Sàng lọc Bacillus và Trichoderma có hoạt tính kích thích tăng trưởng và kiểm soát sinh học nấm Pythium sp. và Fusarium sp. gây bệnh trên cây hồ tiêu

Nó là nguyên nhân chính làm héo r cây ch... Theo Person ex Gray 1801 Trichoderma đ c phân lo i thành: Gi i: Fungi... Theo hai nhà khoa h c Elisa Esposito và Manuela da Silva thì cho r n

BÁO CÁO KHÓA LU N T T NGHI P

Tên đ tài:

SÀNG L C Bacillus VÀ Trichoderma CÓ HO T TÍNH

SINH H C N M Pythium sp VÀ Fusarium sp GÂY

B NH TRÊN CÂY H TIÊU

KHOA CÔNG NGH SINH H C

CHUYÊN NGHÀNH: VI SINH – SINH H C PHÂN T

 tài này đ c th c hi n t i phòng thí nghi m Công Ngh Vi Sinh, khoa Công Ngh Sinh H c, Tr ng i h c M Tp HCM, d i s h ng d n c a Ths Nguy n Thanh Thu n và Ths Nguy n V n Minh

Kính g i đ n hai Th y l i tri ân sâu s c nh t v s quan tâm, t o m i đi u

ki n c ng nh s h ng d n t n tình đ em có th hoàn thành đ tài t t nghi p m t cách t t nh t

Con xin g i l i c m n đ n gia đình đã th ng yêu, quan tâm, ch m sóc,

đ ng viên con giúp con có đ c nh ngày hôm nay

Xin c m n t t c các b n trong phòng thí nghi m Công Ngh Vi Sinh

tr ng i h c M Tp HCM đã nhi t tình và t n tâm giúp đ tôi v m i m t, đ ng viên và chia s bu n vui trong công vi c c bi t, em mu n bày t lòng c m n

đ n ch Võ Ng c Y n Nhi và ch Nguy n Th M Linh đã dành th i gian đ quan tâm, đóng góp nhi u ý ki n quý báu giúp em hoàn thành đ tài này t t h n

Em c ng xin g i l i c m n sâu s c đ n Quý Th y Cô khoa Công Ngh Sinh

H c tr ng i h c M Tp HCM đã truy n đ t cho em ki n th c quý báu làm n n

t ng đ th c hi n đ tài t t nghi p này

Cu i cùng, tôi xin c m n t t c b n bè, nh ng ng i đã luôn bên c nh, ng

h và chia s v i tôi trong công vi c c ng nh trong cu c s ng và em chúc t t c quý Th y Cô, các b n, và t t c m i ng i xung quanh luôn luôn vui v , h nh phúc trong cu c s ng và thành công trong công vi c

Xin chân thành c m n!

Sinh viên: Ph m Th Thiên.

DANH M C HÌNH NH

Hình 1.1 Các d ng bào t n m Pythium sp 11

Hình 1.2 Bào t n m Fusarium sp 14 Hình 1.3 Khu n l c và hình nhu m Gram Bacillus 26

Hình 3.1 Khu n l c Pythium m t tr c và m t sau 45

Hình 3.2 N m Pythium nhu m lactophenel 45

Hình 3.3 Khu n l c Fusarium m t tr c và m t sau 46

Hình 3.4 N m Fusarium nhu m lactophenol 47

Hình 3.5 Khu n l c vi khu n m c trên môi tr ng Ashby 48

Hình 3.6 Khu n l c vi khu n m c trên môi tr ng Pikovskaya 49

Hình 3.7 K t kh th kh n ng sinh IAA c a các ch ng vi khu n 49

Hình 3.8 K t qu đ nh tính kháng n m Pythium c a m t s ch ng Bacillus 50

Hình 3.9 K t qu đ nh tính kháng n m Fusarium c a m t s ch ng Bacillus 51

Hình 3.10 K t qu đ nh tính kháng Pythium c a Trichoderma m t tr c và m t sau 52

Hình 3.11 K t qu kháng n m Fusarium c a Trichoderma m t tr c và m t sau 52

Hình 3.12 K t qu th nghi m k t h p Bacillus và Trichoderma 58

Hình 3.13 K t qu th đ i kháng hai ch ng F33 và BD33 m t tr c và m t sau 59

DANH M C BI U

Bi u đ 3.1 Ph n tr m c ch n m Pythium c a các ch ng Bacillus 55

Bi u đ 3.2 Ph n tr m c ch n m Fusarium c a các ch ng Bacillus 57

B ng 3.4 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng Bacillus sp F33 59

B ng 3.5 K t qu đ nh danh sinh hóa ch ng Bacillus sp BD33 60

DANH M C T VI T

2.1 Th i gian và đ a đi m nghiên c u 28

T V N

H tiêu (Piper nigrum L.) là m t lo i cây có giá tr kinh t cao c a th gi i nói

chung và c a Vi t Nam nói riêng Su t nhi u n m qua, Vi t Nam là n c xu t kh u tiêu s m t th gi i N m 2011 c n c có 53.000 ha, s n l ng đ t 125.000 t n

N m 2012 có 57.500 ha, s n l ng đ t 115.000 t n N m 2013 di n tích t ng lên 60.000 ha, s n l ng c tính đ t 95.000 t n H tiêu ch chi m 2,5 % di n tích trong t ng s g n 5 cây công nghi p n c ta nh ng chi m trên 8 % giá tr xu t

kh u Giá tr kinh t c a h tiêu hi n đ t 6.800 USD/ ha/ n m, cao g p 4 l n cao su,

8 l n h t đi u, 2,6 l n cà phê và g p 6 l n chè Ng i tr ng tiêu có th thu lãi

200-250 tri u/ ha/ n m.[35]

B nh ch t ch m (do Pythium spp, Fusarium ssp….) trên cây h tiêu là m t

trong nh ng b nh r t nguy hi m gây h i cho cây h tiêu, gây m t tr ng ho c gi m

n ng su t tr m tr ng [31] Nhi u lo i thu c hóa h c hi n nay có th ki m soát m t

s b nh quan tr ng do n m gây ra Tuy nhiên, thu c tr sâu hóa h c không ph i là

bi n pháp lâu dài do nh ng m i nguy khi ti p xúc, nh h ng s c kh e, môi tr ng

và kh n ng đ kháng c a n m b nh [23]

Trichoderma đ c xem là tác nhân đ y ti m n ng có kh n ng ki m soát sinh

h c và kích thích t ng tr ng nhi u lo i cây tr ng nh s c nh tranh v i tác nhân gây b nh, sinh ch t kháng n m [25, 28] Bên c nh đó, nhi u ch ng Bacillus đã đ c báo cáo có kh n ng ki m soát sinh h c m t s lo i b nh cây tr ng [22, 29, 30], do

có th s n xu t các h p ch t kháng n m, kháng khu n đa d ng [26], đ ng th i có

h at tính kích thích t ng tr ng cây tr ng (PGR) [12] Trên th gi i đã có m t s

nghiên c u cho th y Trichoderma và Bacillus có kh n ng ki m soát sinh h c m t

s ch ng n m c ng nh kh n ng kích thích t ng tr ng cây tr ng [22, 30]

Xu t phát t nh ng lý do trên chúng tôi th c hi n đ tài: “Sàng l c Bacillus và

Trichoderma có ho t tính kích thích t ng tr ng và ki m soát sinh h c n m

Pythium sp và Fusarium sp gây b nh trên h tiêu”, nh m sàng l c Bacillus và Trichoderma có kh n ng đ i kháng sinh h c v i ch ng n m Pythium sp và Fusarium sp đ ng th i có kh n ng kích thích t ng tr ng cây tr ng

