Sàng lọc vi khuẩn vùng rễ có khả năng kích thích tăng trưởng và kháng nấm gây bệnh Collectotrichum SP. cho cây ớt

Bào t phát tán nh gió và nh côn trùng... subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B... Nitrogenase là h enzyme xúc tác cho ph n ng kh N2 thành NH3... E164 và th kh n n

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGH P

tài:

SÀNG L C VI KHU N VÙNG R CÓ KH

KHÁNG N M GÂY B NH COLLECTOTRICHUM SP CHO CÂY T

KHOA: CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGH VI SINH

GVHD: ThS Nguy n Thanh Thu n

ThS Nguy năV năMinh SVTT: Lê Th Y n Nhi

MSSV: 1053010532 Khóa: 2010 ậ 2014

Tp H Chí Minh, Tháng 06 N m 2014

hoàn thành đ tài này, em xin g i l i c m n đ n các Th y Cô khoa Công Ngh

Sinh H c, tr ng i h c M thành ph H Chí Minh đã gi ng d y và truy n đ t

ki n th c cho em trong su t nh ng n m v a qua đ em làm t t đ tài khóa lu n này

Em xin g i c m n sâu s c t i th y Nguy n V n Minh đã t n tình h ng d n, ch

b o em trong su t th i gian em th c hi n đ tài Em xin c m cô D ng Nh t Linh,

ng i đã truy n đ t cho chúng em nhi u kinh nghi m quý báu

Em xin c m n anh an Duy Pháp, ch Võ Ng c Y n Nhi và ch Nguy n Th M

Linh, nh ng ng i anh, ng i ch luôn ng h , giúp đ em trong lúc làm đ tài

Bên c nh đó, tôi xin c m n các b n c a tôi, các b n sinh viên cùng làm đ tài

trong cùng th i gian v i tôi, các b n sinh viên h c vi c phòng thí nghi m Công ngh Vi sinh đã luôn quan tâm, giúp đ tôi trong quá trình th c hi n đ tài này

Cu i cùng con xin c m n Ba, M , c m n gia đình đã luôn bên con, t o m i đi u

ki n t t nh t đ con hoàn thành vi c h c c a mình

B n n m đ i h c k t thúc, nh ng v i tôi đó v n s mãi là k ni m đ p trong đ i

mình

Em xin g i l i chúc s c kh e đ n t t c ng i th y, ng i cô đáng kính khoa Công

ngh sinh h c, Tr ng i h c m thành ph H Chí Minh, xin chúc th y cô ngày

càng g t hái đ c nhi u thành công

Tôi xin chúc các b n c a tôi s luôn luôn thành công trên con đ ng b c vào đ i,

c ng hi n tài n ng và s c tr cho t ng lai đ t n c

Xin chân thành c m n

Sinh viên th c hi n

DANH M C CH VI T T T

PGPR Plant Growth Promotion Rhizobacteria

DANH M C HÌNH NH

Hình 1.1: Hình nh t bào (a) và khu n l c (b)c a vi khu n Bacillussubtilis 13

Hình 2.1: Vòng kháng n m b ng ph ng pháp kh ch tan đ a 37

Hình 3.1: Quan sát đ i th khu n l c trên môi tr ng NA 53

Hình 3.2 Quan sát vi th vi khu n d i kính hi n vi x100 55

Hình 3.3: M t s m u b nh thu th p đ c 56

Hình 3.4: Quan sát đ i th n m trên môi tr ng PDA 57

Hình 3.5: Bào t n m b nh quan sát d i kính hi n vi quang h c 57

Hình 3.6: Tri u ch ng b nh thán th trên qu t đ c lây b nh nhân t o 58

Hình 3.7: Khu n l c ch ng T7 m c trên môi tr ng Ashby 60

Hình 3.8: Ph n ng màu gi a thu c th Nesler’s v i l ng NH3 sinh ra t các ch ng vi khu n 63

Hình 3.9: Ph n ng màu gi a thu c th FeCl3-H2SO4và IAA sinh ra b i vi khu n 66

Hình 3.10: Kh n ng phơn gi i Ca3(PO4)2 trong môi tr ng Pikovskaya 68

Hình 3.11: Ph n ng màu gi a các thu c th v i phospho hòa tan t các ch ng vi khu n 70

Hình 3.12: Kh n ng kháng n m gây b nh c a các ch ng vi khu n vùng r qua ph ng pháp khu ch tán đ a 73

Hình 3.13: K t qu ph n ng Nitate, lên men đ ng, VP c a ch ng B6 77

Hình 3.14: K t qu th đ i kháng ba ch ng vi khu n có ho t tính m nh 78

Hinh 3.15: So sánh chi u cao c a cơy đ i ch ng v i hai nghiêm th c ph i tr n và

ch ng vi khu n B21 82

DANH M C B NG

B ng 2.1: Xây d ng đ ng chu n NH3 29

B ng 2.2: Xây d ng đ ng chu n phospho 31

B ng 2.3: Xây d ng đ ng chu n IAA 34

B ng 3.1:K t qu quan sát đ i th khu n l c 51

B ng 3.2: K t qu quan sát vi th ch ng vi khu n vùng r 53

B ng 3.3: K t qu đ nh tính kh n ng c đ nh đ m 59

B ng 3.4: K t qu đ nh l ng kh n ng sinh NH3c a các ch ng 61

B ng 3.5: K t qu đ nh tính kh n ng sinh IAA 63

B ng 3.6: K t qu đ nh l ng IAA c a các ch ng 64

B ng 3.7: K t qu đ nh tính kh n ng hòa tan Ca3(PO4)2 67

B ng 3.8: N ng đ phospho do các ch ng vi khu n hòa tan đ c 68

B ng 3.9: K t qu kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi khu n vùng r 71

B ng 3.10: ng kính vòng kháng n m gây b nh c a vi khu n vùng r cây t 72

B ng 3.11: K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng T7 74

B ng 1.12: K t qu đ nh danh ch ng T16 75

B ng 3.13: K t qu đ nh danh ch ng B21 75

B ng 3.14: K t qu đ nh danh ch ng B6 76

B ng 3.15: K t qu t ng tr ng c a cây t 78

DANH M C BI Uă

Bi u đ 3.1: N ng đ NH3 c a các ch ng c đ nh đ m 62

Bi u đ 3.2: N ng đ IAA c a vi khu n 65

Bi u đ 3.3: N ng đ phospho hoà tan c a vi khu n 69

Bi u đ 3.4: ng kính kháng n m gây b nh 72

Bi u đ 3.5: Chi u cao cây c a các nghi m th c 79

Bi u đ 3.6: Kh i l ng t i, kh i l ng khô c a các nghi m th c 79

Bi u đ 3.7: Ch s GPE c a các nghi m th c theo ph n tr m 80

DANH M CăS ă

S đ 2.1: B trí thí nghi m 23

S đ 2.2: Quy trình phân l p 24

S đ 2.3: Quy trình đ nh l ng NH3 30

S đ 2.4: Quy trình đ nh l ng phospho 33

S đ 2.5: Quy trình đ nh l ng IAA 35

M C L C

DANH M C CH VI T T T i

DANH M C HÌNH NH ii

DANH M C B NG iv

DANH M C BI U v

DANH M CăS ă vi

M C L C vii

T V Nă 1

PH N 1 T NG QUAN TÀI LI U 4

1.1 CÂY T VÀ B NHăTHỄNăTH ăTRểNăCỂYă T 5

1.1.1 S l c v cây t 5

1.1.2 B nh thán th trên cơy t 5

1.2 M T S VI KHU N VÙNG R 7

1.2.1 Khái ni m vùng r 7

1.2.2 M t s ho t tính kích thích t ng tr ng cây tr ng c a vi khu n vùng r 7

1.2.3 Ba cillus 13

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U VI KHU N VÙNG R HI N NAY 15

