Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ và nội sinh cây lúa vùng ngập mặn có kích hoạt tính kích thích tăng trưởng cây trồng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP HỒ CHÍ MINH  BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài SÀNG LỌC VI KHUẨN VÙNG RỄ VÀ NỘI SINH CÂY LÚA VÙNG NGẬP MẶN CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG CÂY TRỒNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH – SINH HỌC PHÂN TỬ GVHD: ThS NGUYỄN VĂN MINH SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA MSSV: 1153010264 KHÓA: 2011 – 2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng năm 2015 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đề tài này, cố gắng thân có hƣớng dẫn thầy cô, anh chị giúp đỡ bạn bè Đầu tiên, cảm ơn ba mẹ, cảm ơn gia đình bên con, tạo điều kiện tốt để hoàn thành tốt việc học Em xin chân thành cảm ơn tất thầy cô Khoa Công nghệ Sinh học Trƣờng Đại học Mở Thành phố Hồ Chí Minh truyền đạt kiến thức tảng vô quý giá, tạo tiền đề để em tiếp tục học tập, nghiên cứu Em xin lời gửi cảm ơn chân thành đền thầy Nguyễn Văn Minh cô Dƣơng Nhật Linh bên cạnh định hƣớng, truyền đạt kinh nghiệm, động viên em hoàn thành đề tài Em xin chân thành cảm ơn chị Võ Thị Yến Nhi, chị Nguyễn Thị Mỹ Linh, anh Hà Chế Linh anh, chị, bạn em phòng thí nghiệm Vi sinh ủng hộ giúp đỡ em suốt thời gian thực đề tài Cuối cùng, em xin gửi đến tất thầy cô, anh chị, bạn bè lời biết ơn kích chúc sức khỏe, may mắn gặt hái nhiều thành công tƣơng lai Em xin chân thành cảm ơn Sinh viên thực NGUYỄN BÍCH HOA DANH MỤC DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích gieo trồng lúa nƣớc (nghìn ha) .6 Bảng 1.2 Năng suất lúa nƣớc (tạ/ha) .6 Bảng 1.3 Phân loại đất mặn Bảng 2.1 Xây dựng đƣờng chuẩn phospho 31 Bảng 2.2 Xây dựng đƣờng chuẩn IAA 34 Bảng 3.1 Đặc điểm đại thể chủng đƣợc phân lập 49 Bảng 3.2 Đặc điểm vi thể chủng phân lập 53 Bảng 3.3 Số chủng phân lập đƣợc từ mẫu 58 Bảng 3.4 Khả chịu mặn vi khuẩn nồng độ muối khảo sát .58 Bảng 3.5 Kết định lƣợng P2O5 chủng 64 Bảng 3.6 Kết định lƣợng sinh IAA chủng 66 Bảng 3.7 Bảng tóm tắt chủng có hoạt tính kích thích tăng trƣởng thực vật 70 Bảng 3.8 Kết định danh sinh hóa vi khuẩn thuộc nhóm Azotobacter 73 Bảng 3.9 Kết định danh sinh hóa vi khuẩn thuộc nhóm Bacillus .74 Bảng 3.10 Kết chiều dài rễ, thân lúa, trọng lƣợng tƣơi, trọng lƣợng khô 78 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA i DANH MỤC DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Hình thái Azotobacter môi trƣờng vô đạm (A) tế bào vi khuẩn dƣới kính hiển vi (B) (http://inst.bact.wisc.edu) .23 Bảng 3.1 Đặc điểm đại thể chủng đƣợc phân lập 49 Hình 3.1 Hình đại thể số chủng vi khuẩn môi trƣờng NA 53 Bảng 3.2 Đặc điểm vi thể chủng phân lập 53 Hình 3.2 Hình ảnh quan sát vi thể số chủng phân lập đƣợc (X100) 57 Hình 3.3 Khả cố định nitơ phân tử môi trƣờng vô đạm Asbhy chủng TĐ9 TĐ1 63 Hình 3.4 Khả hòa tan lân vi khuẩn môi trƣờng Pikovskaya chủng TĐ13 LĐ2 64 Hình 3.5 Kết thử khả tƣơng thích chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn .75 Hình 3.6 Hạt lúa nảy mầm đĩa agar 76 Hình 3.7 Hạt lúa nảy mầm đƣợc ngâm