Trong đ tài này, chúng tôi th c hi n các n i dung sau:

- Phân l p n m b nh Pythium sp và n m b nh Fusarium sp

- nh tính các ho t tính kích thích t ng tr ng cây tr ng (c đ nh đ m, hòa

tan lân và sinh IAA) c a b s u t p các ch ng Bacillus đ c cung c p t PTN Công

ngh vi sinh, khoa Công ngh sinh h c, tr ng i H c M , tp H Chí Minh

CH NG 1: T NG QUAN

TÀI LI U

1.1 T ng quan v cây h tiêu

1.1.1 Ngu n g c và l ch s phát tri n

Cây tiêu (Piper nigrum L) thu c h Piperraceae có ngu n g c t Tây nam n

vùng Ghats và Assam, m c hoang trong r ng, đ c ng i n phát hi n,

s d ng đ u tiên và cho r ng vi c phát hi n là r t quý giá n đ u th k th XIII, cây tiêu m i đ c tr ng r ng rãi và s d ng trong b a n hàng ngày Lúc này, cây tiêu đã đ c tr ng c Indonesia và Malaysia n th k th XVIII, cây tiêu đ c

tr ng Sri và Campuchia Vào th k th XX thì cây tiêu đ c tr ng ti p Châu Phi và Châu M n c ta, cây tiêu đ c tr ng t r t lâu tr c khi ng i Pháp đ n xâm chi m Khi nh ng ng i Trung Hoa di dân vào Campuchia d c vùng bi n

v nh Thái Lan nh : Konpong Trach, Campot, Ket và lúc này cây tiêu đ c tr ng

s p x p l n x n nh cây m t lá m m Thân khi già hóa g , thân non d ng th o m c Lá: tiêu thu c lo i lá tròn, hình tim, có lá kèm ho c không, m c cách, lá 5 gân hình lông chim, chi u dài lá t 10 - 25 cm, r ng 5 - 10 cm Hoa: màu vàng h i xanh,

m c chùm, l ng tính, không có bao hoa, hoa đ c đính trên gi hoa dài t 7 - 10

cm, m i gi hoa có t 20 - 60 hoa Qu : qu m ng không có cu ng, ch ch a m t

h t d ng hình c u đ ng kính 4 - 8 mm Qu lúc còn non có màu l c, khi già màu

đ , sau đó bi n thành màu vàng, khi khô có màu đen, nh n nheo N u thu qu còn

t i (ch a chín) ngâm n c chà s đ c m t lo i tiêu s màu tr ng.[3]

1.1.3 Tình hình s n xu t và tiêu th h t tiêu trên th gi i và Vi t Nam

1.1.3.1 Th gi i

N m 1954, toàn th gi i có kho ng 64.000 t n h t tiêu N m 1978 là 160.000

t n h t tiêu N m 1982, s n l ng tiêu trên th gi i gi m d n do sâu b nh và th i

ti t, đ ng th i là m t ph n do ô nhi m môi tr ng gây nh h ng t i s th ph n

c a hoa tiêu N m 1989 - 1990, di n tích tr ng tiêu trên toàn th gi i đã t ng v t và

s n l ng đ t kho ng 185.000 t n tiêu h t Theo th ng kê c a t ch c l ng th c

th gi i FAO, (2000) thì hi n nay trên th gi i có kho ng 70 qu c gia tr ng tiêu

Nh ng n c tr ng tiêu nhi u nh t là n , Indonesia, Vi t Nam M c tiêu th h t tiêu trên th gi i hàng n m đ t kho ng 4 - 5 % Các s n ph m đ c trao đ i d i

d ng: tiêu đen, tiêu tr ng, tiêu xanh và d u nh a tiêu N c M đang đ ng đ u v

nh p tiêu v i kho ng 1/3 l ng tiêu c a th gi i, k đ n là các n c Nga, c, Pháp, Ý và Anh Ngoài ra th tr ng các n c Trung ông và B c Phi c ng đang tiêu th ngày càng nhi u

1.1.3.2 Vi t Nam

 Tình hình s n xu t

Tr c n m 1975: mi n b c, tiêu đ c tr ng ch y u Ngh An, Qu ng Bình và mi n Nam, tiêu đ c tr ng ch y u Phú Qu c, Long Khánh, L c Ninh

N m 1995, di n tích tiêu t ng b c gia t ng song bi n đ ng không n đ nh b i thiên tai, b nh t t T 1990 - 1995 do giá tiêu b gi m m nh và không có th tr ng tiêu th nên các v n tiêu b ph đi r t nhi u T n m 1996 các n c Indonesia, Brazil b nh h ng thiên tai, khu v c ông Nam Á l i b kh ng ho ng tài chính nên giá tiêu gia t ng lên 4.000 USD/t n vào n m 2000, có c h i thu n l i cho h tiêu Vi t Nam v n lên chi m l nh th tr ng h t tiêu th gi i N m 1997 - 1999,

di n tích tiêu t ng t 9.777 lên 15 461 ha Di n tích tiêu t ng nhanh nh t vùng ông Nam B t 5.893 lên 9.115 ha ( chi m 60,27 % di n tích tiêu c a c n c)

N ng su t t ng ch m và có s sai khác r t l n gi a các vùng và t nh tr ng tiêu

N ng su t bình quân n m 1997 là 2,08 t n/ha, đ n n m 1999 c ng ch đ t 2,12

t n/ha nh ng cao nh t vùng ông Nam B đ t 2,55 t n/ha, th p nh t là vùng B c

Trung B ch đ t 0,75 t n/ha ( b ng 29,4 % v i n ng su t c a vùng ông Nam B )

c bi t, t nh Bình Ph c v i di n tích thu ho ch 2.405 ha, n ng su t đ t 3,8 t n/ha (g p 6,9 l n t nh Qu ng Bình) Theo th ng kê n m 1997, s n l ng tiêu tính trên

di n tích cho thu ho ch là 13.007 t n và n m 1999 t ng lên 18.970 t n song th c t

 Tình hình tiêu th

N c ta ch y u s n xu t m t hàng h t tiêu đ u đen, th tr ng tiêu th trong

n c hàng n m ch đ t kho ng 3.500 - 4.000 t n/n m, còn ph n l n l ng tiêu dành cho xu t kh u Theo B Th ng M i (2000), h t tiêu Vi t Nam xu t kh u cho 30

n c trên th gi i C n c xu t kh u t n m 1996 - 1999 là 107.800 t n (bình quân m t n m 26.950 t n), t c đ t ng 12 %/n m Riêng s li u nh p kh u mà c quan ki m d ch t i c ng TP H Chí Minh cho bi t t n m 1996 đ n 20/6/2000 là 110.656 t n c bi t 6 tháng đ u n m 2000, Vi t Nam đã xu t kh u 28.801 t n

Th tr ng tiêu th ch y u c a Vi t Nam (1996 - 6/2000) là các n c: M , Singapore, các n c EU

1.1.4 M t s b nh th ng g p trên tiêu

1.1.4.1 B nh tuy n trùng

ây là b nh th ng th y các v n tiêu Tác nhân gây b nh ch y u là nhóm tuy n trùng n i kí sinh và nhóm tuy n trùng ngo i kí sinh Nhóm tuy n trùng n i kí sinh gây b nh b u r ph bi n là Meloidogyne arenaria và Meloidogyne incognia

