BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI - ĐÀM QUANG HIẾU SÀNG LỌC VÀ PHÂN TÍCH ĐẶC TÍNH CỦA ENZYME THỦY PHÂN CELLULOSE BỀN NHIỆT VÀ HOẠT ĐỘNG TRÊN MÔI TRƢỜNG AXIT TỪ NẤM MỐC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KỸ THUẬT CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Tô Kim Anh Hà Nội - Năm 2015 MỤC LỤC MỤC LỤC i LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii DANH MỤC BẢNG iv DANH MỤC HÌNH v MỞ ĐẦU CHƢƠNG I: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cấu trúc cellulose .2 1.2 Cellulase hoạt động thủy phân cellulose .4 1.2.1 Vi sinh vật phân hủy cellulose 1.2.2 Phân loại cellulase 1.2.3 Các yếu tố điều hòa hoạt động cellulase 1.2.4 Cellulosome 1.3 Một số ứng dụng cellulase 11 1.3.1 Trong thức ăn chăn nuôi 11 1.3.2 Trong công nghiệp giấy 12 1.3.3 Trong công nghiệp thực phẩm 12 1.3.4 Trong kỹ thuật di truyền 13 1.3.5 Trong công nghiệp dệt 13 1.3.6 Trong xử lý môi trường 13 1.4 Tình hình nghiên cứu cellulase bền nhiệt, hoạt động pH thấp nƣớc giới 14 1.4.1 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 16 CHƢƠNG II: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18 2.1 Vật liệu 18 2.1.1 Nguồn mẫu phân lập .18 i 2.1.2 Hoá chất thiết bị 18 2.1.3 Máy móc thiết bị 20 2.1.4 Môi trường phân lập, nuôi cấy chiết enzyme 21 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 22 2.2.1 Phân lập mẫu môi trường Czapek pH 2.0 giấy lọc 22 2.2.2 Nuôi cấy chiết enzyme 22 2.2.3 Xác định hoạt tính enzyme cellulase .23 2.2.3.1 Phương pháp đục lỗ thạch .23 2.2.3.2 Xác định hoạt tính enzyme DNS pH khác 23 2.2.4 Xác định khả bền nhiệt enzyme chất CMC 26 2.2.5 Xác định hàm lượng protein (Lowry) 26 2.2.6 Điện di protein SDS-PAGE 27 2.2.7 Điện di Zymogram 28 2.2.8 Tách chiết DNA tổng số 29 2.2.9 PCR fingerprinting 29 2.2.10 Định tên chủng nấm mốc dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA 30 2.2.11 Tách chiết tinh chế enzyme cellulase 31 2.2.12 Xác định ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt động enzyme 32 2.2.13 Xác định ảnh hưởng pH đến hoạt động enzyme 33 CHƢƠNG III KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Phân lập chủng nấm mốc sinh enzyme thủy phân cellulose 34 3.2 Phân nhóm kỹ thuật PCR finger-printing .37 3.3 Định tên chủng nấm mốc dựa vào phƣơng pháp đọc trình tự rDNA 38 3.4 Xác định hàm lƣợng protein, đƣờng kính vòng thủy phân, hoạt tính cellulase, hoạt tính CMCase chủng định tên .41 3.4.1 Hàm lượng protein 41 3.4.2 Hoạt tính cellulase chủng nấm mốc pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 42 3.4.3 Hoạt tính CMCase chủng nấm mốc 43 3.5 Khả bền nhiệt enzyme từ chủng phân lập 43 ii 3.6 Tinh chế enzyme cellulase 47 3.6.1 Chọn chủng tinh chế .47 3.6.2 Nuôi chiết cô đặc enzyme 48 3.6.3 Kết tủa enzyme muối ammonium sulfate 49 3.6.4 Sắc ký trao đổi ion cột DEAE Sepharose FF, thể tích cột ml 51 3.6.5 Sắc ký tương tác kỵ nước cột Butyl Sepharose High Performance .54 3.7 Xác định nhiệt độ tối ƣu độ bền nhiệt enzyme tinh đƣợc 58 3.8 Xác định pH tối ƣu độ bền pH enzyme tinh đƣợc 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 KẾT LUẬN 63 KIẾN NGHỊ 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Tài liệu tiếng Việt 64 Tài liệu tiếng Anh 64 PHỤ LỤC 69 I Trình tự vùng ITS, mã trình tự so sánh độ tƣơng đồng 18 chủng nấm mốc đọc trình tự 69 II Tổng hợp kết sàng lọc 78 III Kết phần tinh chế 82 iii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài: “Sàng lọc phân tích đặc tính enzyme thủy phân cellulose bền nhiệt hoạt động môi trường axit từ nấm mốc” PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS TS Tô Kim Anh hướng dẫn thực số kết cộng tác với học viên khác, chép tác giả hay tổ chức nước Tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm nội dung trình bày luận văn Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên Đàm Quang Hiếu i LỜI CẢM ƠN Tôi xin trân trọng cảm ơn PGS.TS Vũ Nguyên Thành PGS.TS Tô Kim Anh dành thời gian công sức tận tình hướng dẫn định hướng cho suốt trình nghiên cứu giúp hoàn thành luận văn Tôi xin trân trọng cảm ơn anh, chị bạn Trung tâm Vi sinh vật Công nghiệp, Viện Công nghiệp Thực phẩm tạo điều kiện, giúp đỡ bảo suốt thời gian làm thí nghiệm Trung tâm Tôi xin trân trọng cảm ơn thầy, cô Viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm - Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội dạy bảo tôi, cho kiến thức kinh nghiệm bổ ích suốt trình học tập Cuối cùng, xin dành lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, người thân bạn bè bên tôi, cho nguồn động lực, chia sẻ giúp hoàn thành tốt trình học tập nghiên cứu Hà Nội, ngày 30 tháng năm 2015 Học viên Đàm Quang Hiếu ii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT TRONG LUẬN VĂN APS Ammonium persulfate BSA brovine serum albumin CBD Cellulose binding domain CBM Cellulose binding module CMC Carboxylmethyl cellulose DNA Deoxyribonucleic acid DNS 3,5 Dinitrosalicylic acid DP degree of polymerization dNTPs Deoxyribonucleotide triphosphates EDTA ethylene diamine tetra acetic acid FPU Fiter paper unit GH Glycoside hydrolase ITS Internal transcribed spacer IU International unit kDa KiloDalton MDa MegaDalton OD opical desity PCR polymerase chain reaction PDA potato dextrose agar rDNA ribosomal deoxyribonucleic acid SDS-PAGE sodium dodecyl sulphate - Polyacrylamide gel electrophorosis iii DANH MỤC BẢNG STT Bảng Trang Bảng 1.2.3 Một số chất điều hòa hoạt động cellulase Bảng 2.1.1 Tổng hợp danh sách chủng nấm mốc chịu nhiệt pH phân lập 78 Bảng 2.3.1 Bảng tổng hợp đường kính vòng thủy phân hoạt tính enzyme pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 58 chủng nấm mốc phân lập 80 Bảng 3.1 Danh sách chủng nấm mốc chịu nhiệt pH phân lập 34 Bảng 3.1.1 Hoạt tính CMCase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu 50 % (NH4)2SO4 82 Bảng 3.2.1 Hoạt tính CMCase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu kết tủa 60 % (NH4)2SO4 84 Bảng 3.3 Kết định tên loài 20 chủng đại diện dựa vào phương pháp đọc trình tự rDNA 38 Bảng 3.3.1 Hoạt tính CMCase phân đoạn sau chạy qua cột Sepharose High Performance (HIC) 86 Bảng 3.4.3 Bảng tổng hợp đường kính vòng thủy phân hoạt tính enzyme pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 chủng phân lập 45 10 Bảng 3.6.1 Hoạt tính enzyme trước sau cô đặc 49 11 Bảng 3.6.3.1 Khối lượng (NH4)2SO4 cần bổ sung phân đoạn 49 12 Bảng 3.6.3.2 Hoạt tính CMCase phân đoạn tủa muối (NH4)2SO4 50 13 Bảng 3.6.5.1 Hoạt tính riêng enzyme trước sau tinh chế 58 iv DANH MỤC HÌNH STT Hình Trang Hình 1.1 Cấu trúc cellulose Hình 1.2 Hoạt động xúc tác cellulase chất cellulose Hình 2.2.1 Đường kính vòng thủy phân 58 chủng nấm mốc phân lập 80 Hình 2.2.3.2 Đường chuẩn glucose pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 24 Hình 3.1 Hình ảnh khuẩn lạc, hình thái tế bào số chủng nấm mốc phân lập 36 Hình 3.2 Phổ finger-printing 20 chủng nấm mốc chọn 37 Hình 3.3 Cây phả hệ xây dựng dựa trình tự ITS chủng LPH 134, LPH 137, LPH 172, LPH 182 loài liên quan 40 Hình 3.4.1 Hàm lượng protein số chủng nấm mốc phân lập 41 Hình 3.4.2 Hoạt tính cellulase pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 số chủng nấm mốc phân lập 42 10 