1.3.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i 15

1.3.2 Tình hình nghiên c u t i Vi t Nam 17

PH N 2: V T LI UăVẨăPH NGăPHỄP 19

2.1 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U 20

2.2 V T LI U 20

2.3 THI T B D NG C MỌIăTR NG 20

2.3.1 Thi t b 20

2.3.2 D ng c 21

2.3.3 Môi tr ng và hóa ch t 21

2.4 PH NGăPHỄPăNGHIểNăC U 22

2.4.1 B trí thí nghi m 22

2.4.2 Ph ng pháp l y m u và làm thu n 23

2.4.3 Ti n hƠnh quan sát đ i th và vi th 25

2.4.4 Xác đ nh ho t tính kích thích t ng tr ng c a vi khu n vùng r

28

2.4.5 Ph ng pháp th ng kê s li u 38

2.4.6 nh danh 38

2.4.7 Thí nghi m kh o xác kh n ng kích thích t ng tr ng trên cây t

46

PH N 3: K T QU VÀ TH O LU N 50

3.1 K T QU PHÂN L P 51

3.1.1 Quan sát đ i th 51

3.1.2 Quan sát vi th 53

3.1.3 K t qu phân l p và lây b nh nhân t o n m Collectotr ichum sp trên t 56

3.2 K T QU KH N NGăKệCHăTHệCHăT NGăTR NG 58

3.2.1 Kh n ng c đ nh nit phơn t 59

3.2.2 Kh n ng sinh IAA 63

3.2.3 Kh n ng hòa tan Ca3(PO4)2 66

3.2.4 K t qu đ nh tính kh n ng kháng vi n m gây b nh c a vi khu n vùng r t cây t 70

3.3 K T QU NH DANH SINH HÓA 74

3.3.1 Ch ng T7 74

3.3.2 Ch ng T16 74

3.3.3 Ch ng B21 75

3.3.4 Ch ng B6 76

3.4.1 K t qu t ng thích c a các ch ng đ c ch n đ th c nghi m 77

3.4.2 K t qu th c nghi m 78

PH N 4: K T LU NăVẨă NGH 83

4.1 K T LU N 84

4.2 NGH 84

TÀI LI U THAM KH O 85

PH L C 1: MỌIăTR NG HÓA CH T 92

PH L C 2: GIÁ TR OD,ă TH ,ă NG CHU N 97

PH L C 3: K T QU X LÝ TH NG KÊ ANOVA 102

T V Nă

Vi khu n vùng r (Rhizobacteria) có kh n ng kích thích s t ng tr ng c a th c

v t g i là vi khu n khích thích s phát tri n th c v t (Plant Growth Promotion Rhizobacteria = PGPR).Theo Saharan (2011), PGPR là nhóm vi khu n đ c tìm th y trong đ t t nhiên, có tác đ ng tích c c cho vùng r cây và mang l i l i ích cho cây

tr ng nh vào kh n ng thúc đ y t ng tr ng PGPR giúp t ng kh n ng c đ nh đ m

trong các cây h đ u, thúc đ y vi khu n c đ nh đ m s ng t do, t ng c ng cung c p

các ch t dinh d ng khác nh : P, S, Fe, Cu, s n xu t kích thích t th c v t, t ng

c ng vi khu n ho c n m có l i, ki m soát các b nh n m, vi khu n và góp ph n ki m

soát côn trùng gây h i (Saharan, 2011) Nhi u loài vi khu n vùng r nh :

Pseudomonas, Azospirillum, Azotobacter, Klebsiella, Enterobacter, Alcaligenes, Arthrobacter, Burkholderia, Bacillus và Serratia đư đ c báo cáo lƠ giúp t ng c ng

s t ng tr ng th c v t (Joseph và cs, 2007) Có r t nhi u nghiên c u ch ng minh kh

n ng kích thích t ng tr ng c a vi khu n vùng r đ i v i cây tr ng: nghiên c u c a

Kloepper và cs (1980) cho th y kh n ng kích thích t ng tr ng c a th c v t qua vi

khu n vùng r nh t o ra siderophores c ch n m b nh, Ahmad (2005), Egamberdieva

(2008), đư có nh ng nghiên c u cho th y kh n ng t o hormone kích thích t ng tr ng

t nh ng vi khu n vùng r Pseudomonas, Azotobacter Yadegari và cs (2010) ch ra

kh n ng c đ nh đ m trên cơy đ u cô ve (Phaseolus vulgaris) c a PGPR

t (Capsicum) là cây gia v quan tr ng nh t trên th gi i (Burt, 2005) Trong s các cây tr ng thu c h cà (Solanaceae), cây t có t m quan tr ng th 2 ch sau cây cà chua Nhi u thành ph n trong qu t có giá tr dinh d ng quan tr ng, làm gia v , mùi

th m vƠ mƠu s c Trong qu t có ch a nhi u vitamin C h n so v i qu thu c h cây

có múi và ch a nhi u vitamin A h n so v i c cà r t (Tài li u Nông nghi p, 2013)

Tuy nhiên, cơy t th ng ch u s t n công c a nhi u đ i t ng b nh h i Trong

đó, b nh thán th gơy ra b i loƠi n m Colletotrichum sp., (Isaac, 1992), b nh ch t r vƠ

nhân ki m soát n m b nh ph bi n hi n nay là x d ng các thu c hóa h c nh :

Benlate, Topsin M 70WP, Score 250ND (V Tri u M n, 2007) Tuy nhiên,vi c s

d ng hóa ch t trong s n xu t không ch làm m t tính an toàn, mà còn phá v s cân

b ng sinh h c trên đ ng ru ng, v a gây ô nhi m môi tr ng, v a lƠm gia t ng chi phí

đ u t

Nhi u nghiên c u cho th y s d ng PGPR có th ki m soát đ c các n m b nh

trên hi u qu : nghiên c u c a Lamsal vƠ cs (2012), đư ch ng minh kh n ng ki m soát

Collectotrichum sp gây b nh thán th trên cơy tiêu nh PGPR, nghiên c u c a Lim và

cs ( 2010) ki m soát b nh phytophthora trên cây tiêu đ do Phytophthora capsici s

d ng Bacillus subtilis AH18 và B licheniformis K11 (thu c nhóm PGPR),….Bên c nh

đó PGPR c ng đư đ c nghiên c u là có kh n ng kích thích t ng tr ng cho cây t

trong nghiên c u c a Kanchana và cs (2013), ch ng Azospirillum sp phân l p t đ t

vùng r cây t có kh n ng c đ nh đ m, sinh IAA và m t s ho t tính kích thích khác,

nghiên c u c a Datta vƠ cs (2011) đư ch ng minh kh n ng kích thích t ng tr ng c a

vi khu n vùng r cây t trong đi u ki n đ ng ru ng

Vi c sàng l c ra các vi khu n có trong vùng r nh m t o ra m t ch ph m sinh

h c chuyên d ng cho cây t v i kh n ng kích thích t ng tr ng và kháng n m b nh

gây có m t Ủ ngh a r t quan tr ng Do đó đ tài chúng tôi th c hi n “SƠngă l că viă khu năvùngăr ăćăkh ăn ngăḱchăth́chăt ngătr ngăvà kháng n m Collectotrichum

sp choăcơyă tă” lƠ r t c n thi t đ phát tri n m t s n ph m có ngu n g c sinh h c góp

ph n lƠm t ng n ng su t cho cơy t nh ng ít nh h ng đ n môi tr ng vƠ s c kh e con ng i, đ ng th i đ m b o v sinh an toƠn th c ph m lƠm t ng giá tr xu t kh u

