCTACAATG GCTGGTACAGAGGGCTGCGATACCGCGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCCGGTCTCA GTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGA TCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATG AAAGTCGGTAACACCCGAAGCCCATGTCCA Xây dựng phả hệ Amycolatopsis orientalis (NR 042104.1) 100 Amycolatopsis mediterranei (NR 115160.1) Amycolatopsis echigonensis (NR 041404.1) 93 98 XK4 Pseudonocardia thailandensis (NR 157703.1) 99 Nocardia inohanensis (NR 117327.1) Nocardia veterana (NR 114572.1) 100 Gordonia neofelifaecis (NR 116859.1) 56 PHẦN III PHỤ LỤC ĐÍNH KÈM (tất văn có sẵn, chủ nhiệm cần photo đính kèm sau nội dung trên, sử dụng lý hợp đồng với phịng kế toán Khi lý, báo cáo in thành 03 cuốn, đó, 01 đóng bìa mạ vàng, 02 đóng bìa cứng thường) Hợp đồng thực đề tài nghiên cứu khoa học Thuyết minh đề tài phê duyệt Quyết định nghiệm thu Hồ sơ nghiệm thu (biên họp, phiếu đánh giá, bảng tổng hợp điểm, giải trình, phiếu phản biện) Sản phẩm nghiên cứu (bài báo, vẽ, mơ hình .) 57 ... tài Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sản sinh enzyme amylase ngoại bào phân tích đặc tính sinh học hệ enyme amylase từ chủng xạ khuẩn phân lập b Nội dung đề tài - Phân lập chủng xạ khuẩn. .. chủng xạ khuẩn chọn xây dựng quy trình sinh tổng hợp amylase xạ khuẩn - Tinh amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn với độ tinh ~95% - Phân tích đặc tính sinh học hệ enzyme amylase chủng xạ khuẩn. .. khuẩn từ nhiều nguồn khác tuyển chọn chủng xạ khuẩn có hệ enzyme amylase ngoại bào - Khảo sát điều kiện thích hợp sinh tổng hợp amylase ngoại bào từ chủng xạ khuẩn chọn - Phân tích đặc tính sinh