Hình 3.4.3 Hoạt tính CMCase pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 chủng phân lập 44 11 Hình 3.5 Khả bền nhiệt enzyme từ chủng phân lập 47 12 Hình 3.6.1 Hình ảnh khuẩn lạc tế bào chủng FCH 9.3 48 13 Hình 3.6.3 Hình ảnh điện di SDS-PAGE phân đoạn tủa muối (NH4)2SO4 50 14 Hình 3.6.4.1 Sắc ký đồ ảnh điện di SDS-PAGE mẫu tủa 50 % (NH4)2SO4 sau chạy qua cột DEAE Sepharose FF 52 15 Hình 3.6.4.2 Sắc ký đồ ảnh điện di SDS-PAGE mẫu tủa 60 % (NH4)2SO4 sau chạy qua cột DEAE Sepharose FF 53 16 Hình 3.6.5.1 Sắc ký đồ ảnh điện di SDS-PAGE đỉnh peak sau chạy qua cột HIC 55 v STT Hình Trang 17 Hình 3.6.5.2 Ảnh điện di SDS-PAGE faction E104÷E124 sau chạy HIC 56 18 Hình 3.6.5.3 Ảnh điện di SDS-PAGE Zymogram bước trình tinh chế 57 19 Hình 3.7.1 Nhiệt độ tối ưu phản ứng enzyme-cơ chất pH5.0 59 20 Hình 3.7.2 Độ bền nhiệt enzyme pH 5.0 60 21 Hình 3.7.3 Thời gian bán hủy enzyme 70 °C, pH 5.0 60 22 Hình 3.8.1 Ảnh hưởng pH lên phản ứng enzyme chất 50 °C 61 23 Hình 3.8.2 Khảo sát độ bền pH enzyme tinh chế 50 °C 62 vi Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội 17 Viện CN Sinh học CN Thực phẩm LPH 180 1st_BASE_1860042_143_ITS4 GATCATTAAAATATCTGCTGGCTAGCAGAACCCCTAGATTATATGTTTTTTGGTTG GACCAAAAAAGCACGATGGCTAGGTAGTTCGTAATTTAATGAAAATTACAAAGAGG CTGTATTTTAGACAATCGGTATAATAATTAAATTTAACCGAGCTTGTCCATCACCA CATAAAATAAATTTTATGTGTGGGTTGGTTATGATACTGAAGCAAGCGTACTCTAT AGAAGATCCATAGAGTGCAAGCTGCGTTCAAAGACTCGATGATTCACGAATATGCA ATTCACACTAGTTATCGCACTTTGCTACGTTCTTCATCGATGCGAGAACCAAGAGA TCCATTGTTAAAAGTTGTTATTATATTATACTTTCAATTCTGAATTCATGGTATAT GGTAAAGGGTACCAGGCACCTTCCTTCCCAAAGGAAGAAAGGTAATCCTGATTGGC ATCGATCAAACCCCAGAACAGGCCTACCCATTATAGCCTATATGTCCTGAGTCTCT CCCGAAGGTCAGTTACGACCTTCATCGCCAGAGGTTCACAGTATAGAAGCAAACAA TACTGAGAAGTAAATCCCAGTAAAGTGCCAATACATTAGTTAATGATCCTTCCGCA GGTTCACCTACGGAAACCTTGTTAC Rhizopus azygosporus Sequence ID: gb|DQ119008.1| Identities 630/630(100%) Rhizopus microsporus Sequence ID: gb|KC206548.1| Identities 18 641/641 (100%) LPH 182 ITS5 15B4RAA003_G7 AGTTGTAAGACTCCTAAACTACTATGGACCTTACCTAACTATTGCTTCGGCGGGCG ACGCCAGGGCCCCTACGGGCCTACCAGCGTGCCCCCCGGCCCCCCTCGCAGGGGCG CTCGTCGAAGGCTCCAAACCATTCTTATATATATAAGGCCTCTCTAAGTCTTTTGT ACTGAATAAGTTAAAACTTTCAATAACGGATCTCTTGGTTCTAGTATCGATAAAGA ACATAGCAAAATACGATAAATAATGTGAATTGTAGAATTCTATAAATCATCGAATC TTTGAATATACATTGCGCTCGCTAGCATTCCAGCGGGTATACCTATCCGAACGTCA TTTCGACCATCAAGCCCTAGGCTTATATTGGGGATCTACGGCTATTCATAGGCCTC GAAAACTAGTAGCGGTGCCTACTATCACCCTGAGCGTAGTAGCAACCACCTCGCTC Đàm Quang Hiếu 77 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm AGGGCGTGCTCCAGGTCCCGGCCATTAAATGGAAAGCAACCCCCTAAAGGTTGACC TCGGATTAGGTAAAAGGACCCACTGAACTTAAGCATATC Thielavia terrestris Sequence ID: gb|CP003011.1| Identities 468/543 (86%) II Tổng hợp kết sàng lọc Bảng 2.1.1 Tổng hợp danh sách chủng nấm mốc chịu nhiệt pH phân lập Địa điểm Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Bắc Giang Phú Xuyên Phú Xuyên Phú Xuyên Lạng Sơn Lạng Sơn Lạng Sơn Phú Xuyên Phú Xuyên Ba Vì Ba Vì Ba Vì Đặc điểm mẫu Phân ủ (ẩm) Phân ủ (nhiều rác) Mùn cưa(đen ẩm) Mùn cưa (đen ẩm, trống mộc nhĩ) Bông (ẩm, trồng nấm sò) Rơm mục(giữa đống, ẩm) Mùn cưa (màu nâu, ẩm) Phân gà ủ (ẩm, lẫn trấu, đống) Thân vải mục Thân mít mục Gỗ mục Trấu ủ (ẩm) Trấu ủ (ẩm) Gỗ mục (ẩm, màu nâu) Gỗ mục (ẩm, màu đen) Gỗ mục (ẩm) 17 Ba Vì Gỗ mục (ẩm, nâu) 18 19 20 21 22 Ba Vì Tuyên Quang Tuyên Quang Thái Nguyên Bắc Giang Gỗ mục (vàng, ẩm) Gỗ mục (nâu xám) Mùn cưa (hơi ẩm) Đất quanh gốc dừa Gỗ mục (đen, ẩm) 23 Bắc Giang Gỗ mục (đen, ẩm) 24 Bắc Giang Nấm mục (đen, ẩm) 25 26 27 28 Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Đất quanh