dịch khuẩn tƣơng ứng với nghiệm thức .77 Hình 3.8 Giai đoạn lúa phát triển đƣợc ngày ngày sau gieo 77 Hình 3.9 Chiều dài rễ nghiệm thức 81 Hình 3.10 Chiều dài thân nghiệm thức 81 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA ii DANH MỤC DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 2.1 Bố trí thí nghiệm 28 Sơ đồ 2.2 Quy trình định lƣợng phospho 32 Sơ đồ 2.3 Quy trình định lƣợng IAA .35 DANH MỤC BIỂU ĐỒ Biều đồ 3.1 Đồ thị biểu diễn nồng độ phospho tan dịch nuôi cấy chủng.65 Biểu đồ 3.2 Đồ thị biểu diễn nồng độ IAA dịch nuôi cấy chủng .68 Biểu đồ 3.3 Đồ thị biểu diễn chiều dài rễ nghiệm thức 79 Biểu đồ 3.4 Đồ thị biểu diễn chiều dài thân nghiệm thức 79 Biểu đồ 3.5 Đồ thị biểu diễn trọng lƣợng tƣơi nghiệm thức .80 Biểu đồ 3.6 Đồ thị biểu diễn trọng lƣợng khô nghiệm thức .80 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA iii DANH MỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit Đđ Đậm đặc H Giờ IAA Indole Acetic Acid MS Minimal Salt NA Nutrient Agar NB Nutrient Broth OD Optical Density ppm Parts per milion TSA Tryticase Soy Agar TSB Tryticase Soy Broth SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA iv DANH MỤC MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ PHẦN 1: 1.1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU .4 GIỚI THIỆU SƠ LƢỢC VỀ CÂY LÚA 1.1.1 Sơ lƣợc lúa .5 1.1.2 Tình hình sản xuất lúa gạo giới 1.1.3 Tình hình sản xuất lúa gạo nƣớc 1.2 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐỘ MẶN ĐẾN SỰ SINH TRƢỞNG VÀ PHÁT TRIỂN CỦA THỰC VẬT 1.2.1 Sơ lƣợc đất mặn 1.2.2 Các vùng lúa nhiễm mặn Việt Nam 1.2.3 Tác hại mặn đến trồng 10 1.2.4 Tính chống chịu mặn lúa 11 1.3 VI SINH VẬT VÙNG RỄ 12 1.3.1 Sơ lƣợc vi khuẩn vùng rễ 12 1.3.2 Các nghiên cứu giới 13 1.3.3 Các nghiên cứu nƣớc 13 1.4 VI KHUẨN NỘI SINH .13 1.4.1 Sơ lƣợc vi khuẩn nội sinh .13 1.4.2 Tình hình nghiên cứu giới 14 1.4.3 Tình hình nghiên cứu nƣớc 15 1.5 SỰ CỐ ĐỊNH NITƠ PHÂN TỬ CỦA VI KHUẨN 15 1.5.1 Quá trình cố định nitơ phân tử 15 1.5.2 Cơ chế cố định nitơ phân tử 15 1.6 VI KHUẨN HÒA TAN LÂN .16 1.6.1 Vai trò lân trồng .16 1.6.2 Vi sinh vật hòa tan lân hữu 17 1.6.3 Vi sinh vật hòa tan lân vô .17 1.7 VI KHUẨN SINH IAA .18 1.8 VI KHUẨN BACILLUS 19 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA v DANH MỤC 1.9 VI KHUẨN AZOTOBACTER .20 PHẦN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 24 2.1 THỜI GIAN VÀ ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU 25 2.2 VẬT LIỆU 25 2.3 THIẾT BỊ, DỤNG CỤ, MÔI TRƢỜNG 25 2.3.1 Thiết bị 25 2.3.2 Môi trƣờng – hóa chất 26 2.3.3 Thuốc thử 26 2.4 PHƢƠNG PHÁP THỰC HIỆN 28 2.4.1 Bố trí thí nghiệm 28 2.4.2 Phƣơng pháp phân lập vi khuẩn chịu mặn 29 2.5 ĐỊNH TÍNH KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH NITƠ CỦA VI KHUẨN 30 2.6 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN 30 2.6.1 Nguyên tắc 30 2.6.2 Định tính khả hòa tan lân .31 2.6.3 Định lƣợng khả hòa tan lân 31 2.7 XÁC ĐỊNH KHẢ NĂNG SINH IAA 33 2.7.1 Nguyên tắc 33 2.7.2 Định lƣợng IAA dịch nuôi cấy vi khuẩn .33 2.8 ĐỊNH DANH 36 2.9 THÍ NGHIỆM THỬ KHẢ NĂNG TƢƠNG THÍCH GIỮA CÁC CHỦNG ĐƢỢC LỰA CHỌN 45 2.9.1 Nguyên tắc 45 