N i dung nghiên c u:

 Phân l p vi khu n vùng r cây t

 Phơn l p n m Collectotrichum sp (gơy b nh thán th ) trên t

 Sàng l c các ch ng vi khu n vùng r có kh n ng kích thích t ng tr ng cây

tr ng (c đ nh đ m, hòa tan lân và sinh IAA, kháng n m)

 nh danh ch ng có ho t tính kích thích t ng tr ng đ c l a ch n

 Th c nghi m kh n ng kích thích c a vi khu n có ho t tính cao trên cây t

PH N 1

T NG QUAN TÀI LI U

1.1 CÂY T VÀ B NHăTHỄNăTH ăTRểNăCỂYă T

1.1.1 S ăl c v cây t

Cây t thu c h cà (Solanaceae) có ngu n g c t Nam M , có hai nhóm ph bi n

là t cay (Capsicum annuum L.) và t không cay (Capsicum annuum var grossum) t

cay đ c tr ng nhi u t nh, thành trong c n c, ph bi n nh t là: H i D ng, H i

Phòng, các t nh mi n Trung và thành Ph H Chí Minh (Hóc Môn, Bình Chánh) t

ng t đ c tr ng nhi u V nh Phúc, HƠ N i vƠ Ơ L t-Lơm ng (Lê Th Thanh

Th y và cs, 2008)

t là cây thân th o, ch u h n t t h n các cơy h cƠ khác nh : cƠ chua m đ t

d i 70% thì qu b cong, m t qu xù xì, không m n m t Cây t sinh tr ng phát tri n

t t nhi t đ 21-27oC ( T p chí Nông nghi p Vi t Nam, 2013)

Cây t hay đ c tr ng quanh n m, nh ng vƠo mùa m a cơy t hay b b nh, đi n

hình là b nh héo r th i qu làm nh h ng l n t i n ng su t và ph m ch t t Cho đ n nay ch a có bi n pháp h u hi u nào có th ng n ch n và phòng tr b nh này S d ng

phân bón, thu c hóa h c b o v th c v t đ i v i cây t làm gi m đ c sâu b nh nhanh chóng nh ng gơy nh h ng x u đ n môi tr ng và s c kh e c ng đ ng (Lê Th

Thanh Th y và cs, 2008)

1.1.2 B nhăthánăth ătrênăcơyă t

 Phân b

B nh thán th (Colletotrichum nigrum Elet Stal) ho c (Colletotrichum capsici

Bul and Bis) là b nh nguy hi m, gây th i qu t hàng lo t B nh r t ph bi n r t nhi u n c trên th gi i, đ c bi t là nh ng n c có khí h u nhi t đ i B nh gây h i

n ng trên h u h t các vùng tr ng t n c ta T t c các vùng tr ng t t p trung thu c

Hà N i, B c Giang, H i D ng, H ng Yên, Thái Bình, HoƠ Bình, Ngh An, Thanh

Hoá, Qu ng Bình, Qu ng Tr , Th a Thiên Hu đ u b b nh này phá ho i n ng T l

b nh nh ng ru ng nhi m b nh n ng có th lên t i 70% Công tác phòng tr b nh

thán th t t i các vùng tr ng ch a th c s mang l i hi u qu do nh ng hi u bi t v

b nh thán th c a ng i tr ng t còn h n ch , vi c gieo tr ng các gi ng t liên t c

nhi u n m đư t o đi u ki n thu n l i cho b nh thán th bùng phát m nh gơy khó kh n

cho vi c phòng tr (Theo Tài li u Nông Nghi p, 2014)

B nh r t ph bi n nhi u n c trên th gi đ t bi t lƠ các n c có khí h u nhi t

đ i B nh gây h i n ng trên h u h t các vùng tr ng t n c ta T l b nh nh ng

ru ng nhi m b nh n ng có th lên t i 70% (V Tri u M n, 2007)

 Tri u ch ng b nh

B nh có th h i thân, lá, qu và h t, nh ng h i ch y u trên qu vƠo gia đo n

chín V t b nh ban đ u là m t đóm nh , h i lõm, t trên b m t võ qu , sau 2-3 ngày kích th c v t b nh có th lên t i 1cm đ ng kính V t b nh th ng có hình thoi, lõm,

phân ranh gi i gi a mô b nh là m t đ ng mƠu đen ch y d c theo v t b nh Trên b

m t v t b nh có nh ng ch m nh lƠ đ a cƠnh c a n m gây b nh Các v t b nh có th

liên k t v i nhau làm qu b th i, qu khô có màu tr ng vàng b n

N m có th gây h i trên m t s ch i non, gây hi n t ng th i ng n t Ch i b h i

có mƠu nơu đen, b nh có th phát tri n n ng làm cây b ch t d n ho c cây b nh có qu

t ng ph n nh ng qu r t ít, ch t l ng kém ( V Tri u M n, 2007)

 Nguyên nhân gây b nh-đ căđi m phát sinh, phát tri n b nh

B nh do hai lo i n m Colletotrichum nigrum Elet Stal ho c Colletotrichum capsici ( Syd.) Bul and Bis gây ra Hai lo i t trên th ng song song phá ho i làm t

b th i nhanh chóng a cƠnh c a n m C nigrum đ ng kính t 120-280 µm có nhi u lông gai đen nh n đ nh, kích th c 55-190 x 6,5-65µm bào t phân sinh hình b u d c

ho c hình tr hai đ u tròn, không mƠu, đ n bƠo, kích th t 18-25 x 3 µm Cành bào t

phân sinh ng n hình g y kích th c 20-50 x 25 µm

n m C capsici thì đ a cƠnh có đ ng kính 70-100 µm có lông gai màu nâm

s m, đ nh có mƠu h i nh t có nhi u ng n ngang vƠ dƠi t i 150 µm Bào t phân sinh không mƠu, đ n bƠo, h i cong hình l i li m, kích th t 17-28 x 3-4 µm có gi t d u

bên trong Bào t phân sinh c a hai lo i n m này n y m m trong n c sau 4 gi , nhi t

đ thích h p cho n m gây b nh là 28-30 oC B nh phát tri n m nh trong đi u ki n nhi t

đ cao, m đ cao Bào t phát tán nh gió và nh côn trùng B nh gây thi t h i l n trong nh ng n m m a nhi u n c ta, b nh phát tri n m nh vào tháng 5-7 khi cây t đang th i kì thu ho ch qu B nh còn gây h i vƠo giai đo n sau thu ho ch trong quá

trình b o qu n và v n chuy n nh ng ru ng bón đ m nhi u, m t đ tr ng cao b nh

n ng Gi ng t chìa vôi Hu và s ng bò nhi m b nh n ng h n các gi ng ch thiên và

m t s gi ng Thái Lan nh p n i N m t n t i trên h t gi ng d i d ng s i n m và bào

t phơn sinh vƠ trên tƠn d cơy b nh Bào t phân sinh có s c s ng cao, trong đi u ki n

khô m c dù tƠn d b vùi trong đ t v n có th n y m m vào v sau (V Tri u M n,

Luân canh v i cây tr ng khác h B trí m t đ tr ng thích h p Di t côn trùng

h i qu Khi b nh xu t hi n có th phun m t vài lo i thu c sau: Benlate 50WP 1 kg/ ha; Topsin M 70WP 0,4 ậ 0,6 kg/ ha; Score 250ND 0,5 lít/ ha (V Tri u M n, 2007)

