P HN 2: VT LI UăVẨăH NGăHỄ
2.4PH NGăPHỄPăNGHIểNă CU
2.4.1 B trí thí nghi m
S đ 2.1: B trí thí nghi m
2.4.2 Ph ngăpháp l y m u và làm thu n
Ti n hành l y m u và phân l p theo s đ 2.2
Sàng l c vi khu n vùng r có kh n ng
c đ nh đ m, phân gi i lân, sinh IAA và kháng n m
Làm thu n Phân l p trên môi
tr ng TSA X lý m u nh danh M u đ t M u t b nh Phân l p trên môi tr ng PDA X lý m u Làm thu n nh danh vi khu n vùng r có ho t tính cao Th nghi m ho t tính kích thích t ng tr ng trên cây t
Chú thích: môi tr ng 1 lƠ TSA, môi tr ng 2 là NA
o Thu nh n m u:
M u đ t đ c thu t v n tr ng t c a t nh Ti n Giang và tnh Bình D ng.Ti n hành l y m u đ t xung quanh vùng r c a cây t b ng cách nh t lên gi l y ph n đ t
bám d i r nh ng cây t kh e m nh phát tri n t t. M u đ c đ ng trong ng falcon vô trùng 50 mL.
M u t b nh thu th p t ru ng tr ng t b b nh c a t nh Ti n Giang và t nh Bình
D ng. Ch n nh ng trái t có bi u hi n b nh đúng nh mêu t . M u t b nh đ c cho vào bao ni-long vô trùng.
o Ph ng pháp phân l p và làm thu n
- i v i m u đ t vùng r
L y 10 g m u hòa v i 90 mL dung d ch NaCl 0,85 % v i đ pha loãng t c p s 1
đ n c p s 6. Tr i 100 µL m u 3 đ pha loãng cu i lên môi tr ng TSA m i n ng
đ 2 đ a. 37oC/ 24-48 gi trong đi u ki n hi u khí. (Nguy n c L ng, 2011) Sau th i gian nuôi c y ch n nh ng khu n l c có hình d ng, màu s c khác nhau. Ti n hành c y ria qua môi tr ng NA đ làm thu n. L p đi l p l i b c nƠy đ n khi khu n l c đ ng đ u v màu s c và hình d ng.
- i v i m u phân l p n m b nh
R a s ch mô b nh b ng n c sau đó ti n hành kh trùng b m t m u qua các
b c: r a nhanh mô b nh b ng ethanol 70%, r i nhúng mô b nh vào dung d ch natri hypochlorite 1% trong ethanol 10% kho ng 1 -5 phút, ti p theo r a l i mô b nh v i
n c c t. N u kh trùng b m t đ t yêu c u, c t nh mô b nh 2 x 2 mm sau đó đ t lên
môi tr ng PDA nhi t đ 27 ± 2oC trong vài ngày. (Burgess và cs, 2009; V V n
nh, 2008)
Ti n hành c y đ n bƠo t ho c c y đnh s i n m t các t n n m m c lên t l n phân l p đ u tiên lên môi tr ng PDA cho đ n khi thu đ c nh ng khóm n m có đ đ ng đ u v hình d ng c ng nh mƠu s c. C y gi gi ng trên môi tr ng PDA.
2.4.3 Ti năhƠnhăquanăsátăđ i th và vi th
D a vào hình thái khu n, màu s c, kích th c đ nh n bi t các lo i vi sinh v t
khác nhau vƠ đ c th ng kê các ch ng phân l p đ c t các m u thí nghi m.
Quan sát đ i th : b ng m t th ng, hay dùng kính lúp c m tay nh n xét v kích
Quan sát vi th : nhu m Gram vƠ quan sát d i kính hi n vi v t kính 100X. (Burgess và cs, 2009; Nguy n c L ng và cs, 2011) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nhu m Gram: nh m xác đ nh hình d ng t bào vi khu n, quan sát cách s p x p, và phân bi t tính ch t b t màu Gram (ậ) ho c Gram (+). Cách ti n hành.
t tiêu b n đư ph t kính và c đnh m u lên thanh th y tinh ch U.
Nhu m b ng dung d ch crystal violet trong 1 phút, r a n c, th m khô.
Nhu m l i b ng dung d ch lugol trong 1 phút, r a n c, th m khô.
T y màu b ng c n 96o, kho ng 15-20 giơy (cho đ n khi v a th y m t màu), r a n c, th m khô.
Nhu m b sung b ng dung d ch safranin trong 30 giây, r a n c, th m khô.
Quan sát b ng v t kính d u, đ phóng đ i 1.000 l n.