gốc tre (ẩm) Mùn mỏ (mục, ẩm, xám) Mùn cám trấu (mục, ẩm, đen) Mùn cơm nguội(mục, xám) STT 10 11 12 13 14 15 16 Đàm Quang Hiếu 78 Kí hiệu chủng LPH 150 LPH 151 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 152, LPH 153 Không có khuẩn lạc LPH 154,LPH 156 Không có khuẩn lạc LPH 134, LPH 159 LPH 136, LPH 157 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 128 Không có khuẩn lạc LPH 129, LPH 130 LPH 135, LPH 155 LPH 131, LPH 132, LPH 133, LPH 158 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 160, LPH 161, LPH 163 LPH 137, LPH 138, LPH 139, LPH 162 Không có khuẩn lạc LPH 164 LPH 141, LPH 165 Không có khuẩn lạc Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Địa điểm Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Bắc Ninh Tuyên Quang Đặc điểm mẫu Mùn gốc phong lan (ẩm, đen) Mùn gốc xoan (mục, ẩm) Rễ xoan (mục, ẩm) Gốc phong lan (mục, đen) Giá thể trồng nấm sò (ẩm, vàng) Gỗ mục (đen, ẩm) 35 Bắc Giang Gỗ đào mục (đen, ẩm) 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 Bắc Giang TP Bắc Giang Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Phú Thọ Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Nghệ An Lạng Sơn Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Thái Nguyên Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Rễ tre (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, vàng nhẹ) Gỗ mục (mục, đen) Gỗ mục (mục, đen, ẩm) Gỗ mục (mục, đen, ẩm) Gốc dứa mục (đen, ẩm) Lá mục (đen, ẩm) Rơm mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (đen, ẩm) Gỗ mục (nâu đen, ẩm) Gỗ mục (ẩm, nâu, vàng) Gỗ mục (khô, trắng) Gỗ mục (ẩm, nâu đen) Gỗ mục (hơi ẩm, xốp đen) 55 Hưng Yên Gỗ cứng (hơi ẩm, đen) 56 Hưng Yên Rơm mục (xám nâu, ẩm) 57 Hưng Yên Gỗ mục (đen ẩm) 58 59 60 61 Hưng Yên Hưng Yên Hưng Yên Hưng Yên Gỗ mục (xốp, nâu đen ẩm) Thân dừa (ẩm mục nâu) Trấu mục (ẩm, đen mốc) Gỗ mục (trắng ẩm, xốp) 62 Hưng Yên Gỗ mục (ẩm, đen) STT 29 30 31 32 33 34 Đàm Quang Hiếu 79 Kí hiệu chủng LPH 142 Không có khuẩn lạc LPH 140 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 166, LHP 167, LHP 174 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 168 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 169 LPH 170 LPH 171 LPH 143, LPH 182 LPH 172 Không có khuẩn lạc LPH 144, LPH 173 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 145 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 176, LPH 177, LPH 178, LPH 179 LPH 146, LPH 147 LPH 175, LPH 183, LPH 184, LPH 185 Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc Không có khuẩn lạc LPH 148, LPH 149, LPH 180, LPH 181 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm Đường kính vòng thủy phân 58 chủng nấm mốc phân lập Hình 2.2.1 Đường kính vòng thủy phân 58 chủng nấm mốc vị trí giếng tương ứng với chủng từ LPH 128÷LPH 185, (-) đối chứng âm: nước cất, (+) đối chứng dương: Cellulase Novozyme Bảng 2.3.1 Bảng tổng hợp đường kính vòng thủy phân hoạt tính enzyme pH 3.0, pH 5.0 pH 7.0 58 chủng nấm mốc phân lập pH 3.0 STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 LPH 128 LPH 129 LPH 130 LPH 131 LPH 132 LPH 133 LPH 134 LPH 135 LPH 136 LPH 137 LPH 138 LPH 139 LPH 140 LPH 141 LPH 142 LPH 143 Đàm Quang Hiếu pH 5.0 pH 7.0 Rate, % ĐK vòng CMCase CMCase CMCase thủy pH3.0/pH5.0 pH7.0/pH5.0 (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml) phân(cm) 1.33 0.25 1.52 0.04 0.10 1.97 0.52 2.51 0.11 0.39 1.87 1.98 0.99 1.77 0.20 1.68 2.25 0.77 0.54 0.04 0.02 0.74 0.62 2.63 0.01 0.55 0.89 0.72 0.46 1.73 0.58 0.81 3.0 2.2 2.9 1.6 1.9 3.1 2.2 3.3 1.4 2.7 3.1 3.1 3.0 3.0 2.7 3.0 80 0.30 0.10 