1.2 M T S VI KHU N VÙNG R

1.2.1 Khái ni m vùng r

Vùng r lƠ vùng đ t nh h ng đ n r cơy, lƠ n i mƠ ho t đ ng t ng tác gi a vi

sinh v t và cây tr ng di n ra m nh m Nh ng t ng tác nƠy có th nh h ng đáng k

đ n s phát tri n và s n l ng c a cây tr ng Vùng r nuôi d ng m t c ng đ ng đa

d ng nh ng vi sinh v t t ng tác vƠ c nh tranh v i nhau và v i cây tr ng Ho t đ ng

c a m t vài loài này nh h ng đ n s phát tri n và ch c n ng sinh lỦ c a nh ng loài

khác, và có nh ng đ c tính sinh lý, hóa h c có l i cho đ t (Maheshwari, 2010)

1.2.2 M t s ho tăt́nhăḱchăth́chăt ngătr ng cây tr ng c a vi khu n vùng

r

Vi khu n vùng r có th gây nh h ng tr c ti p đ n s phát tri n c a cây tr ng

thông qua vi c c đ nh nit không khí, t ng h p hormon và enzym th c v t, hòa tan

khoáng Ho t đ ng kích thích s phát tri n cây tr ng m t cách gián ti p x y ra khi

PGPR làm gi m ho c ch ng l i tác đ ng có h i c a m t hay nhi u m m b nh b ng vi c

s n xu t các enzym ho c các kháng sinh gi i h n các ion hi u l c c a m m b nh

PGPR c ng có th gây ra s thay đ i c u trúc vách t bƠo vƠ thay đ i đ c tính sinh lý,

sinh hóa nh h ng đ n s t ng h p protein

Trong nh ng n m g n đơy, vi c s d ng vi khu n đ thúc đ y s t ng tr ng th c

v t đang gia t ng m t s khu v c trên th gi i và có t m quan tr ng đ i v i các n c đang phát tri n có s n xu t nguyên li u cho th c ph m PGPR có th nh h ng đ n s

phát tri n c a th c v t b ng cách s n xu t các ch t chuy n hóa th c p, làm gi m ho c

ng n ch n tác đ ng c a n m b nh vùng r , ho c b ng cách t o đi u ki n cho r h p

thu các ch t dinh d ng s n có t môi tr ng (Maheshwari, 2011)

 S n xu tăcácăhormonăt ngătr ng th c v t

M t vƠi giai đo n t ng tr ng và phát tri n c a cây tr ng nh s kéo dài t bào,

s phân chia t bào, s phơn hóa mô, vƠ u th ng n đ c ki m soát b i hormon th c

v t, đ c bi t lƠ auxin vƠ cytokinin C ch sinh t ng h p c a auxin vƠ cytokinin đ c

nghiên c u m t cách r ng rãi Auxin và cytokynin có th đ c t ng h p b i c cây

tr ng và vi sinh v t

M c dù vai trò c a s sinh t ng h p c a hormon th c v t b i vi sinh v t ch a

đ c lý gi i m t cách đ y đ , nh ng theo nhi u nghiên c u thì PGPR có th s n xu t

các hormon th c v t bao g m auxin, cytokinin, và m t l ng nh ethylene

(Maheshwari, 2011)

H u h t các vi khu n có ích nh Rhizobium, Bradyrhizobium, và Azospirillum

t ng h p IAA qua đ ng Indole-3-pyruvic acid (IPyA) M t vài vi khu n gây b nh

nh Pseudomonas syringae, Agrobacterium tumefaciens, và Erwinia herbicola t ng

h p IAA theo đ ngindole-3-acetamide (IAM) (Maheshwari, 2011)

IAA là m t hormon quan tr ng đ c s n xu t b i m t s PGPR, có r t nhi u

nghiên c u đư ch ng minh r ng khi cây tr ng đ c x lý v i IAA do PGPR s n xu t s gia t ng s phát tri n Vi c vi khu n Bacillus RC23, Paenibacillus polymyxa RC05,

B subtilis OSU142, Bacillus RC03, Comamonas acidovorans RC41, B megaterium RC01, B simplex RC19 v i trƠ đư lƠm gia t ng t l r so v i đ i ch ng do vi khu n

có kh n ng sinh IAA (Maheshwari, 2011) M t nghiên c u khác cho th y

Azospirillum không ch có kh n ng c đ nh đ m mà còn có kh n ng s n xu t IAA

Các ch ng Azospirillum đ c nghiên c u cho th y r ng s n ph m IAA ph thu c vào môi tr ng nuôi c y và ti n ch t tryptophan (Lim, 2010)

 Hòa tan phospho

Phospho là ngu n dinh d ng ch y u nh h ng đ n s phát tri n c a cây tr ng

Dù trong đ t r t giƠu phosphate nh ng cơy tr ng h u nh c ng không th s d ng đ c

do m t l ng l n phospho t n t i d i d ng không tan Bao g m các d ng phospho

h u c t n t i trong xác bã th c v t và trong vi sinh v t, phospho vô c th ng là

nh ng phosphate nh phosphate canxi, phosphate s t, phosphate nhôm, th ng d ng

khó tan Các d ng phospho vô c vƠ h u c nƠy, cơy tr ng không th hút tr c ti p

đ c, chúng ph i chuy n hóa thành các d ng d tan thì cây tr ng m i h p thu đ c

Vi khu n phân gi i phosphate s ng ph bi n vùng r có th kh c ph c v n đ

trên b ng cách ti t ra các acid h u c vƠ enzym phosphatase chuy n phosphate không

tan thành phosphate hòa tan (ion monobasic vƠ dibasic) đ cây tr ng có th s d ng

Vi sinh v t hòa tan lân h u c ch y u g m Bacillus và Pseudomonas áng chú

ý là B megaterium var phosphatsum có kh n ng hòa tan lơn h uc cao,đ ng th i B

megaterium còn có kh n ng hình thƠnh bƠo t nên s cs ng r t m nh

Phân gi i xác đ ng v t, th c v t acid nucleic, nucleotid, phospholipid, s n ph m

phân gi i cu i cùng là H3PO4 Quá trình phân gi i c n s tham gia c a nhi u nhóm VSV thu c các gi ng Bacillus và Pseudomonas

Nhi u vi khu n hòa tan lơn vô c nh Bacillus megaterium, Bacillus mycoides,

Bacillus butyricus, Pseudomonas fluorescens, có kh n ng phơn gi i Ca3(PO4)2 và b t

apatit C ch quá trình phân gi i Ca3(PO4)2 có liên quan m t thi t đ n s s n sinh acid

trong quá trình s ng c a VSV Tác d ng v i m t trong b n lo i acid: H3PO4, H2CO3, HNO3, H2SO4, trong đó H2CO3 r t quan tr ng Chính H2CO3đư lƠm cho Ca3(PO4 )2

phân gi i (B c Lan Ph ng, 2004)