2.9.2 Cách tiến hành .45 2.10 THÍ NGHIỆM TRỒNG LÚA .45 2.10.1 Bố trí thí nghiệm 45 2.10.2 Đánh giá số đặc tính nông học lúa 46 2.11 PHƢƠNG PHÁP THỐNG KÊ SỐ LIỆU .47 PHẦN 3: 3.1 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 48 KẾT QUẢ PHÂN LẬP 49 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA vi DANH MỤC 3.1.1 Kết quan sát đại thể 49 3.1.2 Kết quan sát vi thể 53 3.2 KHẢ NĂNG CHỊU MẶN CỦA VI KHUẨN 58 3.3 KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM NITƠ PHÂN TỬ .63 3.4 KHẢ NĂNG HÒA TAN LÂN .63 3.4.1 Định tính khả hòa tan lân .63 3.4.2 Định lƣợng khả phân giải lân chủng .64 3.5 KHẢ NĂNG SINH IAA .66 3.6 TÓM TẮT CÁC CHỦNG CÓ HOẠT TÍNH KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG THỰC VẬT 70 3.7 KẾT QUẢ ĐỊNH DANH 72 3.7.1 Kết định danh sơ 72 3.7.2 Kết định danh chủng thuộc chi Azotobacter 73 3.7.3 Kết định danh chủng thuộc chi Bacillus 73 3.8 KẾT QUẢ THỬ KHẢ NĂNG TƢƠNG THÍCH GIỮA CÁC CHỦNG VI KHUẨN ĐƢỢC LỰA CHỌN 75 3.9 KẾT QUẢ THỬ NGHIỆM KHẢ NĂNG KÍCH THÍCH TĂNG TRƢỞNG CỦA CÁC CHỦNG THỬ NGHIỆM TRÊN MÔ HÌNH TRỒNG LÚA 75 3.9.1 Chọn giống, ƣơm hạt giống nảy mầm, tiến hành trồng lúa 75 3.9.2 Kết số đăc tính nông học 78 PHẦN 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 85 4.1 KẾT LUẬN 86 4.2 ĐỀ NGHỊ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO .87 PHỤ LỤC 96 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA vii ĐẶT VẤN ĐỀ ĐẶT VẤN ĐỀ SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA PHỤ LỤC 20 LN7 396,00 400,00 402,00 21 LN9 267,00 254,00 256,00 22 LN10 317,00 326,00 346,00 23 LN11 422,00 416,00 419,00 24 LS1 98,00 111,00 113,00 25 LS3 262,00 270,00 273,00 26 LS6 306,00 299,00 316,00 27 LS7 274,00 307,00 296,00 PHỤ LỤC 5: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm khả hòa tan lân so sánh khác biệt kiểm định Duncan chủng vi khuẩn phần mền thống kê Microsoft Excel 2010 Statgraphics plus 3.0 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance TĐ8 164,15 54,71667 18,35623 TĐ9 103,39 34,46333 88,94083 TĐ11 92,62 30,87333 175,4197 TĐ15 291,08 97,02667 2,569233 TN4 59,54 19,84667 17,31923 TN13 247,61 82,53667 99,54763 TS1 59,54 19,84667 99,96923 TS3 178,77 59,59 24,5791 TS5 96,84 32,28 0,3433 LĐ2 168,76 56,25333 66,62623 LN1 194,15 64,71667 3,279633 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 107 PHỤ LỤC LN7 102,62 34,20667 133,8049 LN8 104,54 34,84667 93,39143 ANOVA Source of Variation SS Between Groups df MS F P−value F crit 20384,91 12 1698,742 26,79577 1,37438E−11 2,1479 Within Groups 1648,294 26 63,39591 Total 22033,2 38 PHỤ LỤC 6: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm khả sinh IAA so sánh khác biệt kiểm định Ducan chủng vi khuẩn phần mền thống kê Microsoft Excel 2010 Statgraphics plus 3.0 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum Average Variance SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 108 PHỤ LỤC TĐ2 729 243 67 TĐ3 331 110,33 2,3333 TĐ4 898 299,33 6,3333 TĐ5 694 231,33 2,3333 TĐ6 2160 720 13 TĐ7 517 172,33 50,333 TĐ8 1861 620,33 156.33 TĐ9 2007 669 TĐ10 533 177,67 4,3333 TĐ13 711 237 52 TN6 343 114,33 101,33 TS3 517 172,33 50,333 LĐ4 727 