0.05 0.02 0.02 0.09 0.07 0.24 0.02 0.22 0.05 0.05 0.04 0.06 0.06 0.06 59.19 32.27 281.68 88.83 576.95 264.53 84.02 95.36 859.36 70.18 209.34 275.03 217.55 102.45 34.15 206.87 13.16 13.00 9.36 38.48 138.22 11.74 11.54 8.98 139.14 39.07 5.99 6.86 8.50 3.65 10.39 6.99 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm pH 3.0 STT Mẫu 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 LPH 144 LPH 145 LPH 146 LPH 147 LPH 148 LPH 149 LPH 150 LPH 151 LPH 152 LPH 153 LPH 154 LPH 155 LPH 156 LPH 157 LPH 158 LPH 159 LPH 160 LPH 161 LPH 162 LPH 163 LPH 164 LPH 165 LPH 166 LPH 167 LPH 168 LPH 169 LPH 170 LPH 171 LPH 172 LPH 173 LPH 174 LPH 175 LPH 176 LPH 177 LPH 178 Đàm Quang Hiếu pH 5.0 pH 7.0 Rate, % ĐK vòng CMCase CMCase CMCase thủy pH3.0/pH5.0 pH7.0/pH5.0 (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml) phân(cm) 2.10 0.03 0.03 0.15 1.08 0.02 0.02 0.04 0.01 0.03 1.51 2.27 0.29 0.03 1.24 0.14 2.51 1.89 2.28 2.13 0.12 2.44 0.21 2.06 2.51 2.59 1.77 0.06 0.13 1.88 2.17 1.88 0.13 2.23 0.16 0.88 0.03 0.03 0.44 0.91 0.02 0.02 0.02 0.02 0.03 1.77 2.41 0.17 0.02 0.38 0.11 2.52 0.75 0.93 0.79 0.05 0.88 0.13 2.32 0.81 0.91 1.03 0.07 0.16 1.15 1.12 0.90 0.07 0.67 0.16 3.0 1.2 1.9 2.6 2.9 1.5 1.9 1.4 1.3 1.5 2.8 3.0 3.2 2.0 2.9 2.3 2.9 2.8 2.9 2.9 1.1 3.0 2.0 3.3 2.9 2.7 2.9 2.0 2.5 2.9 3.0 2.8 2.5 3.1 2.0 81 0.06 0.01 0.03 0.06 0.05 0.02 0.01 0.02 0.02 0.01 0.21 0.35 0.10 0.02 0.05 0.05 0.31 0.15 0.05 0.07 0.10 0.07 0.07 0.19 0.14 0.07 0.13 0.03 0.09 0.11 0.10 0.08 0.04 0.07 0.03 240.26 96.64 112.70 33.63 118.87 0.00 92.00 196.98 42.32 72.81 85.39 94.39 165.78 116.96 324.18 127.88 99.59 252.17 245.32 269.27 256.95 275.24 166.25 88.83 307.94 285.13 171.20 95.18 82.17 164.04 194.43 209.32 196.20 332.89 97.05 6.72 38.69 91.77 14.40 4.97 114.21 33.69 125.68 94.33 31.52 12.04 14.69 54.80 105.84 13.62 51.12 12.50 19.60 5.72 9.01 219.05 7.99 53.68 8.29 17.23 7.31 12.58 48.80 55.56 9.54 8.55 9.21 66.34 10.14 21.24 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm pH 3.0 STT Mẫu 52 53 54 55 56 57 58 LPH 179 LPH 180 LPH 181 LPH 182 LPH 183 LPH 184 LPH 185 pH 5.0 pH 7.0 Rate, % ĐK vòng CMCase CMCase CMCase thủy pH3.0/pH5.0 pH7.0/pH5.0 (IU/ml) (IU/ml) (IU/ml) phân(cm) 1.68 0.17 0.46 0.21 0.19 0.06 0.00 1.14 0.15 0.98 0.17 0.30 0.03 0.03 2.9 2.5 2.9 2.6 0.0 1.4 1.5 0.06 0.18 0.06 0.06 0.02 0.03 0.02 147.65 117.90 46.89 118.50 64.52 170.59 5.36 5.16 124.18 6.48 37.30 6.54 102.18 70.03 III Kết phần tinh chế Bảng 3.1.1 Hoạt tính CMCase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu 50 % (NH4)2SO4 STT Mẫu 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 Before Inject Inject (I) Wash (W) E1 E2 E3 E4 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 Đàm Quang Hiếu Thể tích (ml) 67 69.5 72 74.5 77 79.5 82 84.5 87 89.5 92 94.5 97 99.5 102 104.5 107 109.5 112 114.5 Điểm (ml) CMCase (IU/ml) Σ CMCase (IU) 68.25 70.75 73.25 75.75 78.25 80.75 83.25 85.75 88.25 90.75 93.25 95.75 98.25 100.75 103.25 105.75 108.25 110.75 113.25 115.75 22.869 14.062 0.166 0.026 0.022 0.022 0.035 0.073 0.119 0.17 0.675 2.678 2.726 1.035 0.792 0.438 0.186 0.173 0.181 0.168 0.148 0.131 0.131 640.34 562.49 3.31 0.06 0.05 0.05 0.09 0.18 0.3 0.42 1.69 6.7 6.81 2.59 1.98 1.09 0.46 0.43 0.45 0.42 0.37 0.33 0.33 82 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Thể tích (ml) Điểm (ml) CMCase (IU/ml) Σ CMCase (IU) 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 57 57 58 59 60 61 62 63 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E48 E49 E50 E51 E52 E48 E49 E50 117 119.5 122 124.5 127 129.5 132 134.5 137 139.5 