C đ nhăđ m

Nit lƠ ngu n dinh d ng thi t y u cho s sinh tr ng và phát tri n c a cây

tr ng Trong không khí nit chi m kho ng 78,16% th tích, m c dù v y cây tr ng

không th s d ng tr c ti p ngu n nit nƠy S kh khí nit c a khí quy n đ c g i là

s c đ nh nit hay c đ nh đ m S c đ nh đ m th ng g p các vi khu n s ng t

do, các vi khu n c ng sinh v i th c v t và vi khu n lam

Trong hai th p niên v a qua, vi c s d ng PGPR đư gia t ng nhi u n i trên th

gi i Gia t ng vi c s d ng PGPR làm phân bón sinh h c là vi c làm c n thi t đ gi m

nh ng tác đ ng có h i đ n môi tr ng c a phân bón hóa h c Các vi sinh v t vùng r

có kh n ng c đ nh đ m th ng đ c s d ng cho các cây tr ng nh c c i đ ng,

mía, lúa, b p, và lúa mì (Maheshwari, 2011)

C đ nh đ m sinh h c là quá trình kh N2 thành NH3 d i s xúc tác c a h enzyme nitrogenase Sau đó, NH3 có th k t h p v i các acid h u c đ t o thành

protein Trong không khí, N2 d ng r t b n và s l ng r t phong phú, chi m 78,16%

theo th tích và 75,5% theo kh i l ng Cây tr ng c ng nh các loƠi đ ng v t vƠ ng i

không có kh n ng đ ng hóa tr c ti p ngu n N2 t do t không khí Quá trình c đ nh

đ m x y ra trong t bào vi khu n và vi khu n lam đ u gi ng nhau là nh chúng có h

th ng gen nif (ni là ch vi t t t c a nitrogen-nit vƠf lƠ fixing-c đ nh) đi u khi n quá

trình t ng h p enzyme nitrogenase Nitrogenase là h enzyme xúc tác cho ph n ng

kh N2 thành NH3 Nh v y, h th ng gen nif đ c xem là h th ng gen đi u khi n cho

quá trình c đ nh đ m sinh h c

Ngày nay nhi u nhà nghiên c u khoa h c đư ch ng minh NH3 v a là s n ph m

c a quá trình c đ nh nit phơn t v a là nhân t đi u hoà ho t tính c a enzyme

nitrogenase Khi NH3 tích l y đ n m t n ng đ nh t đ nh thì nó lƠm đình ch t c kh c

ho t đ ng c a nitrogenase Ki u đi u hoƠ nh v y g i lƠ “ i u hoà liên h ng c”

Tuy nhiên NH3 không tham gia đi u hoà tr c ti p mà thông qua m t protein khác là enzyme glutamin synthetase Khi môi tr ng có nhi u NH3 thì enzyme này b adenin hoá nên tr ng thái b t ho t Ng c l i môi tr ng v i n ng đ NH3 th p ho c không

có thì không b adenin hoá và enzyme s d ng ho t đ ng Khi tr ng thái ho t đ ng

nó s ho t hóa h gen ch u trách nhi m t ng h p nitrogenase (B ch Lan Ph ng,

2010)

 S n xu t các h p ch t kháng n m gây b nh trên cây tr ng

Trên th gi i, các lo i n m nh : Colletotrichum sp., Rhizoctonia solani, Pythium,

Rhizopus, Fusarium đư vƠ đang gơy thi t h i nghiêm tr ng đ i v i n ng su t c a nhi u

lo i cây tr ng nh lúa, ngô, khoai tơy, l c, đ u đ , cà chua, t, c i b p, xà lách, N m

gây ra các tri u ch ng đen th i r , th i thân g c, khô v n, th i lá N m gây b nh làm

gi m s l ng và hi u qu kinh t nông nghi p nhi u khu v c trên th gi i Nh ng

cây tr ng đ i kháng, th c hi n luân canh và các bi n pháp hóa h c đ u đư đ c áp

d ng đ ki m soát n m b nh cây tr ng Tuy nhiên các cây tr ng đ i kháng b nh không

có hi u l c, và vi c luân canh cây tr ng th ng không có hi u qu kinh t ho c không

kh thi H n n a các lo i thu c hóa h c kháng n m có hi u l c th ng r t đ tc ti n và

có nh h ng x u đ n s c kh e con ng i Vi c ki m soát n m b nh m t cách thân

pháp ki m soát sinh h c s d ng các kháng sinh ho c các ch t kháng n m đ tiêu di t

m m b nh trên cây tr ng, chúng có hi u l c cao h n các hóa ch t t ng h p

(Maheshwari, 2011)

Các vi khu n vùng r s ng t do trong đ t có th tr c ti p ho c gián ti p kích

thích s phát tri n r và cây Vi khu n vùng r nh h ng gián ti p đ n s phát tri n

c a cây tr ng thông qua vi c tiêu di t m m b nh qua nhi u c ch khác nhau Bao g m

vi c s n xu t các siderophore ki m hãm các ion làm m t hi u l c c a m m b nh, kh

n ng t ng h p các h p ch t kháng n m nh các kháng sinh, các enzym ly gi i vách t

bào ho c s n xu t các ch t d bay h i nh hydrogen cyanide, chúng c ch s phát

tri n c a m m b nh, kh n ng c nh tranh ch t dinh d ng vƠ n i c trú v i m m b nh

trên r cây Trong s các vi khu n vùng r , Bacillus, Pseudomonas, Burkholderia đư

đ c nghiên c u ph bi n nh m t tác nhân ki m soát sinh h c liên quan đ n vi c s n

xu t các h p ch t kháng khu n (Maheshwari, 2011)

Bacillus cung c p m t vài l i th v kh n ng đ i kháng l i các tác nhân gây b nh

do có kh n ng hình thƠnhs n i bào t và các kháng sinh có ph ho t đ ng khá r ng

Các loài vi khu n Bacillus sinh ra kho ng 167 h p ch t sinh h c có ho t tính ch ng l i

vi khu n, vi n m, protozoa và vi rút ng d ng th ng m i hóa đ u tiên và thành công

nh t trong s các vi khu n vùng r là kháng sinh c a ch ng vi khu n Bacillus subtilis

A13 đ c phân l p t h n 25 n m tr c Australia d a trên ho t đ ng c ch đ n

chín m m b nh đ c ki m tra in vitro, vƠ sau đó đ c kh ng đ nh r ng có kh n ng kích thích t ng tr ng cây tr ng T n m 1990, Bacillus spp đư đ c phát tri n nh

m t tác nhân ki m soát n m b nh trên cây tr ng Vi khu n thu c chi Bacillus có kh

n ng s n xu t kháng sinh nh enzym phơn gi i vách t bào n m: chitinase, cellulase,

amylase, glucanses,…H u h t các kháng sinh lƠ các đo n peptide có kh n ng ch ng

l i vi khu n Gram (-), Gram (+) và n m Vài loài Bacillus s n xu t các đo n peptide vòng nh : iturin, fengycin, bacillopeptin và surfactin Iturin và fengycin có ho t tính

kháng n m m nh và nh h ng đ n s phát tri n c a m t dãy r ng các m m b nh

(Maheshwari, 2011)

Pseudomonas c trú trong đ t, n c và trên b m t cây tr ng Nhi u loài

Pseudomonas s ng h i sinh thân thi n v i cây tr ng, t n d ng dinh d ng r a t b

m t cây tr ng Pseudomonas là m t vi khu n vùng r ph bi n và m t vƠi loƠi c ng

đ c s d ng nh m t tác nhân ki m soát n m Gaeumannomyces graminis var tritici,

Rhizoctonia solani, Erwinia carotovora var carotovora, Pythium ultimum, và Fusarium oxysporum.Chúng c ch n m b nh thông qua m t s ho t đông nh s n

xu t các kháng sinh, các ch t kìm hãm ion, các enzym phân gi i, các ch t ho t đ ng b

m t và c nh tranh dinh d ng v i m m b nh Pseudomonas có m t kh n ng đ c bi t

là s n xu t các h p ch t có ph ho t đ ng r ng bao g m các kháng sinh: pyrrolnitrin,

pyoluteorin (Plt), h p ch t phenazine vƠ chitinase lƠ đ c t đ i v i m m b nh cây

tr ng Các protein kháng n m nh chitinase có th t n công nhi u nhóm n m và vi

khu n Nh ng enzym ly gi i vi khu n nƠy đ c s d ng r ng rãi cho vi c qu n lý d ch

b nh trên cây tr ng Nh ng enzym này th y phân chitin hi n di n trong thành t bào,