Chúng đ c l chui vào r đ s ng, chích hút d ch, cây không hút đ c ch t dinh

d ng, cây khô héo t o thành các b u r Nhóm tuy n trùng ngo i kí sinh chích hút r th ng g p là Pratylenchus Chúng s ng trong đ t, chích r non và hút ch t

dinh d ng, làm cây suy y u t o đi u ki n cho các lo i vi sinh v t khác xâm

nh p.[3]

1.1.4.2 B nh khô đ u ng n th i trái

B nh này do Collectotrichun sp gây ra B nh làm cây ng ng phát tri n, các lá

trên cùng úa vàng, trên lá và trái non xu t hi n nh ng ch m ch m và đ m đen làm cho lá và trái r ng s m Cây b m t s c suy y u.[3]

1.1.4.3 B nh ch t ch m trên cây h tiêu

 Tác nhân gây b nh

- Do n m Fusarium sp., nh ng trong nhi u tr ng h p là s k t h p v i các

n m khác nh Pythium sp., Lasiodiplodia, Rhizoctonia các lo i n m này t n công

vào các r non, các v t th ng c h c do con ng i, đ ng v t, côn trùng gây nên,

đ c bi t là do tuy t trùng làm th i r , g c cây gây hi n t ng ch t ch m trên cây tiêu.[36]

- N m t n t i hàng n m trong đ t, phát sinh, phát tri n trong đ t bón ít phân

h u c , đ t chua, đ t có đ PH th p.[35]

 Tri u ch ng gây h i

- Cây tiêu có bi u hi n sinh tr ng ch m, lá úa vàng Lá, hoa, các đ t và trái

r ng d n t d i g c lên ng n, ch không r ng và héo t đ t xu ng nh b nh ch t nhanh G c, thân cây b nh có các v t nâu đen, d n d n v t b nh lan r ng làm th i

l p v g c, bó m ch làm thân cây hóa nâu Khi b nh n ng, toàn b g c và r cây tiêu b thâm đen, h th i, sau đó cây ch t khô.[35]

- Th i gian t khi có bi u hi n b b nh đ n khi ch t có th kéo dài c n m

- Làm b m ng ng n không cho n c ch y tràn t v n này sang v n khác

- Th ng xuyên v sinh v n b ng cách c t t a toàn b cành t m t đ t lên 25cm, đ b n tiêu luôn luôn đ c thông thoáng C t t a, thu d n toàn b cành lá b

b nh và đ a đi thiêu h y Qu n lý t t vi c t i n c, không đ thi u n c trong mùa n ng và ng p úng trong mùa m a

- T ng c ng bón phân h u c hoai m c nh m kích thích m t s n m đ i kháng v i n m b nh phát tri n

- Xây d ng vành đai cây ch n gió, cây ch u gió và cây che bóng t o môi

tr ng sinh thái t t cho v n tiêu

- X lý tri t đ tuy n trùng b ng NEMA, r p sáp b ng BIO PES ho c BT MES h ng n m

- Bón phân v n tiêu cân đ i, h p lý, đ y đ vi l ng, chú ý bón Ca, Mg

 Bi n pháp Sinh H c: s d ng thu c đ c tr n m Bionano

Thu c Bionano có tác d ng t t đ phòng và tr b nh ch t nhanh, vàng lá th i

r trên cây h tiêu ng th i trong thành ph n c a thu c có ch a hàm l ng d ng

ch t nh : Lân và Kali, giúp t ng kh n ng sinh tr ng, phát tri n c a cây sau khi s

Phun qua lá: dùng Bionao pha 5 lít + 1 lít Sinh Thái Vi t M lo i c a 1954

SX pha vào 1500 lít n c, phun t đ u toàn b thân, lá và g c tiêu

Vi c phòng b nh th c hi n kho ng 3 tháng/l n vào mùa khô và mùa m a 1 tháng/l n

 Tr b nh

- Làm v sinh v n tiêu (cào s ch c rác, cành, lá và dây tiêu ch t trong v n

đ a đi tiêu h y)

- Dùng cu c x i nh đ t xung quanh g c ra đ n tán, sâu t 3 -5cm tùy theo

tr ng sâu hay c n

T i g c: pha 5 lít Bionano + 1 lít Sinh thái Vi t M lo i c a 1954 SX pha vào 1500 lít n c cho 1 g c tiêu 3 -5 lít lít n c t i toàn b vùng r và đo n thân

ti p giáp m t đ t c a g c tiêu (4lít/ g c)

Phun qua lá: song song v i vi c t i g c, chúng ta ti n hành phun trên thân

và lá v i n ng đ sau: pha 5 lít Bi Onano + 1 lít Sinh thái Vi t M lo i c a 1954 SX pha vào 1500 lít n c, phun t đ u toàn b thân, lá và g c tiêu Phun đ u toàn b thân và lá (Phun k đo n thân t m t đ t đ n ng n)

Vi c t i g c và phun qua lá ph i ti n hành 3 l n m i l n cách nhau 10 ngày Sau khi tr l n 3 kho ng 15 ngày ti n hành ch m sóc v n tiêu nh bình

th ng

1.2 T ng quan v Pythium sp và Fusarium sp

1.2.1.T ng quan v Pythium sp

 c đi m c a Pythium

Pythium thu c l p n m tr ng, n m 1968, Waterllouse cho r ng, đây là gi ng

l n nh t c a h Pythiaceae đ c đ i di n b i 92 loài nh ng theo Waterhouse (1973) cho r ng nhi u loài ch hi n di n trong môi tr ng n c nh nh ng th c v t

ho i sinh trong khi đó m t s có th s ng ký sinh y u trên th c v t hay đ ng v t

s ng trong n c, ph n l n loài n m này s ng trong đ t, m t vài loài liên quan n m

r , Pythium là nh ng loài hi m có v t ch đ c hi u.[8, 9]

Pythium gây ra m t s b nh nghiêm tr ng nh ng cây gi ng con, nh b

ng p úng, th i r , th i cành hoa cây con

N m l980, Webster cho r ng Pythium hi n di n thông th ng trong đ t canh tác h n là đ t t nhiên nh t là cây con trong v n m mát hay v n rau

 C u trúc dinh d ng

H s i khu n ty phát tri n t t và g m khu n ty m n, phân nhánh t t, và không t o giác bào nào; Alexopoulos và Mims (1979) cho r ng vách khu n ty g m cellulose, v t ch t bên trong t bào ch t là d ng h t và ch a nh ng gi t d u nh và glycogen, nh ng ph n c h n c a h s i ch a t bào ch t có h c nh , nh ng khu n

ty còn non là c ng bào nh ng nh ng vách chéo phát tri n trong khu n ty tr ng thành Ty th , th l i, m ng l i n i ch t và các ribosome c ng đ c th y d i kính hi n vi đi n t [7,8]

Hình 1.1 Các d ng bào t c a n m Pythium sp

 Sinh s n vô tính

Pythium sinh s n vô tính b ng túi bào t và chúng có th chót hay xen gi a

và có nh trong su t, t i th i đi m phát tri n c a túi bào t , ph n xen gi a hay chót c a khu n ty phình to ra, tr thành hình c u và kh i đ u ch c n ng nh túi bào

t đ u tiên; nh ng bào t đ ng m i đ c thành l p ti p t c di chuy n r t nhanh bên trong túi, s di chuy n này ti p t c trong m t vài phút Vách c a túi v ra nhanh

nh b t khí xà phòng và các bào t đ ng đ c phóng thích theo m i h ng

Nh ng bào t đ ng có hình qu th n và là nh ng th hai tiên mao và đ c g n

m t bên c a chúng Sau m t s l n, nh ng bào t đ ng b m t tiên mao và đ c

bao vào nang và m i bào t đ ng trong s chúng n y ch i b ng m t ng phôi trong khu n ty dinh d ng m i và khu n ty m i này nhi m vào h t gi ng