Vi khu n Gram (+) b t màu tím crystal violet, vi khu n Gram (-) b t màu h ng safranin.
Làm tiêu b n n m m c: tùy vƠo đi u ki n th c t chúng tôi ti n hành làm tiêu b n n m m c theo các cách sau.
Cách 1: l y m t lam kính s ch, trong, đư s y khô. Nh 1 gi t lactophenol lên gi a lam kính. Dùng que c y nh n đ u l y m t ph n khóm n m m c trên đ a th ch môi
tr ng PDA (c ph n m c trên vƠ d i m t th ch) đ vào gi t dung d ch lactophenol. Dùng kim có cán hay que c y nh n dìm n m vào gi t dung d ch lactophenol đ th m
t. Khi n m b th m t hoƠn toƠn thì đ y lá kính lên trên và ép nh .
L u Ủ:
Khi ép nh lá kính, nên dùng gi y th m b t dung d ch lactophenol th a đ dung d ch không tràn lên trên m t lá kính.
Ph ng pháp nƠy dùng trong tr ng h p c n quan sát ngay các m u n m m c. Cách 2: l y m t lam kính s ch, trong, đư s y khô. C t m t khung gi y l c hình vuông c nh 2 cm vƠ có đ dày c a c nh khung lƠ 0,3 cm. t khung gi y lên gi a lam kính r i b m d ch môi tr ng PDA bán l ng (c 10 µL) lên lam kính vào gi a khung gi y. Ti p đ n c y n m lên trên môi tr ng v a m i b m vƠo (c y đ n bƠo t hay c y
đnh s i n m). y lamen lên vƠ đ t lên thanh ch U trong bu ng m ( đơy s d ng
đ a petri bên trong có ch a bông gòn t bên trên có đ t thanh ch U b ng th y tinh). trong 2 ngày, l y lam kính ra b khung gi y l c, ti n hành nhu m b ng lactophenol và quan sát.
L u Ủ:
C n chú ý thao tác vô trùng tránh nhi m sinh v t khác làm sai l ch k t qu .
Bu ng m vƠ n c c t b m vƠo t o môi tr ng m đư đ c h p kh trùng 121oC trong 20 phút.
làm thu n n m m c chúng tôi ti n hƠnh ph ng pháp c y đ n bƠo t :
B c 1: kh trùng que c y.
B c 2 + 3: t o dung d ch bào t b ng cách dùng que c y l y m t l ng nh s i n m trên m t th ch có l n bào t ho c l y m t chút bào t t kh i bào t l n c a n m b nh r i cho vào ng nghi m ch a 10mL n c vô trùng.
B c 4: l c ng nghi m đ phân tán các bào t và ki m tra m t đ bào t b ng cách quan sát ng nghi m tr c ánh sáng ho c ki m tra m t gi t d ch
bào t d i kính lúp soi n i. Tránh t o d ch bào t v i m t đ bào t quá cao.
B c 5: làm loãng v i n c vô trùng n u c n.
B c 6: đ d ch bào t vào m t đ a Petri có ch a m t l p m ng môi
tr ng th ch.
B c 7: Rót d ch bào t th a t đ a Petri đi. M t s bào t s n m l i trên m t th ch.
B c 8: đ yên đ a Petri trong kho ng 18 gi cho đ n khi bào t n y bào t , và các ng m m. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
B c 9: ki m tra đ a Petri d i kính lúp soi n i v i ngu n sáng phía d i.
B c 10: dùng m t que c y d p c t l y ra m t bào t n y m m và chuy n sang m t đ a môi tr ng m i. (Burgess và cs, 2009)
Thí nghi m lây b nh nhân t o
V t li u: trái t (c trái xanh và trái chín) kh e, s ch b nh.
Ti n hành
- t nh ng qu t đư chu n b s n lên khay nh a, phun m
- Hòa d ch bào t n m (đ t m t đ là 106 bào t /mL), sau đó dùng micropipet nh
vài gi t d ch bào t lên qu đnh gây b nh.