Hình thành bào t ch u nhi t, ch có m t bào t trong m t t bào N i bào t hình

tr , ovan, tròn, th nh tho ng có hình b u d c S hình thành bào t không b ng n c n

b i ti p xúc v i không khí Tùy theo loài, bào t có th n m gi a, g n cu i ho c

cu i và túi bào t ph ng ho c không ph ng

Ph n l n vi khu n có v nh y là polysaccharide, m t s ít là glycopeptide Vi khu n có v nh y là polysaccharide khi phát tri n trên môi tr ng dinh d ng đ c

th ng t o thành khu n l c t, bóng nh n g i là khu n l c S (Smoth) Vi khu n có v

nh y là glycopeptide t o khu n l c khô xù xì R (Rough) V nh y có tác d ng giúp vi khu n ch ng l i các đi u ki n b t l i c a môi tr ng

a s các loài Bacillus là sinh v t hóa d d ng linh ho t, có kh n ng hô h p

trong khi s d ng nhi u h p ch t h u c đ n gi n (đ ng, amino acid, acid h u c )

Trong m t s tr ng h p, chúng còn có th lên men carbohydrate trong m t ph n ng

h n h p t o ra glycerol và butanediol

Vi khu n Bacillus có kh n ng ch u đ ng và t n t i trong m t th i gian dài trong

đi u ki n b t l i, nên đa s chúng r t ph bi n và có th phân l p đ c t nhi u ngu n Trong đ t, vi khu n Bacillus ch đ ng trao đ i ch t khi có s n các c ch t thích h p

cho s t ng tr ng c a nó, và nó t o bào t khi ngu n dinh d ng c n ki t ơy c ng

là chi n l c sinh t n c a vi sinh v t s ng trong môi tr ng đ t Vì đa s các loài

Bacillus có th phân gi i hi u qu các lo i cao phân t sinh h c (proteins, tinh b t,

pectin ), nên chúng đóng m t vai trò quan tr ng trong vòng tu n hoàn sinh h c c a

carbon và nit

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN C U VI KHU N VÙNG R HI N NAY 1.3.1 Tình hình nghiên c u trên th gi i

Trong nh ng th p niên g n đơy, các nghiên c u v vi sinh v t ng d ng trong

nông nghi p ngày càng nhi u V i m c đích ph c v cho n n nông nghi p ngày càng

t t h n, các d ng ch ph m vi sinh v t d a trên n n t ng nghiên c u v đ c tính c a

các vi sinh v t đ c l a ch n i t ng vi khu n đang đ c quan tâm và nghiên c u

ng d ng cho nông nghi p nhi u nh t là các vi khu n vùng r , mà n i b t là Bacillus, Pseudomonas, Azotobacter

Có r t nhi u các nghiên c u v vi c sàng l c các vi khu n có kh n ng hòa tan

phospho, c đ nh nit không khí, kháng n m, và sinh hormon t ng tr ng th c v t IAA

đư đ c th c hi n, có th k đ n m t s nghiên c u nh sau:

M t báo cáo nghiên c u c a Ahmad (2006) đư phơn l p đ c các ch ng vi khu n

Azotobacter, Bacillus, Pseudomonas, và Mesorhizopium, kh n ng sinh IAA,

siderophore, kh n ng hòa tan phosphate, vƠ kháng n m Nghiên c u đư thu đ c

nh ng k t qu nh t đ nh a s các vi khu n Bacillus phân l p đ c có kh n ng sinh

s n ph m NH3, t l các ch ng Bacillus và Azotobacter có kh n ng hòa tan phosphate cao h n vi khu n Pseudomonas và Mesorhizopium

Karnwal (2009) phân l p đ c 30 ch ng Pseudomonas fluorescent t nh ng vùng

r c a nh ng lo i cây khác nhau Hai ch ng AK1 và AK2 cho k t qu kích thích cây

tr ng t t nh t Các ch ng nƠy đ c ki m tra kh n ng s n xu t IAA trên môi tr ng

v ng m t ho c có m t tryptophan có n ng đ 50, 100, 200, 500 µg/ mL i v i hai

ch ng trên, s n ph m IAA t ng lên theo s gia t ng n ng đ tryptophan (theo th t là

0,5, 1,2, 4,3 vƠ 9,3 g/ mL; vƠ 0,2, 0,7, 3,8, vƠ 8,3 g/ mL)

Ahmad (2005) phân l p đ c 21 ch ng vi khu n t nh ng vùng r cây khác nhau

thành ph Aligarh Nh ng ch ng nƠy đ c ki m tra kh n ng sinh IAA khi b sung

vƠo môi tr ng nuôi c y 0, 1, 2, và 5 mg/ mL tryptophan i v i vi khu n Azotobacter, khi không b sung tryptophan, l ng IAA sinh ra th p (2,68- 10,8 mg/ mL) Sáu ch ng Azotobacter sinh ra l ng IAA cao (7,3-32,8 mg/ mL) khi b sung 5

mg/ mL tryptophan vƠo môi tr ng nuôi c y vi khu n Trong khi đó khi b sung 1 và 2

mg/m L s n ph m IAA n m trong kho ng 1,47-11,88 và 5,99-24,8 mg/ mL i v i vi

khu n Pseudomonas fluorescent, s n ph m IAA t ng lên khi b sung tryptophan t ng

t 1-5 mg/ mL Khi có s hi n di n c a tryptophan, 5 ch ng Pseudomonas s n xu t IAA v i m c cao 41,0-53,2 mg/ mL

Gong và cs (2006) phân l p ch ng Bacillus subtilis PY-1 t cây bông v i Khi

kh o sát kh n ng kháng n m, nh n th y r ng PY-1 là m t ch ng có kh n ng đ i

kháng m nh v i nhi u lo i n m gây b nh trong đi u ki n phòng thí nghi m Kháng sinh đ c s n xu t b i ch ng này là m t kháng sinh b n v ng trong đi u ki n trung

tính, không d b h ng nhi t đ cao N m h p ch t kháng n m đ c phân l p b ng s

k t t a c a acid, kh n ng chi t tách c a methanol, kh n ng l c gel và s c kỦ đ o

ng c HPLC N m h p ch t kháng n m nƠy đ c ch ng minh lƠ đ ng phân c a iturin

A: A2, A3, A4, A6 và A7

Mariana (2009) phân l p ch ng Bacillus sp E164 và th kh n ng kháng n m

Bipolarissorokiniana trên môi tr ng Sabouraud maltose Sau đó tác gi ti n hành th

nghi m in vivo trên h t lúa mì

Ramirez và cs (2004) th nghi m ho t tính kháng n m c a enzyme chitinase c a

ch ng Bacillus thuringiensis lên n m b nh trên h t đ u nành Khi h t đ u nành b

nhi m v i Sclerotium rolfsii S n y m m gi m t 93% xu ng còn 25% Vi c thêm vào

chitinase (0.8 U/mg protein) lƠm t ng t l n y m m lên 90% Nh v y enzyme

chitinase c a B thuringiensis có th góp ph n vào kh n ng kháng n m Sclerotium

rolfsii và các n m khác trong h t đ u nành khu v c đ c nghiên c u

Nghiên c u c a Leon và Pucheu (2009) phân l p và tuy n ch n vi khu n Pseudomonas và Bacillus có kh n ng ki m soát hi u qu n m gây b nh trên cơy đ u