Tuy nhiên, P aphanidernatium, m t ng dài phát tri n t túi bào t và t

bào ch t c a túi bào t di chuy n vào trong túi, đ t bào ch t tr c vào trong tình

tr ng tr ng, s phân c t t bào ch t trong nh ng ph n đ n nhân b t đ u trong túi bào t nh ng hoàn t t trong túi Tiên mao b t đ u phát tri n trong túi; túi b v d n

đ n phóng thích nh ng bào t đ ng; Nh ng bào t đ ng l n l n r ng tiên mao và hình thành nang hay bào t nang M i bào t đ ng n y ch i b ng m t ng phôi nh

P.debaryanum, trong m t s loài Pythium, khu n ty xen gi a có nh ng bào t

hình c u, vách dày đ c g i là bào t vách d y, chúng n y ch i b ng cách t o

khu n ty hình ng dài.[8, 9]

 S ti n hóa c a bào t

Pythium có nh ng loài t o túi bào t và t o bào t , cho th y chúng có s

chuy n ti p rõ ràng đ hình thành túi bào t và ch a bào t bên trong d nhiên s không t o bào t đ ng.[8, 9]

 Sinh s n h u tính

Sinh s n h u tính là s noãn giao, và x y ra khi đ m không đ cho sinh

tr ng thông th ng, hai c quan sinh d c đ c g i là túi giao t đ c (hay hùng c )

và túi noãn (hay noãn phòng) và thông th ng phát tri n r t g n trên cùng khu n ty;

Ph n l n các loài là đ ng giao, th ng thì hùng c phát tri n d i noãn phòng N m

1973, Pratt và Green cho r ng m t s loài là d giao nh P heterothallicum và P sylvaticum, đôi khi trong nuôi c y nh ng d ng d giao, nh ng d ng đ ng giao c ng phát tri n

Theo Drechsler (1960), noãn phòng P.debaryanum thông th ng phát tri n

t i chóp c a nhánh khu n ty, nh ng đôi khi nó c ng xen gi a, noãn phòng có

d ng hình c u, vách tr n láng nh ng P mamilatum, vách noãn phòng v n g p

khúc trong nh ng n i nhô ra dài

 Th tinh

Pythium là m t ví d đi n hình c a s ti p h p giao t , hùng c đ c g n vào vách c a noãn phòng và tr nên b ng ph ng, t m i hùng c phát tri n m t ng th tinh m n, ng này thâm nh p vào vách túi noãn và chu ch t, ti p xúc v i tr ng S

gi m phân x y ra trong hùng c c ng nh trong noãn phòng trong th i gian trung bình, và t t c các nhân đ n b i Thông qua ng th tinh, nhân đ c ch c n ng đi vào trong noãn c u, ti p xúc v i nhân cái ch c n ng và ti p h p v i nhau, t o thành nhân h p t nh b i, noãn c u đ n b i thay đ i thành bào t noãn nh b i có c u trúc vách dày, tr n, đ n nhân.[8, 9]

 S m c m m c a bào t noãn

P debaryanum và nhi u loài khác, các bào t noãn c n th i gian ti m sinh

nhi u tu n tr c khi m c m m, nhiêt đ t ng đ i cao kho ng 28o

C, bào t noãn

n y ch i b ng cách t o ra m t ng phôi phát tri n nhanh thành m t h s i sinh

d ng nh ng nhi t đ th p h n (10 – 17o

C) m t ng phôi ng n (5 –20 µm) đ c

đ a ra ngòi chóp c a bào t noãn và phát tri n thành túi Theo Drechsler (1952 –

1960) cho r ng v t li u c a bào t noãn P ultimum đi vào túi này thông qua ng

nh và đ c khu bi t thành nhi u bào t đ ng; Webster (l980) đã đ c p lo i th ba, trong đó bào t noãn m t s loài phát tri n m t ng phôi ng n ch a túi bào t

t i chóp c a nó Nh đã đ c p trên, chu trình s ng ch ra r ng h s i sinh d ng

Pythium là nh b i và s phân chia gi m đi, x y ra trong hai lo i giao t

 Nh ng b nh khác do gi ng Pythium gây ra

Th i trái b u, bí: Cùng v i Fusarium và Phytopthora, n m Pythium gây ra

b nh trên c a b u, d a chu t, d a h u… làm do r b m m đi do n c ng m vô quá nhi u

Th i trái hay th i cu ng đu đ : n m Pythium s làm cu ng trái đu đ th i r a; tri u ch ng chính c a nó là xu t hi n nh ng ph n x p, ng m n c trên cu ng tr c

ti p t i l p đ t Ph n đáy c a cu ng b bóc ra do th i r a và xâm nhi m và có th

d n đ n cây ngã toàn b ; Th i cu ng có th đ c ki m soát b ng cách cho cây sinh

tr ng trong đ t đã rút h t n c, nh ng cây b nhi m ph i đ c lo i b và đ t; Phun h n h p Bordeaux s có hi u qu nh t đ nh

Th i thân r c g ng: Th i thân r c g ng là do Pythium myriotylum, P aphanidermatum Ph n đáy c a cây tr nên b s ng n c, m m và lá có màu vàng

l t, cu i cùng thân r b t đ u th i và thay đ i kh i th t bên trong; Nó có th đ c

ki m soát b ng cách x lý thân, r và đ t b ng thu c hoá h c có g c đ ng di t n m, nên ch n nh ng h t gi ng kho m nh là m t trong nh ng bi n pháp có hi u qu đ phòng b nh

1.2.2 T ng quan v Fusarium sp

 c đi m c a Fusarium

Fusarium là chi l n nh t trong Tuberculariaceae, chúng ho i sinh ho c ký sinh

trên nhi u cây tr ng, cây n trái và rau Nó là nguyên nhân chính làm héo r cây

ch

H s i n m lan to kh p mô m ch và l p kín m ch g S l p m ch g s c n

tr quá trình chuy n v n n c làm héo cây, Fusarium có h s i n m phân nhánh, có

vách ng n, s i n m th ng không màu, chuy n màu nâu khi già H s i n m s n sinh đ c t ti t vào h m ch d n cây ch gây héo r , nhi u loài th c v t b

Fusarium t n công.[7, 8, 9]

Hình 1.2 Bào t n m Fusarium sp

 Sinh s n

Fusarium sinh s n vô tính trung bình gi a 3 ki u bào t vô tính là bào t đính

l n, bào t đính nh và bào t vách dày [7, 8, 9]

 Bào t đính l n dài, nhi u nhân, hình li m ho c thân cong, sinh ra t cu ng bào t

u và cu i bào t l n thuôn nh n; m t vài loài bào t l n tách r i và không

g n trên cu ng bào t , nh ng t bào sinh bào t l n g i là th bình

 Ti u bào t đính th ng đ n nhân đôi khi 2 ng n, hình c u ho c hình tr ng

đ c sinh ra t m t th bình hay nh ng cu ng bào t phân nhánh ho c không phân nhánh; ti u bào t đính th ng đ c gi trong m t nhóm nh và r t gi ng bào t

c a Cephalosporium vì th giai đo n này th ng đ c quy vào n m Cephalosporium

 Bào t vách d y hình tròn ho c hình tr ng, vách dày, n m t n cùng ho c chen gi a các s i n m gi Chúng có th phát tri n đ n ho c thành chu i, chúng tách ra và m c các ng m m n u bào t g p đi u ki n thu n l i, h u bào t hay bào

t vách d y r t b n và t n t i đ c l p trong th i gian dài

 M t vài loài Fusarium gây b nh héo lá trên các cây ch

 F udum gây b nh trên đ u s n Cajanus cajan

 F.oxysporum bv licopersici gây b nh trên cà chua Lycospersicon esculentum

 F.lini gây b nh trên cây lanh Linum usitatissimum

 F.solani gây b nh trên khoai tây Solanum tuberosum

 F orthaceras gây b nh trên đ u m -đ u Th Nh K Cicer arietium

 B nh th i r trên đ u ph ng

 B nh ch t ch m tiêu

1.3 N m đ i kháng Trichoderma

1.3.1 V trí, phân lo i

Trichoderma là m t trong nh ng nhóm vi n m gây nhi u khó kh n cho công

tác phân lo i do còn nhi u đ c đi m c n thi t cho vi c phân lo i v n còn ch a đ c

bi t đ y đ [8, 33]