142 144.5 147 149.5 152 154.5 157 159.5 162 164.5 167 169.5 172 174.5 177 179.5 182 184.5 187 189.5 192 194.5 197 199.5 202 204.5 207 209.5 212 214.5 118.25 120.75 123.25 125.75 128.25 130.75 133.25 135.75 138.25 140.75 143.25 145.75 148.25 150.75 153.25 155.75 158.25 160.75 163.25 165.75 168.25 170.75 173.25 175.75 178.25 180.75 183.25 185.75 188.25 190.75 193.25 195.75 198.25 200.75 203.25 205.75 208.25 210.75 213.25 215.75 0.104 0.076 0.056 0.048 0.038 0.036 0.029 0.027 0.023 0.034 0.029 0.043 0.029 0.041 0.024 0.026 0.025 0.029 0.028 0.023 0.027 0.023 0.027 0.026 0.028 0.026 0.03 0.025 0.031 0.026 0.029 0.024 0.024 0.027 0.025 0.032 0.026 0.028 0.027 0.036 0.26 0.19 0.14 0.12 0.1 0.09 0.07 0.07 0.06 0.08 0.07 0.11 0.07 0.1 0.06 0.06 0.06 0.07 0.07 0.06 0.07 0.06 0.07 0.06 0.07 0.07 0.07 0.06 0.08 0.06 0.07 0.06 0.06 0.07 0.06 0.08 0.07 0.07 0.07 0.09 Đàm Quang Hiếu 83 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Thể tích (ml) Điểm (ml) CMCase (IU/ml) Σ CMCase (IU) 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 E51 E52 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 E70 217 219.5 222 224.5 227 229.5 232 197 199.5 202 204.5 207 209.5 212 214.5 217 219.5 222 224.5 227 229.5 232 234.5 237 239.5 218.25 220.75 223.25 225.75 228.25 230.75 233.25 198.25 200.75 203.25 205.75 208.25 210.75 213.25 215.75 218.25 220.75 223.25 225.75 228.25 230.75 233.25 235.75 238.25 240.75 0.03 0.031 0.027 0.035 0.025 0.03 0.028 0.058 0.061 0.059 0.066 0.060 0.063 0.061 0.071 0.064 0.066 0.061 0.070 0.059 0.065 0.062 0.059 0.072 0.063 0.07 0.08 0.07 0.09 0.06 0.08 0.07 0.15 0.15 0.15 0.17 0.15 0.16 0.15 0.18 0.16 0.16 0.15 0.18 0.15 0.16 0.16 0.15 0.18 0.16 Bảng 3.2.1 Hoạt tính CMCase mẫu thu từ cột DEAE Sepharose FF mẫu kết tủa 60 % (NH4)2SO4 CMCase (IU/ml) Σ CMCase, (IU) Before Inject 37.047 1481.87 Inject (I) Wash (W) E1 E2 E3 E4 19.079 1.706 0.439 0.786 1.188 2.525 1068.43 34.13 2.20 1.96 2.97 6.31 STT Mẫu Đàm Quang Hiếu Thể tích 82.2 86.7 89.2 91.7 Điểm 84.45 87.95 90.45 92.95 84 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Thể tích Điểm CMCase (IU/ml) Σ CMCase, (IU) 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 E5 E6 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 94.2 96.7 99.2 101.7 104.2 106.7 109.2 111.7 114.2 116.7 119.2 121.7 124.2 126.7 129.2 131.7 134.2 136.7 139.2 141.7 144.2 146.7 149.2 151.7 154.2 156.7 159.2 161.7 164.2 166.7 169.2 171.7 174.2 176.7 179.2 181.7 184.2 186.7 95.45 97.95 100.45 102.95 105.45 107.95 110.45 112.95 115.45 117.95 120.45 122.95 125.45 127.95 130.45 132.95 135.45 137.95 140.45 142.95 145.45 147.95 150.45 152.95 155.45 157.95 160.45 162.95 165.45 167.95 170.45 172.95 175.45 177.95 180.45 182.95 185.45 187.95 6.906 8.010 5.426 3.305 1.846 1.576 1.355 1.230 0.917 0.861 0.605 0.504 0.463 0.305 0.281 0.273 0.251 0.209 0.180 0.149 0.132 0.116 0.106 0.104 0.086 0.082 0.080 0.080 0.064 0.069 0.065 0.067 0.064 0.062 0.073 0.060 0.060 0.061 17.26 20.03 13.56 8.26 4.62 3.94 3.39 3.07 2.29 2.15 1.51 1.26 1.16 0.76 0.70 0.68 0.63 0.52 0.45 0.37 0.33 0.29 0.27 0.26 0.21 0.21 0.20 0.20 0.16 0.17 0.16 0.17 0.16 0.16 0.18 0.15 0.15 0.15 Đàm Quang Hiếu 85 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT Mẫu Thể tích Điểm CMCase (IU/ml) Σ CMCase, (IU) 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 57 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 E43 E44 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 189.2 191.7 194.2 196.7 199.2 201.7 204.2 206.7 209.2 211.7 214.2 216.7 219.2 221.7 224.2 226.7 229.2 231.7 234.2 236.7 