- Ph nilon lên trên đ cách li và gi m. Theo dõi s bi u hi n tri u ch ng hàng ngày. (Tr n Th Miên, 2008; Ph m ình Quân, 2009)
2.4.4 Xácăđ nh ho tăt́nhăḱchăth́chăt ngătr ng c a vi khu n vùng r 2.4.4.1Xác đnh kh n ng sinh Nả3 c a vi khu n
Khi cho dung d ch có (NH4+) s k t h p v i thu c th Nessler s t o ra iodur thu ngân ammonium có màu vàng. D a vào tính ch t nƠy đ nh n bi t vi khu n c đnh
nit . (Nguy n c L ng và cs, 2011) nh tính kh n ng c đ nh nit phân t
Ti n hƠnh xác đ nh kh n ng c đ nh nit phơn t trên đ a môi tr ng Ashby. Nh ng ch ng vi khu n có kh n ng c đ nh nit phơn t s t ng tr ng trên môi
tr ng vô đ m này. (Nguy n c L ng và cs, 2011)
Xác đ nh hàm l ng NH3 sinh ra
L p đ ng chu n: dung d ch g c ammonium oxalate (100µg/ mL). T dung d ch g c pha loãng thành các n ng đ 0- 100 µg/ mL. l p nên đ ng chu n c a dung d ch N. Thi t l p các n ng đ 0, 10,20, 30…….100 µg/ mL trong các ng nghi m đánh s
t 0 ậ 10.Thêm vào 0,2 mL thu c th Nessler. L c đ u. Thêm n c vƠo đ 5 mL, l c k đ yên, dung d ch có mƠu vƠng đ m d n theo n ng đ (b ng 2.1). o m t đ quang b ng quang ph k b c sóng 400 nm. (Nguy n c L ng và cs, 2011; Ahmad, 2006) B ng 2.1. Xây d ng đ ng chu n NH3 STT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 N ng đ NH4+ (g/ mL) 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dd amonium oxalate(100g/ mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 N c c t (mL) 1 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 Thu c th 0.2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
nessler (mL)
N c b sung
(mL) 3,8 3,8 3,8 3,8 8,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 3,8 Ki m tra kh n ng c đ nh đ m c a các ch ng vi khu n theo s đ 2.3
S đ 2.3: Quy trình đ nh l ng NH3
Cách ti n hành
T ng sinh trên môi tr ng NB.
Sau 24 gi , hút 100 µL c y trên môi tru ng Ashby (200 vòng/phút).
Ly tâm thu d ch n i (6000 vòng/phút, 20 phút).
Hút 2mL d ch n i thêm vào 0,2 mL Nessler.
Pha loãng thành 5 mL.
o OD b c sóng 400 nm, và so v i đ ng chu n. (ph l c 2.1)
2.4.4.2 Xác đnh kh n ng hòa tan lân
Nguyên t c (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Khi c y vi khu n lên môi tr ng ch a h p ch t phospho khó tan là Ca3(PO4)2, vi khu n có kh n ng hòa tan Ca3(PO4)2 s t o ra vòng trong xung quanh khu n l c. (Ahmad, 2006)
nh tính kh n ng hòa tan lân
Ti n hƠnh đ nh l ng hòa tan lơn trên môi tr ng Pikovskaya b ng ph ng pháp
c y đi m. 37oC. c k t qu sau m i 24 gi trong 5-7 ngày. Khu n l c có kh n ng
hòa tan là nh ng khu n l c có vòng phân gi i quanh khu n l c trên môi tr ng Pikovskaya. (Nguy n c L ng và cs, 2011; Ahmad, 2006)
nh l ng kh n ng hòa tan lân
đ nh l ng kh n ng hòa tan phospho chúng ta c n xây d ng đ ng chu n theo b ng 2.2.
B ng 2.2: Xây d ng đ ng chu n phospho Dungd ch Dungd ch
phospho chu n (mL)
Dung d ch acid ậ clo molybdic (mL) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 N c c t (mL) 39 38 37 36 35 34 33 32 31 30 Dung d ch thi c acid-clohydric pha loãng (mL) 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25 0,25
Cách th c hi n: cho vào t ng bình đ nh m c 10 mL l ng dung d ch phospho chu n nh trên t ng ng v i n ng đ 10-100 ppm. B sung 10 mL dung d ch axít ậ
clo molybdic vào. L c đ u, thêm n c c t đ t 40 mL. Nh 0,25 mL dung d ch thi c axít clohydric pha loãng. Thêm n c t i v ch. Tr n đ u dung dch vƠ đo trên máy so
màu b c sóng 600 nm. Xác đnh m t đ quang c a m i dung d ch. Các ch ng có kh n ng hòa tan lơn đ c đ nh l ng theo s đ 2.4
S đ 2.4: Quy trình đ nh l ng phospho D ch khu n
3 x 108 CFU/ mL
o OD
10mL axít-clomolybdic
0,25mL thi c-axít clohyric Thu c th 10 mL 6000 vòng/ phút, 20 phút 7 ngày So đ ng chu n Thu d ch
Nuôi c y trong Pikovskaya
Ly tâm
37oC, l c 200 vòng/phút
24 gi
Ti n hành
D ch khu n 3x108 CFU/ mL
Nuôi c y t ng sinh trong môi tr ng NB, 37oC/ 24 gi .