Theo Person ex Gray (1801) Trichoderma đ c phân lo i thành:

Gi i: Fungi

Theo hai nhà khoa h c Elisa Esposito và Manuela da Silva thì cho r ng

Trichoderma spp thu c h Hypocreaceae, l p N m túi Ascomycetes; các loài Trichoderma đ c phân thành 5 nhóm: Trichoderma, Longibrachiatum, Saturisporum, Pachybasium và Hypocreanum

Nguy n Lân D ng và m t s nhà khoa h c khác l i cho r ng gi ng

Trichoderma thu c l p Deuteromycetes, B Moniliales, h Moniliaceae

V Tri u M n và Lê L ng T (1998) l i cho r ng Trichoderma thu c ngành

n m Mycota, l p n m b t toàn Deuteromycetes, b n m Moniliales, h

Moniliaceae, chi Trichoderma

Kubicek và Harman (1998) đã mô t chi ti t 33 loài Trichoderma, ông cho

r ng tùy t ng loài n m mà chúng có hình d ng và kích th c khác nhau

1.3.2 c đi m hình thái

H u h t các gi ng Trichoderma không có giai đo n sinh s n h u tính (ch

m t vài gi ng sinh s n h u tính), chúng sinh s n vô tính b ng bào t đính t khu n

ty [33]

Khu n ty c a vi n m không màu, cu ng sinh bào t phân nhánh nhi u, cu i nhánh phát tri n thành m t kh i tròn mang các bào t tr n không có vách ng n, không màu, liên k t nhau thành chùm nh đ u cành nh ch t nh y Bào t hình

c u, hình elip ho c hình thuôn Khu n l c n m có màu tr ng ho c t l c tr ng đ n

l c, vàng xanh, l c x n đ n l c đ m Các ch ng Trichoderma có t c đ phát tri n

nhanh, chúng cò th đ t đ ng kính khu n l c t 2 – 9 cm sau 4 ngày nuôi c y

25oC [33]

1.3.3 c đi m sinh lý, sinh hóa

Trichoderma là nhóm vi n m ph bi n đ t nông nghi p, đ ng c , r ng,

Trichoderma viride có m t vùng khí h u l nh, trong khi Trichoderma harzianum

có các vùng khí h u nóng i u này t ng quan v i nhu c u nhi t đ t i đa cho

t ng loài

Các loài Trichoderma th ng xu t hi n đ t acid, theo Gochenaur (1970) cho

r ng có th t ng quan gi a s hi n di n c a T.viride v i đ t acid trong vùng khí

h u r t l nh Peru, Trichoderma phát tri n t t b t c pH nào nh h n 7 và chúng

c ng có th phát tri n t t đ t ki m n u nh đó có m t l ng l n CO2 và

bicarbonate, Trichoderma có th s d ng nhi u ngu n th c n khác nhau t

carbonhydrat, amino acid đ n ammonia

Trichoderma là vi n m a đ m, chúng đ c bi t chi m u th nh ng n i m

t, nh ng khu r ng khác nhau Trichoderma hamatum và Trichoderma pseudokoningii có th ch u đi u ki n có đ m cao h n so v i nh ng loài khác Tuy

nhiên, Trichoderma th ng không ch u đ c đ m th p và đi u này đ c cho m t

y u t góp ph n làm cho s l ng Trichoderma gi m rõ r t trong nh ng n i có đ

m th p, song các loài Trichoderma khác nhau thì yêu c u v nhi t đ và đ m

c ng khác nhau

1.3.4 C ch và kh n ng đ i kháng c a n m Trichoderma

 C ch

Theo Verma (2007), Bai (2008) và Savazzini (2009) đã cho r ng:

Trichoderma đ c xem là tác nhân ki m soát sinh h c ti m n ng và thúc đ y cây

tr ng t ng tr ng C nh tranh v i các tác nhân gây b nh, ký sinh trùng và s n xu t các h p ch t kháng n m là c ch quan tr ng nh t trong vi c ki m soát sinh h c [23]

Theo Harman (1996), n m Trichoderma có nhi u c ch đ i kháng: c ch

ký sinh lên n m b nh, c ch ti t kháng sinh, c ch c nh tranh dinh d ng và không gian s ng [8]

Theo Kredics (2003) thì quá trình đ i kháng c a n m Trichoderma v i n m

b nh ch y u b ng 2 c ch :

Th nh t: n m Trichoderma bao quanh và cu n l y n m b nh

Th hai: n m Trichoderma ti t ra các lo i enzyme th y phân

Theo Elad (2000), có nhi u c ch đ c ng d ng trong phòng tr sinh h c

c a Trichoderma đ i v i n m gây b nh, nh ng ch có 3 c ch quan tr ng là ký sinh, c nh tranh và ti t ra kháng sinh

Okigbo và Ikediugw (2000), cho bi t nh ng loài Trichoderma có h s i n m

nh , m nh là m t nhân t có tri n v ng trong phòng tr sinh h c ch ng b nh th i

h t, th i r và qu n lý b nh h i sau thu ho ch

Theo Hardar và c ng s (1984) thì n m Trichoderma đ c s d ng r ng rãi trong phòng tr sinh h c đ qu n lý b nh h i do R.solani gây ra

Klein và Eveleigh (1998) l i cho r ng n m Trichoderma t n công tr c ti p

b ng cách cu n quanh và ti t ra enzym phân h y chitin c a n m gây h i thành

nh ng phân t nh d h p thu, đ ng th i giúp cây tr ng kháng l i b nh

N m Trichoderma s ng r cây giúp bi n đ i v t ch t vô c , giúp t ng c ng

kh n ng s n xu t hormon cây tr ng, làm t ng kh n ng kháng b nh c a cây

tr ng

Bailey và Lumsden (1998) cho r ng khi dùng d ch huy n phù n m

Trichoderma hazianum vào trong đ t làm t ng s n y m m, t ng kh n ng ra hoa,

t ng sinh kh i và chi u cao cây b p, t, hoa cúc, cà chua, thu c lá Loài T1290 c a

n m Trichoderma hazianum còn làm t ng s ch i và r cây b p ng t trong nhà l i

66 % so v i đ i ch ng

M t s lo i enzym do Trichoderma ti t ra bao g m glucan 1,3-beta-

glucosidase, endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl-beta-D-glucosaminidase (NAGase), trypsin, chymotrypsin, cellulase, protease, lipase, khi k t h p hai enzyme glucan 1,3-beta-glucosidase và endochitinase s ng n c n đ c quá trình

t ng tr ng c a nhi u lo i Ascomycetes trong nuôi c y, thêm vào đó s có hi u qu

cao trong vi c ng n c n s n y m m c a bào t h n là t ng lo i enzyme đ n l

Ph m V n Kim (2000) cho r ng Trichoderma ký sinh lên s i n m R solani

và làm ch t s i n m là do tác d ng c a enzyme ngo i bào làm phá h y màng t bào

Cook và Baker (1983) cho bi t n m Trichoderm phân b trên nhi u lo i đ t

khác nhau và chúng ký sinh trên nhi u lo i n m gây h i cây tr ng nh : Armillaria mellea, Pythium spp., Phytophthora spp., Rhizoctonia solani, Chondrostereum purpureum, Sclerotium rolfsii và Heterobasidion annosum