nành Sau khi phân l p, nh n di n và th ho t tính , k t qu thu đ c hai ch ng vi

khu n có ho t tính m nh là Pseudomonas fluorescens BNM296 và Bacillus amyloliquefaciens BNM340, chúng đ c l a ch n đ th nghi m kh n ng b o v cây

b b nh th i g c do Pythium ultimum gây ra, k t qu là hai vi khu n nƠy lƠm gia t ng

s n y m m c a h t khi h t v i vi khu n

Tr c nhu c u th c t lƠ t ng n ng su t cây tr ng, đ ng th i t ng c ng b o v

cây tr ng tr c s t n công c a các loài n m h i gây b nh, các nghiên c u đư đi sơu

vào vi c tìm ra các ch ng vi khu n có các kh n ng kích thích s phát tri n c a cây

tr ng b ng kh n ng sinh ra các hormon t ng tr ng ho c sinh ra các h p ch t có kh

n ng phơn gi i các ngu n khoáng khó tan thành các khoáng tan mà cây có th s d ng

đ c

c bi t: nghiên c u c a Datta và cs (2011) cho th y kh n ng kích thích t ng

tr ng c a PGPR trên cây t trong đi u ki n th c nghi m trên đ ng ru ng 15 ch ng vi

khu n phân l p t đ t vùng r trên cây t t i n , tr i qua các giai đo n phân l p, xác đ nh ho t tính K t qu nghiên c u ch n ra ba ch ng cho th c nghi m ti p theo trên đ ng lƠ C2, C25 vƠ C32, trong đó ch ng C2 vƠ C25 sau khi đinh danh sinh hóa vƠ

sinh h c phân t là ch ng Bacillus spp., trong khi C32 đ c đinh danh lƠ Steptromyces

sp

Kanchana vƠ cs (2013), đư phơn l p Azospirillum sp t đ t vùng r cây t và th

ho t tính kích thích Ch ng Azs2 đ c báo cáo có là có kh n ng sinh IAA vƠ c đ nh

đ m m nh nh t v i n ng đ IAA và NH3 l n l t lƠ 38,00 vƠ 16,9 g/ mL

Hai nghiên c u trên đư ch ng minh kh n ng kích thích t ng tr ng c a vi khu n

vùng r cây t, t o đi u ki n cho các nghiên c u ti p theo v nhóm vi khu n này

1.3.2 Tình hình nghiên c u t i Vi t Nam

Trong nh ng n m g n đơy, phơn bón vƠ các ch ph m vi sinh v t ng d ng trong

nông nghi p đư đ c th ng m i hóa khá r ng rưi i u này cho th y s quan tâm c a

các nhà khoa h c Vi t Nam đ n l nh v c nƠy c ng r t l n M t s công trình nghiên

c u đ c bi t đ n

Nguy n Th Ph ng Oanh vƠ cs (2013), đư ti n hành phân l p và tuy n ch n các

dòng vi khu n đ t vùng r lúa có kh n ng c đ nh đ m và t ng h p IAA K t qu thu

đ c 15 dòng vi khu n đ t hƠm l ng c đ nh đ m cao nh t K t qu kh o sát kh

n ng t ng h p IAA trong môi tr ng có b sung L-Tryptophan (100mg/ L) c a 15

dòng vi khu n có kh n ng c đ nh đ m cao nh t cho th y c 15 dòng vi khu n nƠy đ u

Nghiên c u c a Kim Nhung vƠ V ThƠnh Công (2011) kh o sát kh n ng

sinh t ng h p IAA và c đ nh đ m c a vi khu n Gluconacetobacter sp và

Azospirillum sp đ c phân l p t cơy mía đ c th c hi n nh m s n xu t phân bón vi

sinh Trong s 12 dòng vi khu n Azospirillum sp và 14 dòngvi khu n Gluconacetobacter sp đư đ c kh o sát thì có 2 dòng vi khu n A1 và G10 v a có kh

n ng t ng h p IAA v a có kh n ng c đ nh đ m đ t m c cao L ng IAA c a dòng A1 đ t (17,748 g/ mL); G10 (2,710 g/ mL) vƠ l ng đ m A1 đ t (8,098 g/ mL); G10 (8,772 g/ mL)

PH N 2:

2.1 Aă I M VÀ TH I GIAN NGHIÊN C U

tƠi đ c th c hi n trong th i gian t 01/06/2013 ậ 18/05/2014 t i phòng thí

nghi m Công ngh Vi sinh, Tr ng i h c M thành ph H Chí Minh (c s 3)

 Môi tr ng nutrient Broth (NB)

 Môi tr ng Nutrient Agar

 Môi tr ng Minimal Salt

 Dung d ch L-tryptophan

 Môi tr ng Trypticase soya Agar (TSA)

 Môi tr ng Potato Dextrose Agar (PDA)’

 Môi tr ng YEM (Yeast Extract Mannitol)

 Môi tr ng Clark ậLubs

 Môi tr ng k khí (Wilson Blair Agar Base)

 Môi tr ng tinh b t

 Hóa ch t (ph l c 1)

 Nessler’s

 Salkowski R2

 Dung d ch acid Molybdic

 Dung d ch thi c ậacid clohydric g c

 Dung d ch phospho chu n

 TCA 25% (axít tricloroacetic), gi y th oxidase, Kovac’s, Gress A, Gress

B, ậ naphtol 5%,, thu c th catalase H2O2 5%, Nessler’s, Salkowski R2

(FeCl3ậH2SO4), dung d ch axít Molybdic, dung d ch thi c ậaxít clohydric

2.4.1 B trí thí nghi m

D a vào m c tiêu đ tài chúng tôi b trí thí nghi m theo s đ 2.1

Phân l p trên môi

Chú thích: môi tr ng 1 lƠ TSA, môi tr ng 2 là NA

o Thu nh n m u:

M u đ t đ c thu t v n tr ng t c a t nh Ti n Giang và t nh Bình D ng.Ti n

hành l y m u đ t xung quanh vùng r c a cây t b ng cách nh t lên gi l y ph n đ t bám d i r nh ng cây t kh e m nh phát tri n t t M u đ c đ ng trong ng falcon

vô trùng 50 mL

M u t b nh thu th p t ru ng tr ng t b b nh c a t nh Ti n Giang và t nh Bình

D ng Ch n nh ng trái t có bi u hi n b nh đúng nh mêu t M u t b nh đ c cho

vào bao ni-long vô trùng

S đ 2.2: Quy trình l y m u và phân l p

o Ph ng pháp phân l p và làm thu n

- i v i m u đ t vùng r

L y 10 g m u hòa v i 90 mL dung d ch NaCl 0,85 % v i đ pha loãng t c p s 1

đ n c p s 6 Tr i 100 µL m u 3 đ pha loãng cu i lên môi tr ng TSA m i n ng

đ 2 đ a 37oC/ 24-48 gi trong đi u ki n hi u khí (Nguy n c L ng, 2011)