Lên men thu d ch nuôi c y trong môi tr ng l ng Pikovskaya th tích c y 5%, 37oC/ 7 ngày.
Ly tâm thu d ch n i 6000 vòng/ phút trong 20 phút.
Th v i 10ml thu c th (axít ậclo molybdic, thi c axít clohydric).
o OD b c sóng 600 nmvà so v i đ ng chu n đ xác đ nh hƠm l ng phospho hòa tan. (ph l c 2.2)
2.4.4.3Xácăđ nh kh n ngăhòaătanăIAA (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Nguyên t c
IAA đ c t ng h p t vi khu n, khi tác d ng v i thu c th Salkowski R2 (FeCl3 ậH2SO4) s t o ra ph c h p có màu h ng nh t đ n đ m tùy theo n ng đ IAA. (Glickmann và Dessaux, 1994; Gordon và Weber, 1950)
nh l ng IAA trong d ch nuôi c y vi khu n
Xây d ng đ ng chu n IAA theo b ng 2.3
B ng 2.3: Xây d ng đ ng chu n IAA
STT 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N ng đ IAA 0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 Dung d ch g c
IAA (mL) 0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0
Thu c th FeCl3-H2SO4
(mL)
4 4 4 4 4 4 4 4 4 4 4
ng chu n IAA có hƠm l ng 10 ậ 100 µg/ mL. Sau đó hút l n l t vào các
ng đánh s t 0 ậ 10. Sau đó ti n hành pha loãng n ng đ IAA.Ti p theo hút 1 mL các dung d ch có ch a IAA đư pha loưng cho thêm 4 mL thu c th FeCl3-H2SO4 l c
đ u đ trong t i 15phút (khi mƠu đ t đ đ m t i đa). Ti n hƠnh đo m t đ quang các n ng đ IAA. (Glickmann và Dessaux, 1994)
Các ch ng có kh n ng sinh IAA đ c đ nh l ng theo s đ 2.5
Ti n hành
o Pha loãng d ch khu n ( 3 x 108 CFU/ mL)
o T ng sinh trên môi tr ng NB 30oC ,l c 200 vòng/ phút)
o Nuôi c y trong môi tr ng MS có b sung 5mM c ch t tryptophan, 37oC l c 200 vòng/phút. Tránh ánh sáng.
o Ly tâm (6000 vòng/ phút ,20 phút)
o Thu d ch
o B sung 4 mL thu c th FeCl3ậH2SO4 đ trong t i 15 phút.
o o OD
o So đ ng chu n đ xác đnh n ng đ IAA. (ph l c 2.3)
2.4.4.4Xácăđ nh kh n ngăkhángăn m gây b nh
Chúng tôi ti n hành th kh n ng kháng vi n m b nh c a các ch ng vi khu n vùng r th nghi m b ng ph ng pháp khu ch tán gi ng th ch. (Roy, 2010)
Môiătr ng chu n b
Môi tr ng NB và PDA th nghi m đ c h p vô trùng 121oC trong 20 phút. PDA
đ c đ vƠo đ a petri (đ ng kính 90 mm) v i th tích 20 mL/ đ a. Chu n b d ch vi khu n n i sinh th nghi m.
Chu n b vi khu n đ c c y ria vƠo đ a môi tr ng NA, 24 gi 37oC. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ch n 1 khu n l c đ n, c y t ng sinh vi sinh v t n i sinh vƠo 30 mL môi tr ng NB, 32oC trong 5 ngày. Ti n hƠnh ly tơm môi tr ng nuôi c y 10000 vòng/phút, thu d ch khu n 4oC.
D ch khu n sau ly tâm l c qua màng l c 0,2 µm
Chu n b d ch treo vi n m: n m b nh Colletotrichum sp.
Cho vào ng n m 1 ít n c mu i sinh lý 0,85% có ch a 0,05% Tween 80; Dùng que c y c o nh trên m t khóm n m đ l y bào t .
o OD b c sóng 530 nm đi u ch nh sao cho giá tr OD đ t trong kho ng t 0,08 ậ 0,12 t ng đ ng v i m t đ t bào là 1 x 106 CFU/ mL.
N m đư chu n b c n đ c s d ng trong vòng 15 phút.
Ti n hành th nghi m:
Dùng que bông vô trùng nhúng vào d ch n m đư chu n b , ép que vào thành