Cruz và c ng s (1995) cho r ng trong ho t đ ng s ng ký sinh c a n m

Trichoderma thì enzyme th y phân chitinase và -glucanase đóng vai trò r t quan

tr ng T i 2003, Muhammad và Amusa cho r ng, n m Trichoderma hazianum có

kh n ng s n xu t enzyme phân h y vách t bào nh chitinase, -1-3-glucanase đây

là 2 lo i enzyme quan tr ng trong quá trình ký sinh lên n m gây h i Theo Marco

(2002) và Kredics và c ng s (2003) thì nh ng ch t do n m Trichoderma ti t ra bao

g m: endochitinase, chitobiosidase, N-acetyl- -D-glucusaminidase (NADase), trypsin, chymotrypsin, glucan 1,3- -glucosida, cellulase, protease, lypase

Marco và c ng s (2002) cho r ng kh n ng ti t enzym c a Trichoderma còn

ch u nh h ng c a đ y m khí, l ng oxy hòa tan, t c đ l c…

M t v n đ quan tr ng trong s hình thành c ch đ i kháng đ c trình bày nhi u báo cáo là: tùy thu c vào dòng vi sinh v t đ i kháng, ngu n g c c a chúng và

đi u ki n môi tr ng, vì th khi ch n m t tác nhân sinh h c nên quan tâm đ n

n m gây b nh th c v t Các nhà nghiên c u đã s d ng nhi u lo i Trichoderma

khác nhau đ ki m soát nhi u lo i n m gây b nh khác nhau [33]

Hi n nay các ch ng Trichoderma đã đ c s d ng r ng rãi trong các ch

ph m sinh h c th ng m i nh : GlioGard – m t ch ph m v i thành ph n chính là

Trichoderma virens ng n ch n s ch t c a cây con R t nhi u gi ng Trichoderma

có kh n ng ki m soát t t c các loài n m gây b nh khác Tuy nhiên, m t s gi ng

th ng có hi u qu h n nh ng gi ng khác trên m t s b nh nh t đ nh [33]

Nhi u k t qu nghiên c u cho th y, n m Trichoderma gi t nhi u lo i n m gây

th i r ch y u nh : Pythium, Rhizoctonia và Fusarium Quá trình này g i là kí sinh

n m Trichoderma ti t ra m t enzyme làm tan vách t bào c a các loài n m khác

Sau đó nó t n công vào bên trong loài n m gây h i đó và di t chúng [33]

Nh ng phát hi n m i hi n nay cho th y r ng m t s gi ng có kh n ng ho t hóa c ch t b o v c a th c v t, t đó nh ng gi ng này c ng có kh n ng ki m soát nh ng b nh do các tác nhân khác ngoài n m [33]

 C i thi n n ng su t cây tr ng

C ng nh thu c tr sâu, phân bón hóa h c lâu ngày s làm cho đ t canh tác b thoái hóa; các lo i giun đ t không phát tri n đ c, làm h n ch đ x p, đ ng th i

đ thông khí c n thi t cho r cây c ng thi u h t Vì v y các n c có n n nông nghi p phát tri n trên th gi i có xu h ng s d ng các phân bón h u c sinh h c

th h m i, th c ch t là m t s k t h p gi a phân bón vi sinh và thu c tr sâu sinh

h c, d a trên c s đ u tranh sinh h c Các lo i phân bón h u c vi sinh này có các tác d ng [33]:

Phòng tr các n m gây b nh th i m c, b nh héo r , b nh n m s ng mai,

b nh đ m nâu và h n ch các tác h i nguy hi m các n m gây m c g nh kh n ng

b t ho t enzyme c a các n m gây b nh, đ ng th i b o v cây tr ng kh i các côn trùng đ c phá thân

y m nh t c đ t ng tr ng c a cây tr ng nh kh n ng giúp cây tr ng t o ra

h r c ng cáp h n G n đây, khi kh o sát các loài Trichoderma các l p đ t sâu,

ng i ta còn th y Trichoderma làm t ng s l ng các r n m sâu trong đ t i u này góp ph n giúp cho các cây l ng th c nh ngô có kh n ng ch ng ch u t t v i

h n hán

Vài loài Trichoderma có kh n ng kích thích s n y m m và s ra hoa ã có nhi u công trình nghiên c u khoa h c ch ng minh r ng Trichoderma harzianum và Trichoderma koningii kích thích s n y m m và t ng tr ng c a cây i v i các

cây hoa tr ng trong nhà kính, Trichoderma harzianum đ y nhanh s ra hoa b ng cách rút ng n ngày ra hoa hay t ng s l ng hoa

C i thi n c u trúc và thành ph n c a đ t, đ y m nh s phát tri n c a vi sinh

v t n t s n c đ nh nit trong đ t, duy trì s cân b ng c a các vi sinh v t h u ích trong đ t, b o toàn và t ng đ phì nhiêu, dinh d ng cho cây tr ng

Phân gi i t t cellulose có trong phân h u c và đ t tr ng nên t ng c ng dinh d ng và kích thích t ng tr ng c a cây

T ng s c đ kháng c a cây tr ng, m t s ch ng nh Trichoderma harzianum

còn có th xâm nh p vào mô bào cây, làm t ng tính ch ng ch u b nh c a cây tr ng

Nhìn chung, các ch ng Trichoderma trong các ch ph m phân h u c vi sinh

không nh ng cung c p m t ngu n phân bón an toàn, hi u qu mà còn giúp ki m

ch các b nh h i cây tr ng và phòng b nh lâu dài trong t nhiên

 Trong x lý môi tr ng

M t s ch ng Trichoderma có kh n ng phân h y ho c x lý các ch t gây

đ c h i và ô nhi m môi tr ng Ch ng h n, Trichoderma harzianum có kh n ng

phân h y các ch t gây ô nhi m trong đ t r ng; làm gi m s t p trung c a các h p

ch t t do 2,4,6 – trichlorophenol; 4,5 – dichloroguaiacol trong môi tr ng ch a

mu i khoáng; phân gi i 60 % thu c di t c Duirion trong đ t trong 24h…hay

Trichoderma reesei RUT – 30 đ c nghiên c u đ x lý rác th i đô th , h a h n

m t ngu n s n xu t enzyme cellulose r ti n, đ ng th i gi m l ng rác th i, cellulose thu đ c t đây đ c đánh giá là t t h n và kinh t h n so v i cellulose

đ c l y t các ngu n c ch t cellulose tinh ch [33]

 Ch t ki m soát sinh h c

Hi n nay, Trichoderma đã đ c s d ng m t cách h p pháp trong vi c ki m soát b nh trên th c v t Các ch ph m n m Trichoderma đ c s n xu t và s d ng

nh là ch t ki m soát sinh h c m t cách có hi u qu ; có th s d ng riêng bi t ho c

ph i tr n v i phân h u c đ bón cho cây tr ng, v a cung c p dinh d ng cho cây,

v a t ng kh n ng kháng b nh c a cây [33]