242.33 2,3333 LĐ5 855 285 211 LN1 842 280,67 17,333 LN2 567 189 LN3 914 304,67 36,333 LN5 1067 355,67 30,333 LN6 1008 336 25 LN7 1198 399,33 9,3333 LN9 777 259 49 LN10 989 329,67 220,33 LN11 1257 419 LS1 322 107,33 66,333 LS3 805 268,33 32,333 LS6 921 307 73 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 109 PHỤ LỤC LS7 877 292,33 282,33 ANOVA Source of Variation SS df MS F P−value F crit Between Groups 1891597 26 72754 1245,1 3,66605E−66 1,7016 Within Groups 3155,33 54 58,432 Total 1894752 80 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 110 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 7: Giống lúa OM 6561 - Giống lúa OM 6561 giống chịu đƣợc điều kiện đất bị nhiễm phèn mặn - Đặc tính:  Thời gian sinh trƣởng: ngắn ngày 83 – 93 ngày  Chiều cao cây: 93 – 95 cm  Kháng rầy nâu khá, giống lúa chịu rầy nâu tốt  Dạng hình đẹp, để nhánh khá, yếu cây, canh tác đƣợc hai vụ năm, thích nghi rộng nhiều vùng đất Cần bón phân cân đối, chống đổ ngã, giảm giá thành lúa  Trọng lƣợng: 1.000 hạt: 26,00 – 26,50 gr  Phẩm chất hạt gạo: chiều dài hạt: 6,50 – 6,90 mm; Hàm lƣợng Amylose: 24,10 %, độ bạc bụng (hạt cấp 9): 5,0 – 6,0 %; gạo đẹp, bạc bụng, có mùi thơm nhẹ  Tiềm năng suất: vụ đông xuân: – tấn/ ha, vụ hè thu: – tấn/ PHỤ LỤC 8: Định danh Định danh Bacillus sp theo khóa phân loại Cowan and Steel`s SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 111 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 9: Hình ảnh thử nghiệmsinh hóa Hình Khả lên men đƣờng, khả sinh trƣởng môi trƣờng có Na – benzoat, khả phân giải nitrate SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 112 PHỤ LỤC Hình Thử phản ứng Citrat, khả phát triển đƣợc 50oC Hình Khả di động, thử phản ứng Indol Hình Khả bắt màu congo red, khả phân giải casein, khả phân giải tinh bột SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 113 PHỤ LỤC Hình Thử nghiệm Catalase, thử nghiệm Oxidase PHỤ LỤC 10: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm đánh giá chiều dài rễ lúa so sánh khác biệt ý nghĩa kiểm định Duncan nghiệm thức Bảng Kết đo chiều dài rễ nghiệm thức STT Nghiệm thức Chiều dài rễ (cm) DC 3,225 TĐ6 8,851 TĐ9 10,437 TĐ13 7,544 TS3 11,217 4C 12,071 DC 4,653 TĐ6 8,510 TĐ9 9,713 10 TĐ13 7,705 11 TS3 9,957 12 4C 13,227 13 DC 4,327 14 TĐ6 7,659 15 TĐ9 9,011 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 114 PHỤ LỤC 16 TĐ13 6,412 17 TS3 10,227 18 4C 12,918 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count Sum 12,205 DC 25,02 TĐ6 29,161 TĐ9 21,661 TĐ13 31,401 TS3 38,216 4C ANOVA Source of Variation SS Between Groups 132,67 5,4802 Within Groups Total 138,15 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA Average 4,0683 8,34 9,7203 7,2203 10,467 12,739 df 12 Variance 0,56 0,3769 0,5084 0,4965 0,4401 0,3582 MS 26,535 0,4567 F 58,103 P-value 5,42384E-08 F crit 3,1059 17 115 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 11: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm đánh giá chiều dài thân lúa so sánh khác biệt ý nghĩa kiểm định Duncan nghiệm thức Bảng Kết đo chiều dài thân nghiệm thức STT Nghiệm thức Chiều dài thân (cm) DC 30,985 TĐ6 39,691 