Sau th i gian nuôi c y ch n nh ng khu n l c có hình d ng, màu s c khác nhau

Ti n hành c y ria qua môi tr ng NA đ làm thu n L p đi l p l i b c nƠy đ n khi

khu n l c đ ng đ u v màu s c và hình d ng

- i v i m u phân l p n m b nh

R a s ch mô b nh b ng n c sau đó ti n hành kh trùng b m t m u qua các

b c: r a nhanh mô b nh b ng ethanol 70%, r i nhúng mô b nh vào dung d ch natri

hypochlorite 1% trong ethanol 10% kho ng 1 -5 phút, ti p theo r a l i mô b nh v i

n c c t N u kh trùng b m t đ t yêu c u, c t nh mô b nh 2 x 2 mm sau đó đ t lên môi tr ng PDA nhi t đ 27 ± 2oC trong vài ngày (Burgess và cs, 2009; V V n

nh, 2008)

Ti n hành c y đ n bƠo t ho c c y đ nh s i n m t các t n n m m c lên t l n

phân l p đ u tiên lên môi tr ng PDA cho đ n khi thu đ c nh ng khóm n m có đ

đ ng đ u v hình d ng c ng nh mƠu s c C y gi gi ng trên môi tr ng PDA

2.4.3 Ti năhƠnhăquanăsátăđ i th và vi th

D a vào hình thái khu n, màu s c, kích th c đ nh n bi t các lo i vi sinh v t khác nhau vƠ đ c th ng kê các ch ng phân l p đ c t các m u thí nghi m

Quan sát đ i th : b ng m t th ng, hay dùng kính lúp c m tay nh n xét v kích

th c, màu s c…c a khu n l c vi sinh v t vùng r

Quan sát vi th : nhu m Gram vƠ quan sát d i kính hi n vi v t kính 100X

(Burgess và cs, 2009; Nguy n c L ng và cs, 2011)

Nhu m Gram: nh m xác đ nh hình d ng t bào vi khu n, quan sát cách s p x p,

và phân bi t tính ch t b t màu Gram (ậ) ho c Gram (+) Cách ti n hành

 t tiêu b n đư ph t kính và c đ nh m u lên thanh th y tinh ch U

 Nhu m b ng dung d ch crystal violet trong 1 phút, r a n c, th m khô

 Nhu m l i b ng dung d ch lugol trong 1 phút, r a n c, th m khô

 T y màu b ng c n 96o, kho ng 15-20 giơy (cho đ n khi v a th y m t

Cách 1: l y m t lam kính s ch, trong, đư s y khô Nh 1 gi t lactophenol lên gi a

lam kính Dùng que c y nh n đ u l y m t ph n khóm n m m c trên đ a th ch môi

tr ng PDA (c ph n m c trên vƠ d i m t th ch) đ vào gi t dung d ch lactophenol

Dùng kim có cán hay que c y nh n dìm n m vào gi t dung d ch lactophenol đ th m

t Khi n m b th m t hoƠn toƠn thì đ y lá kính lên trên và ép nh

L u Ủ:

Khi đ y lá kính đ ng đ có b t khí, n u có s g p khó kh n trong khi soi kính

Khi ép nh lá kính, nên dùng gi y th m b t dung d ch lactophenol th a đ dung

d ch không tràn lên trên m t lá kính

Ph ng pháp nƠy dùng trong tr ng h p c n quan sát ngay các m u n m m c

Cách 2: l y m t lam kính s ch, trong, đư s y khô C t m t khung gi y l c hình

vuông c nh 2 cm vƠ có đ dày c a c nh khung lƠ 0,3 cm t khung gi y lên gi a lam

kính r i b m d ch môi tr ng PDA bán l ng (c 10 µL) lên lam kính vào gi a khung

gi y Ti p đ n c y n m lên trên môi tr ng v a m i b m vƠo (c y đ n bƠo t hay c y

đ nh s i n m) y lamen lên vƠ đ t lên thanh ch U trong bu ng m ( đơy s d ng

đ a petri bên trong có ch a bông gòn t bên trên có đ t thanh ch U b ng th y tinh)

trong 2 ngày, l y lam kính ra b khung gi y l c, ti n hành nhu m b ng lactophenol

và quan sát

L u Ủ:

C n chú ý thao tác vô trùng tránh nhi m sinh v t khác làm sai l ch k t qu

Bu ng m vƠ n c c t b m vƠo t o môi tr ng m đư đ c h p kh trùng

121oC trong 20 phút

làm thu n n m m c chúng tôi ti n hƠnh ph ng pháp c y đ n bƠo t :

 B c 1: kh trùng que c y

 B c 2 + 3: t o dung d ch bào t b ng cách dùng que c y l y m t l ng

nh s i n m trên m t th ch có l n bào t ho c l y m t chút bào t t kh i bào t l n c a n m b nh r i cho vào ng nghi m ch a 10mL n c vô

trùng

 B c 4: l c ng nghi m đ phân tán các bào t và ki m tra m t đ bào t

b ng cách quan sát ng nghi m tr c ánh sáng ho c ki m tra m t gi t d ch

bào t d i kính lúp soi n i Tránh t o d ch bào t v i m t đ bào t quá

 B c 9: ki m tra đ a Petri d i kính lúp soi n i v i ngu n sáng phía d i

 B c 10: dùng m t que c y d p c t l y ra m t bào t n y m m và chuy n

sang m t đ a môi tr ng m i (Burgess và cs, 2009)

 Thí nghi m lây b nh nhân t o

 V t li u: trái t (c trái xanh và trái chín) kh e, s ch b nh

 Ti n hành

- t nh ng qu t đư chu n b s n lên khay nh a, phun m

- Hòa d ch bào t n m (đ t m t đ là 106 bào t /mL), sau đó dùng micropipet nh

vài gi t d ch bào t lên qu đ nh gây b nh

- Ph nilon lên trên đ cách li và gi m Theo dõi s bi u hi n tri u ch ng hàng

ngày (Tr n Th Miên, 2008; Ph m ình Quân, 2009)

2.4.4 X ácăđ nh ho tăt́nhăḱchăth́chăt ngătr ng c a vi khu n vùng r

2.4.4.1 Xác đ nh kh n ng sinh Nả3 c a vi khu n

Nguyên t c

Khi cho dung d ch có (NH4+) s k t h p v i thu c th Nessler s t o ra iodur thu ngân ammonium có màu vàng D a vào tính ch t nƠy đ nh n bi t vi khu n c đ nh nit (Nguy n c L ng và cs, 2011)

nh tính kh n ng c đ nh nit phân t

Ti n hƠnh xác đ nh kh n ng c đ nh nit phơn t trên đ a môi tr ng Ashby

Nh ng ch ng vi khu n có kh n ng c đ nh nit phơn t s t ng tr ng trên môi

tr ng vô đ m này (Nguy n c L ng và cs, 2011)

Xác đ nh hàm l ng NH3 sinh ra

L p đ ng chu n: dung d ch g c ammonium oxalate (100µg/ mL) T dung d ch

g c pha loãng thành các n ng đ 0- 100 µg/ mL l p nên đ ng chu n c a dung d ch

N Thi t l p các n ng đ 0, 10,20, 30…….100 µg/ mL trong các ng nghi m đánh s

t 0 ậ 10.Thêm vào 0,2 mL thu c th Nessler L c đ u Thêm n c vƠo đ 5 mL, l c

k đ yên, dung d ch có mƠu vƠng đ m d n theo n ng đ (b ng 2.1) o m t đ quang

b ng quang ph k b c sóng 400 nm (Nguy n c L ng và cs, 2011; Ahmad,