239.2 241.7 244.2 190.45 192.95 195.45 197.95 200.45 202.95 205.45 207.95 210.45 212.95 215.45 217.95 220.45 222.95 225.45 227.95 230.45 232.95 235.45 237.95 240.45 242.95 245.45 0.058 0.058 0.059 0.064 0.060 0.067 0.059 0.058 0.059 0.059 0.058 0.063 0.060 0.062 0.057 0.067 0.058 0.060 0.065 0.057 0.061 0.060 0.077 0.14 0.14 0.15 0.16 0.15 0.17 0.15 0.14 0.15 0.15 0.15 0.16 0.15 0.16 0.14 0.17 0.15 0.15 0.16 0.14 0.15 0.15 0.19 Bảng 3.3.1 Hoạt tính CMCase phân đoạn sau chạy qua cột Sepharose High Performance (HIC) STT MẪU Before Inject Inject (I) Wash (W) E1 E2 E3 E4 E5 E6 Đàm Quang Hiếu Volume 86.7 89.2 91.7 94.2 96.7 99.2 Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 88.95 90.45 92.95 95.45 97.95 100.45 2.262 0 0.062 0.068 0.066 0.075 0.069 90.49 0 0.155 0.170 0.164 0.188 0.173 86 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT MẪU Volume Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 47 E7 E8 E9 E10 E11 E12 E13 E14 E15 E16 E17 E18 E19 E20 E21 E22 E23 E24 E25 E26 E27 E28 E29 E30 E31 E32 E33 E34 E35 E36 E37 E38 E39 E40 E41 E42 E43 E44 101.7 104.2 106.7 109.2 111.7 114.2 116.7 119.2 121.7 124.2 126.7 129.2 131.7 134.2 136.7 139.2 141.7 144.2 146.7 149.2 151.7 154.2 156.7 159.2 161.7 164.2 166.7 169.2 171.7 174.2 176.7 179.2 181.7 184.2 186.7 189.2 191.7 194.2 102.95 105.45 107.95 110.45 112.95 115.45 117.95 120.45 122.95 125.45 127.95 130.45 132.95 135.45 137.95 140.45 142.95 145.45 147.95 150.45 152.95 155.45 157.95 160.45 162.95 165.45 167.95 170.45 172.95 175.45 177.95 180.45 182.95 185.45 187.95 190.45 192.95 195.45 0.063 0.062 0.076 0.062 0.062 0.060 0.064 0.067 0.066 0.088 0.095 0.115 0.143 0.157 0.153 0.165 0.147 0.133 0.105 0.093 0.088 0.065 0.065 0.083 0.111 2.393 2.907 3.126 3.646 3.489 3.147 3.076 3.126 3.910 4.158 3.753 3.988 3.184 0.158 0.154 0.191 0.155 0.156 0.151 0.159 0.167 0.165 0.220 0.238 0.288 0.357 0.393 0.381 0.412 0.366 0.332 0.261 0.233 0.220 0.163 0.163 0.207 0.279 5.983 7.269 7.816 9.114 8.723 7.868 7.690 7.816 9.774 10.395 9.383 9.969 7.959 Đàm Quang Hiếu 87 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT MẪU Volume Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 E45 E46 E47 E48 E49 E50 E51 E52 E53 E54 E55 E56 E57 E58 E59 E60 E61 E62 E63 E64 E65 E66 E67 E68 E69 E70 E71 E72 E73 E74 E75 E76 E77 E78 E79 E80 E81 E82 196.7 199.2 201.7 204.2 206.7 209.2 211.7 214.2 216.7 219.2 221.7 224.2 226.7 229.2 231.7 234.2 236.7 239.2 241.7 244.2 246.7 249.2 251.7 254.2 256.7 259.2 261.7 264.2 266.7 269.2 271.7 274.2 276.7 279.2 281.7 284.2 286.7 289.2 197.95 200.45 202.95 205.45 207.95 210.45 212.95 215.45 217.95 220.45 222.95 225.45 227.95 230.45 232.95 235.45 237.95 240.45 242.95 245.45 247.95 250.45 252.95 255.45 257.95 260.45 262.95 265.45 267.95 270.45 272.95 275.45 277.95 280.45 282.95 285.45 287.95 290.45 3.522 3.363 3.208 2.807 3.165 3.295 3.274 1.264 3.199 2.010 1.973 1.897 1.747 1.634 0.066 0.069 0.077 0.060 0.061 0.064 0.065 0.062 0.067 0.059 0.063 0.062 0.084 0.071 0.066 0.058 0.067 0.067 0.065 0.064 0.070 0.078 0.077 0.081 8.806 8.406 8.020 7.017 7.911 8.237 8.185 3.161 7.998 5.024 4.933 4.742 4.368 4.086 0.165 0.172 0.191 0.150 0.153 0.161 0.161 0.155 0.167 0.149 0.157 0.156 0.209 0.178 0.166 0.145 0.167 0.166 0.162 0.161 0.175 0.195 0.193 0.202 Đàm Quang Hiếu 88 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT MẪU Volume Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 103 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117 118 119 120 121 122 123 E83 E84 E85 E86 E87 E88 E89 E90 E91 E92 E93 E94 E95 E96 E97 E98 E99 