Ngu n gen đ s d ng trong chuy n gen

Nhi u vi sinh v t ki m soát sinh h c đ u có ch a m t s l ng l n gen mã hóa các s n ph m có ho t tính c n thi t s d ng trong ki m soát sinh h c Nhi u

gen có ngu n g c t Trichoderma đã đ c t o dòng và có ti m n ng ng d ng r t

l n trong chuy n gen đ t o ra cây có kh n ng kháng đ c nhi u b nh, tuy ch a có gen nào đ c th ng m i hóa nh ng có m t s gen đã đ c nghiên c u và phát tri n i u này đã m ra m t h ng đi m i trong công tác b o v mùa màng, s n

xu t các cây l ng th c an toàn và g n g i v i thiên nhiên, t o ra các cây chuy n gen có kh n ng ch ng ch u t t [33]

Ngoài ra, Trichoderma còn đ c ng d ng trong nhi u l nh v c khác nh

s n xu t nhi u enzyme ngo i bào, th ng m i hóa trong vi c s n xu t các cellulose

và các enzyme khác phân h y các polysaccharide ph c t p… các enzyme này đ c

s d ng r t nhi u trong công nghi p d t [33]

1.4 Vi khu n Bacillus

T Bacillus nh m miêu t hình dáng c a m t nhóm vi khu n đ c quan sát

d i kính hi n vi Nó xu t phát t ti ng Latin có ngh a hình que Do đó m t s n i

g i là khu n que ho c tr c khu n [6, 9, 32]

Theo khóa phân lo i c a Bergey (1979), Bacillus đ c phân lo i nh sau:

Chi Bacillus là m t chi l n (51 loài đã đ c xác đ nh chính xác và nhi u loài

khác ch a đ c phân lo i rõ ràng) và đa d ng, có m t r ng rãi trong t nhiên, đ c

bi t trong đ t, không khí, n c, trên c th th c v t và đ ng v t, b i c khô và r m

r , thu c h Bacillaceae H này chia làm 5 chi, g m: Bacillus, Sporolactobacillus, Clostridium, Sporosarcina, Desulfotomaculum c đi m chung c a h này Gram

d ng, hi u khí, đ c bi t là s hình thành n i bào t , đây là m t c u trúc không sinh

tr ng đ c t o ra bên trong t bào vi khu n và là chi n l c đ s ng sót trong môi

tr ng đ t N i bào t đ c mô t đ u tiên b i Cohn khi nghiên c u v B subtilis

và sau đó là Koch trong các nghiên c u v các loài gây b nh nh B anthracis vào

n m 1976 S t o thành n i bào t sau đó đ c ch p nh n nh là m t đ c tính c n

b n đ phân lo i và xác đ nh các thành viên c a chi [6, 9, 32]

Vi c phân lo i Bacillus ban đ u d a trên hai đ c đi m là s phát tri n trong

đi u ki n hi u khí và s hình thành n i bào t , k t qu là đã x p nhi u vi khu n có

nh ng đ c đi m sinh lý và đ c tính khác nhau Do đó, tính không đ ng nh t v sinh

lý h c, sinh thái h c, di truy n h c làm cho vi c phân lo i chi Bacillus khó kh n [6,

9, 32]

Bacillus có kh n ng ch u đ ng và t n t i trong m t th i gian dài trong đi u

ki n b t l i, nên đa s chúng r t ph bi n và có th phân l p đ c t nhi u ngu n Trong đ t, Bacillus ch đ ng trao đ i ch t khi có s n các c ch t thích h p cho s

t ng tr ng c a nó có s n, và nó t o bào t khi ngu n dinh d ng c n ki t ây

c ng là chi n l c sinh t n c a vi sinh v t s ng trong môi tr ng đ t Vì đa s các

loài Bacillus có th phân gi i hi u qu các lo i cao phân t sinh h c (proteins, tinh

b t, pectin ), nên chúng đóng m t vai trò quan tr ng trong vòng tu n hoàn sinh h c

c a carbon và nit [6, 9, 32]

1.4.1 Hình d ng và kích th c

Bacillus thu c nhóm tr c khu n, Gram d ng, sinh bào t , t bào sinh d ng

Bacillus th ng, có đ u tròn hay vuông, kích th c t 0,5 – 1,2 x 2,5 – 10 m,

d ng đ n l hay chu i ng n ho c dài i v i Bacillus có n i bào t thì bào t hình

tr , oval, tròn, th nh tho ng có hình b u d c Chi u ngang bào t nh h n chi u ngang t bào vi khu n, tùy theo loài, bào t có th n m gi a, g n cu i ho c

cu i, và túi bào t ph ng ho c không ph ng Do đó khi có bào t , t bào vi khu n không b thay đ i hình d ng Bacillus thu c loài hi u khí hay k khí tùy nghi [6,

32]

T bào c a Bacillus d ng hình que th ng ho c g n th ng, kích th c (0,3 –

2,2) x (1,2 – 7,0) µm Tr B anthracis và B mycoides, h u h t các loài Bacillus đ u

di đ ng, roi đi n hình n m hai bên Hình thành bào t ch u nhi t, ch có m t bào t trong m t t bào S hình thành bào t không b ng n c n b i ti p xúc v i không khí Gram d ng ho c ch cho Gram d ng giai đo n đ u c a s phát tri n Trao

đ i ch t ki u hô h p nghiêm ng t ho c c hô h p và lên men đ ng th i, đòi h i nhi u thành ph n H u h t cho catalase d ng tính [6, 32]

1.4.2 Dinh d ng và t ng tr ng

Ph n l n các loài Bacillus là sinh v t hóa d d ng linh ho t, có kh n ng hô

h p trong khi s d ng nhi u h p ch t h u c đ n gi n (đ ng, amino acid, acid h u

c ), các chi Bacillus phát tri n t t trên các môi tr ng dinh d ng th ng m i g m các thành ph n c b n nh : pepton, cao th t, glucose, lactose, ch t khoáng,…., m c

dù trong m t s tr ng h p đ c bi t, các môi tr ng này c n đ c đi u ch nh pH

ho c n ng đ mu i (pH t 2 – 11, và n ng đ mu i t d i 2 – 25 %) [32] Trong môi tr ng nuôi c y l ng chúng t o váng trên b m t Trên môi tr ng

th ch t o khu n l c to, tròn hay hình d ng b t th ng, có màu xám ng vàng nh t,

b m t khóm s n sùi, h i nh n ho c t o màng m n lan trên b m t th ch [32]

Hình d ng khu n l c thay đ i tùy theo đ tu i, và các đ a nuôi c y riêng l có

th t o ra các d ng khu n l c khác nhau [32]

H u h t các loài Bacillus c n m t môi tr ng đ c bi t đ có th t o bào t S

t o bào t đ c c m ng sau pha t ng tr ng hàm m do n ng đ dinh d ng b

c n ki t, đ c bi t là vi c thi u ngu n carbon, nitrogen, ho c phospho Có th s

d ng môi tr ng nhân t o đ c m ng t o bào t nh Difico sporulation agar [32]

Ph n l n chúng là vi sinh v t a nhi t trung bình, kho ng nhi t đ t i đa cho

s phát tri n c a t bào dinh d ng t 25ºC – 75ºC, nhi t đ t i u là 30o

– 45oC; kho ng pH r ng 2 – 11 Trong phòng thí nghi m, v i đi u ki n t i u, th i gian th

h c a Bacillus vào kho ng 25 phút [32]

1.4.3 Sinh s n

Các loài Bacillus sinh s n b ng hình th c nhân đôi t bào Khi t bào tr ng

thành, th nhân s t p trung gi a t bào và phân chia tr c ti p theo c p s nhân [32]