TĐ9 40,035 TĐ13 35,021 TS3 42,448 4C 49,221 DC 33,232 TĐ6 38,283 TĐ9 41,796 10 TĐ13 37,083 11 TS3 44,211 12 4C 50,275 13 DC 32,796 14 TĐ6 37,33 15 TĐ9 40,898 16 TĐ13 36,232 17 TS3 45,035 18 4C 50,501 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count DC Sum 97,013 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA Average 32,338 Variance 1,4198 116 PHỤ LỤC TĐ6 TĐ9 TĐ13 TS3 4C ANOVA Source of Variation Between Groups Within Groups 115,3 122,73 108,34 131,69 150 38,435 40,91 36,112 43,898 49,999 SS 575,41 13,786 df 12 589,2 Total 1,4108 0,7754 1,0738 1,7466 0,4667 MS 115,08 1,1489 F P-value 100,17 2,33E-09 F crit 3,1059 17 PHỤ LỤC 12: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm đánh giá trọng lƣợng tƣơi so sánh khác biệt ý nghĩa kiểm định Duncan nghiệm thức Bảng Kết trọng lƣợng tƣơi nghiệm thức STT Nghiệm thức Trọng lƣợng tƣơi (g) DC 1,192 TĐ6 2,171 TĐ9 2,201 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 117 PHỤ LỤC TĐ13 2,111 TS3 4,876 4C 4,898 DC 1,845 TĐ6 2,766 TĐ9 2,412 10 TĐ13 1,909 11 TS3 4,431 12 4C 4,136 13 DC 1,371 14 TĐ6 1,987 15 TĐ9 2,600 16 TĐ13 2,311 17 TS3 3,997 18 4C 5,492 Anova: Single Factor SUMMARY Groups DC TĐ6 TĐ9 TĐ13 TS3 4C Count Sum Average Variance 4,408 1,4693 0,1139 6,924 2,308 0,1658 7,213 2,4043 0,0398 6,331 2,1103 0,0404 13,304 4,4347 0,1932 14,526 4,842 0,462 ANOVA Source of Variation SS Between Groups 28,165 2,0302 Within Groups Total df 30,195 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 12 MS 5,633 0,1692 F 33,296 P-value 1,23924E-06 F crit 3,1059 17 118 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 13: Kết xử lý thống kê ANOVA yếu tố thí nghiệm đánh giá trọng lƣợng khô so sánh khác biệt ý nghĩa kiểm định Duncan nghiệm thức Bảng Kết trọng lƣợng khô nghiệm thức STT Nghiệm thức Trọng lƣợng khô (g) DC 0,251 TĐ6 0,322 TĐ9 0,331 TĐ13 0,298 TS3 0,676 4C 0,683 DC 0,189 TĐ6 0,459 TĐ9 0,366 10 TĐ13 0,263 11 TS3 0,639 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 119 PHỤ LỤC 12 4C 0,621 13 DC 0,178 14 TĐ6 0,256 15 TĐ9 0,411 16 TĐ13 0,341 17 TS3 0,603 18 4C 0,674 Anova: Single Factor SUMMARY Groups Count DC TĐ6 TĐ9 TĐ13 TS3 4C ANOVA Source of Variation SS Between Groups 0,5205 0,0357 Within Groups Total Sum Average Variance 0,618 0,206 0,0015 1,037 0,3457 0,0107 1,108 0,3693 0,0016 0,902 0,3007 0,0015 1,918 0,6393 0,0013 1,978 0,6593 0,0011 df 0,5563 SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 12 MS 0,1041 0,003 F 34,974 P-value 9,44503E-07 F crit 3,1059 17 120 PHỤ LỤC SVTH: NGUYỄN BÍCH HOA 121 ... sinh lúa vùng ngập mặn có hoạt tính kích thích tăng trƣởng trồng Với mục tiêu nhằm phân lập vi khuẩn chịu mặn vùng rễ, nƣớc nội sinh lúa có hoạt tính kích thích tăng trƣởng trồng Nội dung thực... lập vi khuẩn vùng rễ, nƣớc nội sinh lúa  Sàng lọc vi khuẩn có khả chịu mặn lúa  Xác định hoạt tính cố định nitơ phân tử, hòa tan lân, sinh IAA chủng phân lập đƣợc  Định danh chủng có hoạt tính. .. vùng rễ lúa có khả cố định đạm tổng hợp IAA 1.4 VI KHUẨN NỘI SINH 1.4.1 Sơ lƣợc vi khuẩn nội sinh Vi khuẩn nội sinh vi khuẩn sống mô thực vật đƣợc tìm thấy rễ, thân, lá, thực vật Vùng rễ nơi xuất