E100 E101 E102 E103 E104 E105 E106 E107 E108 E109 E110 E111 E112 E113 E114 E115 E116 E117 E118 E119 E120 291.7 294.2 296.7 299.2 301.7 304.2 306.7 309.2 311.7 314.2 316.7 319.2 321.7 324.2 326.7 329.2 331.5 334 336.5 339 341.5 344 346.5 349 351.5 354 356.5 359 361.5 364 366.5 369 371.5 374 376.5 379 381.5 384 292.95 295.45 297.95 300.45 302.95 305.45 307.95 310.45 312.95 315.45 317.95 320.45 322.95 325.45 327.95 330.45 332.75 335.25 337.75 340.25 342.75 345.25 347.75 350.25 352.75 355.25 357.75 360.25 362.75 365.25 367.75 370.25 372.75 375.25 377.75 380.25 382.75 385.25 0.077 0.085 0.103 2.261 2.305 2.468 2.671 2.775 3.232 2.704 2.772 2.885 3.220 2.788 2.878 2.008 2.937 2.736 3.272 2.642 2.812 3.581 3.937 3.925 4.575 3.986 4.537 5.818 6.562 6.075 6.261 6.444 6.053 6.183 6.084 6.129 5.838 5.374 0.193 0.212 0.257 5.653 5.762 6.170 6.678 6.939 8.081 6.761 6.930 7.212 8.050 6.969 7.195 5.019 7.342 6.839 8.180 6.604 7.030 8.953 9.844 9.813 11.437 9.965 11.342 14.546 16.404 15.189 15.653 16.109 15.132 15.458 15.210 15.323 14.594 13.434 Đàm Quang Hiếu 89 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT MẪU Volume Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 124 125 126 127 128 129 130 131 132 133 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144 145 146 147 148 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160 161 E121 E122 E123 E124 E125 E126 E127 E128 E129 E130 E131 E132 E133 E134 E135 E136 E137 E138 E139 E140 E141 E142 E143 E144 E145 E146 E147 E148 E149 E150 E151 E152 E153 E154 E155 E156 E157 E158 386.5 389 391.5 394 396.5 399 401.5 403.8 406.3 408.8 411.3 413.8 416.3 418.8 421.3 423.8 426.3 428.8 431.3 433.8 436.3 438.8 441.3 443.8 446.3 448.8 451.3 453.8 456.3 458.8 461.3 463.8 466.3 468.8 471.3 473.8 476.3 478.8 387.75 390.25 392.75 395.25 397.75 400.25 402.75 405.05 407.55 410.05 412.55 415.05 417.55 420.05 422.55 425.05 427.55 430.05 432.55 435.05 437.55 440.05 442.55 445.05 447.55 450.05 452.55 455.05 457.55 460.05 462.55 465.05 467.55 470.05 472.55 475.05 477.55 480.05 4.545 3.231 2.862 1.883 1.424 0.063 0.061 0.061 0.061 0.062 0.072 0.064 0.061 0.065 0.061 0.067 0.060 0.073 0.062 0.062 0.059 0.063 0.059 0.067 0.067 0.061 0.060 0.069 0.066 0.064 0.065 0.072 0.062 0.061 0.062 0.062 0.070 0.067 11.363 8.076 7.156 4.707 3.561 0.157 0.153 0.153 0.153 0.154 0.181 0.161 0.154 0.163 0.152 0.169 0.150 0.182 0.156 0.155 0.149 0.157 0.147 0.168 0.167 0.152 0.149 0.172 0.164 0.160 0.161 0.180 0.156 0.153 0.155 0.155 0.174 0.168 Đàm Quang Hiếu 90 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật Trường ĐH Bách Khoa Hà Nội Viện CN Sinh học CN Thực phẩm STT MẪU Volume Mid volume CMCase, IU/ml Σ CMCase,IU 162 163 164 165 166 167 168 E159 E160 E161 E162 E163 E164 E165 481.3 483.8 486.3 488.8 491.3 493.8 496.3 482.55 485.05 487.55 490.05 492.55 495.05 497.55 0.070 0.064 0.071 0.068 0.063 0.062 0.070 0.175 0.160 0.177 0.169 0.158 0.154 0.175 Đàm Quang Hiếu 91 Luận văn Thạc sĩ Kỹ thuật ... thể hoạt tính môi trường axit Xuất phát từ yêu cầu thực tiễn cấp thiết tiến hành nghiên cứu đề tài: Sàng lọc phân tích đặc tính enzyme thủy phân cellulose bền nhiệt hoạt động môi trường axit từ. .. loài nấm chịu nhiệt phân hủy cellulose mạnh cellulase tách chiết từ canh trường lại có hoạt tính thấp phân hủy cellulose liên quan mật thiết tới hệ sợi [26] Cellulase nấm mốc chịu nhiệt tác động. .. thấy enzyme ưa nhiệt ưa axit Enzyme có nhiệt độ tối ưu khoảng 80 °C Đây enzyme chịu nhiệt có thời gian bán hủy pH 1.8 Enzyme chịu nhiệt phụ thuộc lớn vào pH: pH trung tính tỷ lệ bất hoạt với nhiệt