1.4.4 Ch t kháng n m do Bacillus ti t ra

Loài Bacillus nói chung đ u có kh n ng kháng các tác nhân gây b nh khác

(kháng vi khu n, n m, virus) nh vào vi c hình thành bào t hay ti t các ch t kháng [9]

Vi khu n c a chi Bacillus có th ti t ra kháng sinh gi ng v i enzym c a nh ng

lo i n m m c ch ng h n nh chitinase, cellulases, amylases, glucanses,… Nh vào

c u trúc n đ nh mà nh ng chu i peptide có ho t tính kháng n m do Bacillus ti t ra cho th y hi u qu tích c c trong vi c kháng vi khu n Gram d ng, vi khu n Gram

âm, n m s i và c n m m c [9]

Xiao và c ng s (2009) cho r ng: nhi u ch ng Bacillus có th s n xu t m t

l ng l n enzymes chitinolytic H n n a, nhi u nghiên c u đã ch ra r ng chitinase tham gia

Hình1.3 Khu n l c và hình nhu m Gram Bacillus

CH NG 2: V T LI U VÀ

2.1 Th i gian và đ a đi m nghiên c u

Nghiên c u đ c th c hi n trong th i gian t tháng 11/2013 đ n tháng 5/2014

t i phòng thí nghi m Công ngh vi sinh c a tr ng i H c M TP HCM , c s 3

t i Bình D ng

2.2 V t li u

- Ch ng n m Pythium và Fusarium phân l p t 10 m u (thân, r , lá, đ t) t cây

tiêu b b nh đ c l y t huy n Ch Sê, t nh Gia Lai

- Ch ng Bacillus: s d ng 15 ch ng Bacillus do phòng thí nghi m Công ngh

vi sinh tr ng i H c M Tp HCM cung c p Các ch ng Bacillus s d ng: BD68,

M t s d ng c thí nghi m khác: đ a petri, ng nghi m, pipette, micropipette, đèn c n, que c y, que trãi, erlen, bercher, lame, lamell, ng ly tâm 15ml, bình schot

2.4 Hóa ch t, thu c nhu m

Hóa ch t: c n 96o, c n 70o, NaCl 0,85 %, kháng sinh cloramphenocol, NaOH 2M, HCl 2M

Thu c nhu m : lactophenol, crystal violet, safranin O

 Thu nh n m u b nh ph m t cây h tiêu b b nh (thân, r , lá), đem r a

s ch mô b nh b ng n c Sau đó ti n hành kh trùng b m t m u qua các b c: r a nhanh mô b nh b ng ethanol 70 %, nhúng mô b nh vào dung d ch natri hypochlorite 1 % trong ethanol 10 % kho ng 1-5 phút, r a l i mô b nh v i n c

c t [1]

 i v i m u đ t : ti n hành l y m u sau đó đ ng nh t m u( cân 10g m u pha vào 90 ml NaCl 0,85 %) Pha loãng m u n ng đ 10-1

C t nh mô b nh 2 x 2 mm, sau đó đ t lên môi tr ng Potato Dextrose Agar (PDA), có b sung kháng sinh cloramphenicol 0,05 % nhi t đ 27 ± 20

C trong 3 ngày.[1]

 i v i m u đ t sau khi đã pha loãng các n ng đ ti n hành c y trang trên môi tr ng PDA có b sung kháng sinh cloramphenicol 0,05 %

 C y đ n bào t ho c c y đ nh s i n m t các t n n m m c lên l n phân

l p đ u tiên lên môi tr ng PDA cho đ n khi thu đ c nh ng khu n l c có đ đ ng

đ u v hình d ng và màu s c

 C y gi gi ng trên môi tr ng PDA ho c môi tr ng SDA

 Ph ng pháp nh n di n hình thái vi sinh v t h c:

 Quan sát đ i th : b ng m t th ng hay kính lúp c m tay đ nh n xét v kích

th c, màu s c, đ c đi m c a khu n l c n m m c

 Quan sát vi th : làm tiêu b n nhu m lactophenol n m m c r i quan sát d i kính hi n vi v t kính 10X, 40X đ nh n xét v bào t , khu n ty [4]

2.6.2 Xác đ nh m t s ho t tính kích thích t ng tr ng cây tr ng c a các

ch ng Bacillus

 nh tính kh n ng c đ nh đ m c a các ch ng Bacillus:

 Nguyên t c: nh ng ch ng vi khu n có kh n ng c đ nh đ m s sinh tr ng

đ c trong các môi tr ng vô đ m (môi tr ng Ashby, môi tr ng Jensen…) Khi cho dung d ch có (NH4+) s k t h p v i thu c th Nessler s t o ra iodur thu ngân ammonium có màu vàng D a vào tính ch t này đ nh n bi t vi khu n c đ nh nit

[4]

 Ti n hành xác đ nh kh n ng c đ nh nit phân t trên đ a môi tr ng Ashby Nh ng ch ng vi khu n có kh n ng c đ nh nit phân t s t ng tr ng trên môi tr ng vô đ m này [4]

 nh tính kh n ng phân gi i lân c a các ch ng Bacillus:

 Nguyên t c: các vi sinh v t ti t ra các acid h u c , các acid này tác d ng lên apatit đ cho ra dibasic phosphate và monobasic phosphate là các d ng P vô c d

tan Chung quanh các khu n l c c a vi khu n k trên s có qu ng trong là n i mà P khó tan b chuy n thành P d tan và đ c vi sinh v t h p thu m t ph n Vi sinh v t

có kh n ng hòa tan lân s chuy n hóa P t d ng không tan sang d ng tan hòa l n trong môi tr ng D a vào ph n ng c a P tan v i thu c th t o dung d ch có màu

mà ta bi t đ c n ng đ P tan trong dung d ch và đánh giá đ c kh n ng hòa tan lân c a vi sinh v t [5]

 Ti n hành xác đ nh ho t tính hòa tan lân trên môi tr ng Pikovskaya b ng

ph ng pháp c y đi m 370C C sau 24h đ c k t qu c k t qu đ n 5-7 ngày Khu n l c có kh n ng hòa tan là nh ng khu n l c có vòng phân gi i quanh khu n l c trên môi tr ng Pikovskaya [4, 13, 20]

 nh tính kh n ng sinh IAA c a các ch ng Bacillus:

Hút d ch khu n cho vào ng nghi m và cho thu c th Salkowski R2 H2SO4) IAA đ c t ng h p t vi khu n, khi tác d ng v i thu c th s t o ra ph c

(FeCl3-h p có màu (FeCl3-h ng n(FeCl3-h t đ n đ m tùy theo n ng đ IAA N ng đ IAA t o ra đ c xác đ nh theo mô t c a Glickmann và c ng s (1994) và Gordon evà c ng s (1950)

2.6.3 Kh o sát kh n ng đ i kháng n m b nh Pythium và Fusarium c a các

ch ng Bacillus

 nh tính kh n ng kháng n m Pythium sp.và Fusarium sp c a các ch ng Bacillus

 Chu n b d ch khu n Bacillus

Ch ng vi khu n đ c c y ria trên môi tr ng th ch NA Sau đó vi khu n đ c pha v i n c mu i sinh lí 0,85 % đ đ t đ c m t đ 1 – 2 x 108 CFU / mL (đo OD

b c sóng 625 nm, đi u ch nh sao cho đ t trong kho ng 0,08 – 0,1 t ng ng v i

m t đ vi khu n là 1 – 2 x 108

CFU / mL)

 Chu n b d ch n m